CN105505821A - 假单胞菌(Pseudomonas protegens)S63及其在防治水葫芦中的应用 - Google Patents
假单胞菌(Pseudomonas protegens)S63及其在防治水葫芦中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了假单胞菌(Pseudomonas?protegens)S63及其在防治水葫芦中的应用。本发明的假单胞菌(Pseudomonas?protegens)S63对水葫芦具有选择性致病性,同时对富营养化水体亦具有较好的净化效果,对水葫芦的防治可取到标本兼治的功效,为水葫芦的生物防治提供了一种新的思路和方法,具有推广应用的价值。
Description
技术领域:
本发明属于生物防治领域,具体涉及假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63及其在防治水葫芦中的应用。
背景技术:
水葫芦又名凤眼莲,英文俗名为Waterhyacindk,学名[Eichhorniacrassioes(Mart.)Solms.],属单子叶植物纲(Monocotyledoneae)百合目(Liliflorae)雨久花科(Pontederiaceae)凤眼兰属。水葫芦原产南美洲,具有耐碱性、耐肥、抗污染力强、天敌少、抗病力强、入侵能力强等生长特性。广泛分布于河流、湖泊和水塘中,覆盖水面,堵塞河道,影响航运及水上作业;同时,降低阳光对水体的穿透力,影响水底生物生长,并增加水体二氧化碳浓度,影响水产品的产量和质量,并对当地居民饮水、健康造成威胁。2003年我国环保局将水葫芦列为首批最危险的16种外来入侵物种之一。
国内外开展与水葫芦的斗争已经长达数十年之久,目前主要以打捞和化学药剂处理为主。我国各地面对泛滥成灾的水葫芦主要还是采用人工和机械方式进行打捞,不但耗费了大量的人力、物力,而且在水葫芦爆发期还会出现打捞速度跟不上繁殖速度的现象。国际上也有用除草剂来控制水葫芦的。目前,研究和应用较多的化学除草剂有2,4-D、敌草快、百草枯和农达等。这些化学除草剂防除水葫芦见效快,但很多国家并没有接受这种治理方法。首先,成本太高,对一些经济欠发达的国家来说是不适用的。其次,对水体生态环境破坏性大。此外,由于水葫芦繁殖速度快,一旦有新的来源又会快速生长,所以控制效果不能够持久。
近年来,利用植物病害菌防治水葫芦的生物防治的方法成为水葫芦治理的一个热点研究领域,生物防治法具有成本低、效果长效和对环境友好等优点。但水葫芦病原菌大部分都为致病真菌,很少有关于水葫芦致病细菌的研究报道。此外,研究表明水体的富营养化是导致水葫芦迅速繁殖的主要原因,消除水体富营养化是防治水葫芦的根本措施。因此既能抑制水葫芦生长又能降解水体氨氮等污染物的微生物及其代谢物对水葫芦泛滥具有标本兼治的防治作用。
发明内容:
本发明的第一个目的是提供一种对水葫芦具有良好的生物防治效果的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63,该菌于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其保藏编号为:CGMCCNo.11661。
本发明的第二个目的是提供了假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63在防治水葫芦中的应用。
所述的应用优选是在制备防治水葫芦制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种防治水葫芦制剂,其特征在于,含有有效量的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63作为活性成分。
本发明的第四个目的是提供假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63在净化富营养化水体中的应用。
所述的应用优选是在制备净化富营养化水体制剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种净化富营养化水体制剂,其特征在于,含有有效量的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63作为活性成分。
本发明的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63经初步研究表明对水葫芦具有选择性致病性,同时对富营养化水体亦具有较好的净化效果,对水葫芦的防治可取到标本兼治的功效,为水葫芦的生物防治提供了一种新的思路和方法,具有推广应用的价值。
PseudomonasprotegensS63于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其保藏编号为:CGMCCNo.11661。
附图说明:
图1是对照组和实验组叶片中的超氧化物歧化酶、丙二醛和过氧化氢酶的酶活;
图2是实验组和对照组在112小时内的氨氮和COD的降解曲线。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:
(1)菌株筛选
取水葫芦病株的叶片,用次氯酸溶液擦洗,无菌水冲洗三遍,研磨,取汁,涂布于水葫芦琼脂平板培养基上。从水葫芦病株所处的水体中,取1mL水样涂布在水葫芦琼脂平板培养基上,28℃培养箱培养2-4d。挑取单菌落,并进行菌株纯化,将纯化后的菌株,保存在PDA斜面。
将纯化菌株点种于氨氮平板培养基上,28℃培养2-4d,挑取保存产生透明圈的菌株。
取正常生长的水葫芦植株,用70%酒精反复擦洗其茎部表面,无菌水冲洗数次,剪取约5cm长的小段,置于垫有无菌滤纸的培养皿中,加入少许无菌水,以保持一定的湿度,将初筛获得的纯化菌株接种于水葫芦茎处,置室温培养,选取能致水葫芦茎部出现黑斑的菌株。将上述筛选获得的菌株接入发酵培养基中,28℃培养2-4d,按0.5%-2.5%比例吸取菌液加入到改良霍格兰氏营养液中,再在其中移入生长正常的水葫芦植株,同时以不添加菌液作为空白对照,均设立三组平行对照。于25℃光照培养箱中培养15-20d,记录观察结果。选取对水葫芦生长具有最强抑制效果的菌株,命名为菌株S63。
所用培养基:
水葫芦琼脂平板培养基:水葫芦茎40-60g,加少许水磨碎取汁,加琼脂20g,用自来水定容到1000ml,灭菌备用。
PDA培养基:马铃薯100g,葡萄糖10g,琼脂2g,蒸馏水1000ml,灭菌备用。
氨氮平板培养基:柠檬酸三钠3g,NH4H2PO40.4g,KH2PO41g,NaCl3g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,pH7.2-7.4,灭菌备用。
发酵培养基:蛋白胨0.5g,酵母膏1.5g,葡萄糖5g,脲0.2克,硫酸镁0.1克,K2HPO40.1g,NaCl0.5g,自来水1000ml,pH7.2,灭菌备用。
改良霍格兰氏营养液配方:四水硝酸钙945mg/L,硝酸钾506mg/L,硝酸铵80mg/L,磷酸二氢钾136mg/L,硫酸镁493mg/L,铁盐溶液2.5ml/L,微量元素液5ml/L,pH=6.0,溶剂为水。
铁盐溶液配方:七水硫酸亚铁2.78g,乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na)3.73g,蒸馏水500ml,pH=5.5。
微量元素液配方:碘化钾0.83mg/l,硼酸6.2mg/L,硫酸锰22.3mg/L,硫酸锌8.6mg/L,钼酸钠0.25mg/L,硫酸铜0.025mg/L,氯化钴0.025mg/L,溶剂为水。
(2)菌株鉴定
将培养3d的菌株S63接种到40mLLB培养液的三角瓶(100mL)中,于35℃、160r/min,恒温振荡培养48h后制成菌体悬浮液,离心收集菌体,采用CTAB/NaCl法提取菌株基因组DNA。采用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增后的DNA产物送至上海生工生物有限公司进行纯化测序,其16SrRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用BLAST软件与NCBI的GenBank数据库收录的的16SrRNA序列进行比对,结果表明菌株S63与PseudomonasprotegensstrainAzi15的同源性最高,相似性达99%。确定S63属于假单胞菌,命名为假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63,该菌于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其保藏编号为:CGMCCNo.11661。
实施例2本发明中的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63对水葫芦致病性的试验
将假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63接种于发酵培养基(同实施例1)中,于30℃、培养48h后制成假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液。
(1)水葫芦自然生态培养模拟实验。
将生长正常的水葫芦幼株10株移栽于8L添加0.2-2.5%(体积占比)假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液的改良霍格兰氏营养液中,同时以不添加菌液作为空白对照,均设立三组平行对照。露天培养,观察和记录水葫芦生长情况。培养数天后,栽培于含假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63生长液中的水葫芦均出现不同程度的枯萎,叶片出现病态,而对照组生长正常。
水葫芦病情分级标准]如下:
0级叶片上无任何病斑;
1级叶片上少数病斑,总面积小于三分之一;
2级叶片上病斑总面积大于三分之一,小于三分之二;
3级叶片上病斑面积大于三分之二;
4级叶片全部枯萎。
水葫芦叶片的发病率和病情指数分别按以下公式计算:
发病率(100%)=染病叶片数/总叶片数×100
叶片病情指数=〔Σ(发病级别×该级的叶片数)/(总叶片数×4)〕×100%
重复上述实验十一批次。实验结果表明,模拟自然生态培养的水葫芦,加入假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液的实验组水葫芦发病率为41.1%-100%,病情指数为30.9%-96.4%。不加菌的对照组发病率19.4%-33.3%,病情指数为7.4%-20.2%。
(2)酶的分析
植物处于逆境条件下会引起一系列生理生化变化,使植物产生应激反应。病原菌侵染后,植物体内迅速发生氧迸发,产生大量活性氧,高浓度的活性氧对植物自身细胞有害,因此植物体内存在清除活性氧的保护酶系,包括过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等。
丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一,具有很强的毒性,它会严重损伤生物膜的结构与功能,其积累是自由基毒害作用的表现,其含量高低也就成了反应膜脂过氧化强弱的重要指标。因此丙二醛含量可反映植物遭受逆境伤害的程度,加入假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液后水葫芦叶片中的丙二醛含量显著高于对照,说明假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液对叶片的细胞膜产生了较强的毒害作用。从而导致水葫芦叶片失绿与细胞死亡,抑制了水葫芦植株的生长。超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内清除超氧阴离子自由基的关键酶之一,它能将O- 2歧化为H2O2.。植物SOD酶的活性常与其抗氧化胁迫的能力正相关。过氧化物酶(POD)是植物体内担负清除H2O2的主要酶类,它可把H2O2转化为H2O。过氧化氢酶(CAT)能够清除植物体内过多的过氧化氢,从而减少其对细胞的过氧化伤害,是植物中极为重要的逆境生理酶。
测定步骤(1)中的加入假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液后,水葫芦叶片(实验组)中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶的活性,与步骤(1)中未加假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液的处理作为对照(图1中的CK)。具体结果如图1所示,从图1可以看出,加入假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液后水葫芦叶片(图1中的S63)的SOD、POD、CAT酶的活性均显著提高。
实施例3本发明中的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63对富营养化水体的净化试验
将假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63接种于发酵培养基(同实施例1)中,于30℃、160r/min,培养48h后制成假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液。
取富营养化水体1000mL分装于2000mL烧杯中。按1:10000的体积比例接入本发明中的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液,以不添加菌液为空白对照组(图2中的CK),均设立三个平行组,28℃培养。采用间歇曝气(即曝气12h,停止曝气12h)。3d后取样测定水体中氨氮和COD的含量。图2为实验组(图2中的S63)和对照组(图2中的CK)在112小时内的氨氮和COD的降解曲线,与不添加菌液相比,添加假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液的实验组,在72小时对氨氮和COD的降解率分别为62.5%和72.4%,假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63对富营养化水体的净化效果显著。
实施例4本发明中的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63的生物安全性的初步试验
将假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63接种于发酵培养基(同实施例1)中,于30℃、160rpm培养48h后制成假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液。
分别取生长正常的碗莲、水竹和红松尾植株,栽培于改良霍格兰氏营养液中,按体积比0.5%接种量加入假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液,以不添加菌液为空白对照组,均设立五个平行组。观察和记录植株生长情况。20d内,植株均生长正常,未见明显异常。
取正常栽培生长的青椒幼苗,每日在其根部滴加假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63菌液5ml,连续加入三天,对照组为浇自来水,均设立五个平行组。观察和记录植株生长情况。15d内,植株均生长正常,未见明显异常。
Claims (7)
1.假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63,其保藏编号为:CGMCCNo.11661。
2.权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63在防治水葫芦中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63在制备防治水葫芦制剂中的应用。
4.一种防治水葫芦制剂,其特征在于,含有有效量的权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63作为活性成分。
5.权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63在净化富营养化水体中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63在制备净化富营养化体制剂中的应用。
7.一种净化富营养化水体制剂,其特征在于,含有有效量的权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonasprotegens)S63作为活性成分。
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