CN108483675A

CN108483675A - 固定化净水剂的制备方法及其用于处理水生草本植物的用途

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Publication number: CN108483675A
Application number: CN201810412726.4A
Authority: CN
Inventors: 杨敏杰; 卢珍晶; 沈华平; 李震宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2018-09-04

Abstract

本发明涉及一种固定化净水剂的制备方法，将固定化载体和复合微生物菌剂按照1:（6‑7）的体积比混合，在28‑30℃条件下，搅拌培养36‑48h，所述复合微生物菌剂由不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌组成。本发明方法制备的净水剂能够显著降低富营养水体COD值，并抑制水葫芦大量生长，具有推广价值，应用前景广阔。

Description

固定化净水剂的制备方法及其用于处理水生草本植物的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种固定化净水剂的制备方法及其用于处理水生草本植物的用途。

背景技术

水葫芦(Eichhornia crassipes Solms)为雨久花科凤眼莲属多年生水生草本植物，又名凤眼莲、假水仙、洋水仙等，原产南美，20世纪30年代传入我国， 60～70年代作为畜禽饲料推广。水葫芦在气温13℃开始繁殖，气温39℃时仍能繁殖，它兼有无性和有性繁殖功能，尤以无性繁殖为主，种群恢复和扩散能力极强。水葫芦喜生于温暖、向阳和富含有机质的静水中，在适宜的条件下每5 d就能繁殖1棵新植株，每天能增加20％～30％的生物量，是世界上生长、繁殖最快的水生植物之一。

由于水葫芦强大的繁殖能力，且作为外来入侵种在我国缺乏天敌制约，导致其在我国南方水域快速蔓延，同时我国水体富营养化程度的加剧，也起了推波助澜的作用。近年来，已在我国南方多省蔓延成灾，带来极大的生态和社会危害，水葫芦甚至被称为“水上绿魔”。水葫芦的快速繁殖，会覆盖水面，造成激烈的种内竞争，导致腐烂死亡，污染水体，加剧水体富营养化程度。密集的水葫芦降低了光线对水体的穿透能力，增加水中二氧化碳的浓度，降低水中溶氧量，妨碍其他水生生物的生长而造成生态链失去平衡，对生态系统造成不可逆转的破坏。水葫芦导致生物多样性丧失、生态灾害频发，大量的水葫芦漂集于河道湖面，堵塞河道，影响航运，阻碍排灌，在汛期阻碍水流，并降低水产品产量、质量，严重影响运输业、旅游业和水产养殖业的发展。滇池、太湖、黄浦江等南方著名水体，水葫芦泛滥成灾，近年来的暖冬天气甚至造成水葫芦反季节生长。

目前在水葫芦的治理中，国内多使用人工打捞和化学制剂的方法。利用人工打捞的方法治理水葫芦消耗了大量社会财富，造成了巨大的经济损失，有关方面耗费巨资却无法根治。化学防治方法简便，效果迅速，但除草剂无法清除水葫芦种子，效果不能持久，且对水体生态系统的破坏性大，污染环境。加之水葫芦彻底腐烂速度慢，枯黄后浮在水面仍需一段时间，影响生态景观，且腐烂后增加泥沙淤积。因此该方法仍要与河塘清淤等措施相配套，才较为理想，常见的化学除草剂主要有草甘膦(Glyphosate)、草甘膦稀释100倍用喷雾器对叶面喷雾，水葫芦一般在施药后30 d又长出新叶鞘和新叶，故可在施药30 d后视新叶抽生情况采取点喷法再补喷一次。还有农达、克无踪等。然而，化学除草剂使用后容易产生新一轮的环境污染，且后果越来越严重。

不少国家对水葫芦的病原菌也进行了大量的调查研究工作，并且已经取得一定的进展：全世界已经报道了70多种侵染水葫芦的病原真菌，在南非等国家已经筛选到的诺曼尼尾孢(Cercospora rodmanii)和水葫芦链格孢(Alternaria eichhorniae)对水葫芦具有较强的抑制作用。寻求对水葫芦有强致病性和生防控制作用的病原微生物，由此进一步研制无残留、不污染环境的生物抑制剂，将不仅具有重要的商业开发应用价值，而且能安全有效地控制水葫芦的危害，以避免由此造成的巨大经济损失。

微生物作为生态系统的分解者，在养殖废水脱氮除磷的净化过程中发挥着重要作用，因此人们广泛使用微生态制剂来去除水体中的有机物、氮磷等物质，已有许多研究将多种外源有益菌以游离细胞直接投入水系统中进行原位修复。这种方式短时间内具有一定的效果，但因游离菌在水体中的不易定殖、活性不高、易随水流流失，还容易被高等生物捕食，净化效果不持续稳定。为了提高微生物的作用效果，细胞固定化技术被引入微生物水质净化的研究中。固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域，并使其保持活性，反复利用的方法。固定化微生物可以克服游离菌不利的因素，提高水质净化效果。而且固定化微生物产污泥量少，固液分离效果好，不易产生二次污染，目前，固定化微生物技术已被广泛用于水处理领域，并取得显著效果。

目前为了提高防治浮游草本的效率，人们通常采用多种菌株进行复配，复配使用不仅可以发挥杀菌抑菌速度快、防治效果稳定的优势，同时还具有保持生防微生物在植物根、叶周围的定殖和分泌抗生素等特点。如何选用合适的菌株进行了复配，并且达到优势互补、用量减少、防效增强的目的，是需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种固定化净水剂的制备方法及其用于处理水生草本植物的用途。

为实现本发明目的，本申请采用如下技术方案：

一种固定化净水剂，其包括复合微生物菌剂和固定化载体。

所述复合微生物菌剂由异养硝化菌-不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌组成。

所述复合微生物菌剂的制备方法为：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×10⁷个/ml的菌液，然后按照3-4:1-2:2-3的体积比混合，即得；

所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；

所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；

所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633

所述固定化载体为由陶粒、沸石按照1:1重量比组成；

陶粒是以粘土为主要生产原料，掺合一定比例的粘合剂、成孔剂、无机骨料经配料、搪粒成球、高温烧制、筛分等一系列工艺加工而成的类球粒状材料，表面粗糙，呈深褐色或灰褐色，颗粒粒径为 0.5~2cm。陶粒的物理微观结构为粗糙多微孔，其密度适中、强度高、耐摩擦、物化性能稳定、比表面积大，不向水体释放有毒有害物，目前已广泛应用污水深度处理方面。

沸石有吸附到固体物质表面,或其他细胞表面的能力, 使用具有高度吸附能力的沸石可以将细胞吸附到表面上使之固定化。

将固定化载体和复合微生物菌剂按照1:6-7的体积比混合，在 28-30℃条件下，曝气（搅拌转速为120rmp/Min）培养36-48h完成微生物固定化。

本发明生物制剂不含有草甘膦、农达、克无踪等化学除草制剂，避免了化学制剂残留量累积保护了水体及环境，与特定的固定化制剂组合制成的生物制剂具有适应性强、稳定性好、不易老化等特点。并合理利用微生物间的协同作用，不仅对浮游水草水葫芦的作用效果好，且无毒无害，生态环保，显著降低了用药量、施药次数以及用药成本，且该生物制剂配制方便，保存时间长，具有很强的实用价值。

本发明固定化方法简单，且固定化载体沸石以及陶粒对环境无污染，可以作为有效的吸附载体，完成固定化后，通过高温灭菌、清洗处理和煮沸还可以实现固定化载体的回收利用，有助于节约和环境保护。

具体实施方式

实施例1

一种固定净水剂，其包括复合微生物制剂和固定化载体。

所述复合微生物菌剂的制备方法为：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×10⁷个/ml的菌液，然后按照3:1:2的体积比混合，即得；

所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；

所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；

所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633

所述固定化载体为由陶粒、沸石按照1:1重量比组成；

将固定化载体和复合微生物菌剂按照1:6的体积比混合，在 28℃条件下，曝气（搅拌转速为120rmp/Min）培养48h完成微生物固定化。

本发明固定化净水剂剂添加量为0.2%的重量比例施加。

实施例2 一种固定化净水剂，其包括复合微生物制剂和固定化载体。

所述复合微生物菌剂的制备方法为：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×10⁷个/ml的菌液，然后按照4:2:3的体积比混合，即得；

所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；

所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；

所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633

所述固定化载体为由陶粒、沸石按照1:1重量比组成；

将固定化载体和复合微生物菌剂按照1:7的体积比混合，在 30℃条件下，曝气（搅拌转速为120rmp/Min）培养48h完成微生物固定化。

本发明固定化净水剂添加量为0.2%的重量比例施加。

实施例3 本发明净水剂对水葫芦致病性试验：

（1）复合微生物菌剂制备：

实验组：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×10⁷个/ml的菌液，然后按照3:1:2的体积比混合；所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633；

对照实验组1组：将不动杆菌、假丝酵母菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×10⁷个/ml的菌液，然后按照3:1的体积比混合；所述不动杆菌为ATCC NO.17978；所述假丝酵母菌为ATCC NO.22023；

对照实验2组：将假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×10⁷个/ml的菌液，然后按照1:2的体积比混合；所述假丝酵母菌为ATCC NO.22023；所述枯草芽孢杆菌为ATCC NO.6633；

（2）水葫芦自然生态培养模拟实验。

将生长正常的水葫芦幼株移栽于添加0.2％体积的步骤（1）制备的复合微生物菌剂的营养液中。同时以不添加菌液作为空白对照，均设立三组平行对照。露天培养，观察和记录水葫芦生长情况。培养20天后，含本申请复合微生物制剂的水葫芦均出现不同程度的枯萎，叶片出现病态，而对照组生长正常。

（3）水葫芦病情分级标准^]如下：

0级叶片上无任何病斑；

1级叶片上少数病斑，总面积小于三分之一；

2级叶片上病斑总面积大于三分之一，小于三分之二；

3级叶片上病斑面积大于三分之二；

4级叶片全部枯萎。

（4）水葫芦叶片的发病率和病情指数分别按以下公式计算：

发病率(100％)＝染病叶片数/总叶片数×100

叶片病情指数＝〔Σ(发病级别×该级的叶片数)/(总叶片数×4)〕×100％

重复上述实验三批次取平均值。结果表1所示：

表1净水剂对水葫芦致病性试验

组别	病情指数	发病率
			实验组	86.7%	84.2%
对照实验1组	33.5%	41.4%
			对照实验2组	52.1%	43.9%
对照组	12.3%	9.4%

实验结果表明，模拟自然生态培养的水葫芦，加入本申请微生物制剂能够显著增加水葫芦的病情指数和发病率。且实验组效果也显著优于对照实验1-2组，本申请复合菌剂之间实现了协同作用。

实施例4 本发明复合微生物制剂对水葫芦逆境反应酶试验

植物处于逆境条件下会引起一系列生理生化变化，使植物产生应激反应。病原菌侵染后，植物体内迅速发生氧迸发，产生大量活性氧，高浓度的活性氧对植物自身细胞有害，因此植物体内存在清除活性氧的保护酶系，包括过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等。

超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内清除超氧阴离子自由基的关键酶之一，它能将O^- ₂歧化为H₂O₂.。植物SOD酶的活性常与其抗氧化胁迫的能力正相关。过氧化氢酶(CAT)能够清除植物体内过多的过氧化氢，从而减少其对细胞的过氧化伤害，是植物中极为重要的逆境生理酶。过氧化物酶(POD)是植物体内担负清除H₂O₂的主要酶类，它可把H₂O₂转化为H₂O。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一，具有很强的毒性，它会严重损伤生物膜的结构与功能，其积累是自由基毒害作用的表现，其含量高低也就成了反应膜脂过氧化强弱的重要指标。因此丙二醛含量可反映植物遭受逆境伤害的程度，实验组水葫芦叶片中的丙二醛含量显著高于对照，说明本发明菌液对叶片的细胞膜产生了较强的毒害作用。从而导致水葫芦叶片失绿与细胞死亡，抑制了水葫芦植株的生长。

按照实施例3所示方法测定实验组水葫芦叶片中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶（POD）的活性，与空白对照组相比较。结果如下，实验组SOD值较空白对照组提高4.3倍，POD值较空白对照提高了2.4倍，CAT值提高了3.8倍。即实验组水葫芦叶片的SOD、POD、CAT酶的活性均显著提高。

实施例5 水体生物安全性试验

将实施例1制备的复合微生物菌剂进行了对水体生物的安全性试验。试验对象为南美白对虾(P.vanname)。试验用水为曝气自来水。按常规方法测得pH为7.4，试验水温为常温。本实验对水葫芦叶面喷洒的落入40cm深水中最大的浓度为30μl/L。

试验结果是：南美白对虾的安全浓度为275μl/L，证明了即便直接喷施复合微生物菌剂对南美白对虾的毒性很低。

取生长正常的水莲、栽培于培养基中，按照培养基体积的0.2%的量添加实施例2制备的复合微生物菌剂，以不添加菌液的空白对照组为对照。观察和记录植株生长情况，30天内植株均生长正常，未见明显异常。

实施例6 本发明固定化净水剂水体净化试验

取模拟池塘富营养化水体（含水葫芦）进行试验，以 0.2%的重量比例施加实施例2制备的固定化复合菌剂。以不添加固定化复合菌剂为空白对照组，设平行组，28℃培养。采用间歇曝气方式培养。72h后取样测定水体中氨氮和COD的含量，以及水葫芦的坏死叶片百分比。

结果如表2所示：

表2 固定化净水剂水体净化试验

组别	COD降解率	氨氮降解率	水葫芦叶片坏死率
				实验组	71.8%	66.3%	31.7%
空白对照组	3.2%	4.1%	0

结论，本发明制剂能够显著降低富营养化水体的COD和氨氮，起到净化水体的效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种固定化净水剂的制备方法，其特征在于，将固定化载体和复合微生物菌剂按照1:（6-7）的体积比混合，在 28-30℃条件下，搅拌培养36-48h。

2.根据权利要求1所述的固定化净水剂的制备方法，其特征在于，所述复合微生物菌剂由不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌组成。

3.根据权利要求1-2所述的固定化净水剂的制备方法，其特征在于，所述复合微生物菌剂的制备方法为：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×10⁷个/ml的菌液，然后按照3-4:1-2:2-3的体积比混合。

4.根据权利要求1-3所述的固定化净水剂的制备方法，其特征在于，

所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；

所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；

所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633。

5.根据权利要求1-4所述的固定化净水剂的制备方法，其特征在于，

所述固定化载体为由陶粒、沸石按照1:1重量比组成。

6.权利要求1-5所述制备方法用于净化富营养水体的用途。

7.权利要求1-5所述制备方法制备的净水剂用于抑制水体中水生草本植物生长的用途。

8.权利要求1-5所述制备方法制备的净水剂用于水体中水葫芦防治的用途。