CN105483157B - 改变细胞命运的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改变细胞命运的方法,该方法包括诱导细胞发生线粒体炫,所述细胞为体细胞。发明人发现诱导细胞发生线粒体炫,如通过药物(如百草枯、黄蜂毒素)或基因(如细胞过表达亲环素D)的方法诱导细胞发生线粒体炫,能够显著促进细胞的重编程。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,本发明涉及改变细胞命运的方法。
背景技术
伴随着胚胎干细胞细胞核心转录因子(Oct4,Sox2,Nanog)调控机理的逐渐阐明,日本科学家Yamanaka成功利用四个转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc(Yamanaka因子)将小鼠成纤维细胞变成了诱导多能干细胞(iPSCs),为获得特定个体的多能性干细胞指明了新的方向。诱导多能干细胞是一类能够维持自我更新并具有多潜能分化能力的干细胞。相对于胚胎干细胞,诱导多能干细胞是由体细胞直接进入多能干细胞的状态,避免了伦理学争议。在短短几年时间里,科学家还发现了大量其他的重编程因子如Nanog,Lin28,Esrrb,Tbx3等等,这些重编程因子有的可以促进iPSCs的效率,提高iPSCs的质量,有的可以替代一个或几个Yamanaka因子。
体细胞的重编程(有时也称为去分化)和再分化被称为细胞命运的改变。
然而,目前如何改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程,仍有待进一步研究。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
发明人在研究重编程的过程中惊奇地发现,线粒体炫发生频率在重编程发生后的第三天出现瞬时的升高。基于发明人的上述发现,发明人通过药物和基因的方法诱导细胞线粒体炫的发生,从而检测到瞬时的促进线粒体炫的发生频率能够促进细胞的重编程。
在本发明中所使用的术语“线粒体炫”的含义是一种生理现象,即线粒体中超氧离子瞬时爆发释放。另外,在本发明中所使用的术语“诱导细胞发生线粒体炫”的含义是指提高细胞线粒体炫的发生频率,即提高单位时间内细胞线粒体炫的发生个数,例如,与未进行诱导的细胞相比,经过诱导的细胞线粒体炫的发生频率提高1.5倍。
在本发明的第一方面,本发明提出了一种改变细胞命运的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:诱导细胞发生线粒体炫;任选地,所述细胞为体细胞,任选地,所述体细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc。根据本发明的实施例,诱导过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc(Yamanaka因子)的体细胞发生线粒体炫,可以显著促进体细胞的重编程,从而显著促进细胞命运的改变。
根据本发明的实施例,上述改变细胞命运的方法还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一:
根据本发明的是实施例,所述诱导细胞发生线粒体炫是通过下列至少之一实现的:使所述细胞与百草枯(paraquat)接触;使所述细胞与黄蜂毒素(mastoparan)接触;以及使所述细胞过表达亲环素D(CypD),任选地,通过将表达载体引入所述细胞中以便过表达所述亲环素D(CypD),其中,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
ATGCTAGCGCTGCGTTGCGGCCCCCGCCTGCTCGGTCTGCTCTCCGGCCCGCGCTCCGCGCCGCTGCTCCTCTCCGCGACCCGTACCTGCAGCGACGGCGGAGCCCGCGGCGCGAACTCTTCCTCCGGGAACCCGCTCGTGTACTTGGACGTGGGCGCCGATGGACAGCCGCTCGGCCGCGTGGTGCTGGAGTTAAAGGCAGATGTCGTGCCAAAGACTGCAGAGAACTTCAGAGCCCTATGCACTGGTGAGAAGGGCTTTGGCTACAAAGGCTCCACCTTCCACAGGGTGATCCCAGCCTTCATGTGCCAGGCTGGCGACTTCACCAACCACAATGGCACAGGAGGGAGGTCCATCTACGGAAGCCGCTTTCCCGACGAGAACTTCACACTGAAGCATGTGGGGCCAGGTGTCCTGTCCATGGCGAACGCAGGCCCCAACACCAATGGCTCTCAGTTCTTTATCTGCACGATAAAGACAGACTGGCTAGATGGCAAGCATGTCGTGTTCGGCCATGTCAAAGAGGGCATGGATGTTGTGAAGAAAATAGAATCTTTCGGCTCAAAAAGTGGGAAGACGTCTAAGAAGATTGTCATCACAGACTGTGGCCAGTTGAGCTAA(SEQ ID NO:1)。
任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。根据本发明的实施例,所述体细胞与paraquat或mastoparan接触,或所述体细胞过表达CypD,可显著诱导细胞线粒体炫的发生,显著促进体细胞的重编程,从而显著促进细胞命运的改变。
在本发明的第二方面,本发明提出了诱导细胞发生线粒体炫的试剂在改变细胞命运中的用途,所述细胞为体细胞,所述体细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc。根据本发明的实施例,诱导细胞发生线粒体炫可显著促进过表达Yamanaka因子体细胞的重编程,从而显著促进体细胞命运的改变,因此能够诱导细胞发生线粒体炫的试剂能够显著促进体细胞的重编程,显著促进体细胞命运的改变。
根据本发明的实施例,上述诱导细胞发生线粒体炫的试剂在改变细胞命运中的用途还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述诱导细胞发生线粒体炫的试剂包括选自下列的至少之一:百草枯;黄蜂毒素;以及适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂,任选地,所述适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂包括表达载体,其中,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。根据本发明的实施例,百草枯;黄蜂毒素;以及适于使所述细胞过表达CypD的试剂可显著促进体细胞的重编程,显著促进体细胞命运的改变。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种用于改变细胞命运的试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒包括:诱导细胞发生线粒体炫的试剂,任选地,所述细胞为体细胞,任选地,所述诱导细胞发生线粒体炫的试剂包括选自下列的至少之一:百草枯;黄蜂毒素;以及适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂,任选地,所述适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂包括表达载体,其中,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。根据本发明的实施例,诱导细胞发生线粒体炫的试剂能够显著促进体细胞的重编程,显著促进体细胞命运的改变,从而包括诱导细胞发生线粒体炫的试剂的试剂盒可显著促进体细胞命运的改变。百草枯,黄蜂毒素,或适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂可显著诱导细胞发生线粒体炫,从而包含有百草枯,黄蜂毒素,或适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂的试剂盒可显著促进体细胞命运的改变。
根据本发明的实施例,上述试剂盒还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,上述试剂盒进一步包括:适于使所述细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc的试剂,任选地,所述适于使所述细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc的试剂包括表达载体,所述表达载体携带Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc核苷酸序列的至少之一,任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。根据本发明的实施例,过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc可诱导体细胞重编程,在Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc诱导体细胞重编程的基础上用百草枯或黄蜂毒素处理体细胞或者诱导体细胞过表达亲环素D进一步促进了体细胞的重编程效率。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种用于改变细胞命运的培养基。根据本发明的实施例,所述培养基包括:基础培养基;以及适于诱导细胞发生线粒体炫的试剂。任选地,所述细胞为体细胞,所述体细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc。任选地,所述诱导细胞发生线粒体炫的试剂包括选自下列的至少之一:百草枯;黄蜂毒素;以及适于使所述细胞过表达亲环素D的病毒。所述病毒携带表达载体,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,任选地,所述病毒独立地选自逆转录病毒、慢病毒的至少之一,任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。任选地,所述百草枯的浓度是1微摩尔/升,所述黄蜂毒素的浓度是5微摩尔/升,所述病毒的感染复数为6。根据本发明的实施例,本发明所提出的含有1微摩尔/升的百草枯或5微摩尔/升的黄蜂毒素的培养基或含有感染复数为6的病毒的培养基,所述病毒用于过表达亲环素D,可显著诱导细胞发生线粒体炫,显著促进细胞的重编程,从而显著促进细胞命运的改变。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种改变细胞基因甲基化水平的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:诱导细胞发生线粒体炫。任选地,所述细胞为体细胞,所述体细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc。任选地,所述诱导细胞发生线粒体炫是通过下列至少之一实现的:使所述细胞与百草枯接触;使所述细胞与黄蜂毒素接触;以及使所述细胞过表达亲环素D。任选地,通过将表达载体引入所述细胞中以便过表达所述亲环素D,其中,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。任选地,所述基因独立地选自Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog,Lin28,Esrrb,Tbx3的至少之一。根据本发明的实施例,使所述体细胞与百草枯、黄蜂毒素接触或使所述细胞过表达亲环素D,可显著促进细胞发生线粒体炫。发明人惊奇的发现,细胞发生线粒体炫可使重编程因子Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog,Lin28,Esrrb,Tbx3的至少之一启动子发生去甲基化,从而大大促进了上述重编程因子的表达。重编程因子的高表达可进一步促进细胞的重编程,从而进一步促进细胞命运的改变。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种形成诱导多能干细胞的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:诱导细胞发生线粒体炫,其中,所述细胞为小鼠胚胎成纤维细胞,所述小鼠胚胎成纤维细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc。根据本发明的实施例,发明人惊奇的发现,诱导过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc的小鼠胚胎成纤维细胞发生线粒体炫,使重编程前期线粒体炫的发生频率瞬时升高,可显著促进小鼠胚胎成纤维细胞的重编程,显著促进诱导多能干细胞的产生。
根据本发明的实施例,上述形成诱导多能干细胞的方法还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述诱导细胞发生线粒体炫进一步包括:利用前面所述的培养基培养所述小鼠胚胎成纤维细胞。如前所述,本发明所提出的培养基能够诱导细胞发生线粒体炫,显著促进细胞的重编程。根据本发明的实施例,将所述小鼠胚胎成纤维细胞在本发明所提出的培养基中培养,可明显诱导小鼠胚胎成纤维细胞发生线粒体炫,显著促进小鼠胚胎成纤维细胞的重编程(去分化),显著促进小鼠胚胎成纤维细胞的重编程因子的去甲基化和表达,从而显著促进了诱导多能干细胞的产生。
需要说明的是,本专利中术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
附图说明
图1是根据本发明实施例的细胞重编程过程中线粒体炫发生频率的统计结果;
图2是根据本发明实施例的药物(mastoparan或paraquat)和CypD蛋白促进细胞线粒体炫的结果,
其中,图2A显示了mastoparan或paraquat处理促进线粒体炫的结果,
图2B显示了诱导CypD蛋白过表达促进线粒体炫的结果;
图3是根据本发明实施例的线粒体炫促进重编程实验的结果,
其中,图3A显示了mastoparan或paraquat处理促进重编程实验的结果,
图3B显示了CypD蛋白诱导表达促进重编程实验的结果;
图4是根据本发明实施例的过表达CypD以及药物paraquat和mastoparan处理能促进转录因子Nanog的表达的实验结果;以及
图5是根据本发明实施例的过表达CypD以及药物paraquat和mastoparan处理能促进转录因子Nanog启动子的去甲基化的实验结果,
其中,图5A显示了药物paraquat或mastoparan处理促进转录因子Nanog启动子的去甲基化的实验结果,
图5B显示了过表达CypD促进转录因子Nanog启动子的去甲基化的实验结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
线粒体炫是线粒体中超氧离子瞬时爆发释放的生理现象。目前有两种方式能提高线粒体炫的发生频率,1.促进线粒体的氧离子产生,2.促进线粒体孔道(mitochondrialpermeability transition pore,mPTP)的开放。根据本发明的实施例,发明人使用了两种药物和一种基因的方法来提高线粒体炫的发生频率。药物paraquat能使线粒体的氧离子升高,药物mastoparan能促进mPTP的开放。CypD蛋白是mPTP的组成成分,它的表达能促进mPTP的开放。发明人通过研究发现,诱导细胞发生线粒体炫,如分别用paraquat或mastoparan处理细胞或过表达CypD蛋白可显著促进体细胞的重编程。
根据本发明的实施例,在研究体细胞重编程过程中,发明人统计体细胞重编程过程中的30-50个细胞,计算在100秒内平均每个细胞中有多少线粒体炫。发明人惊奇地发现,线粒体炫发生频率在重编程发生的第三天出现瞬时的升高。进而,发明人想到通过药物和基因的方法来诱导线粒体炫的发生,以此检测瞬时的促进线粒体炫是否能够促进重编程。基于上述想法,发明人构建了CypD的诱导表达载体,发明人惊奇的发现,在重编程进行过程中,在前四天诱导过表达CypD能显著促进重编程;发明人用paraquat和mastoparan药物在前八天处理亦能显著促进重编程。发明人进一步研究发现,线粒体炫是通过促进转录因子Nanog的表达而促进重编程,并且发明人发现线粒体炫能促进Nanog基因启动子的去甲基化。
本文中使用的术语“表达载体”包括可以表达蛋白质的任何载体,在以下的实施例中,选择逆转录病毒表达载体是PMX-flag,选择慢病毒表达载体是pRLenti-TetO-LoxP;本文中所述的“细胞”为任何可以获得的体细胞,在以下的实施例中,选择小鼠胚胎成纤维细胞。
本专利中,可以通过本领域已知的任何手段转染或感染细胞,在以下的实施例中,选择逆转录病毒或慢病毒包装后感染细胞。可以使用本领域已知的各种方法检测诱导发生线粒体炫对细胞重编程的影响;可以使用本领域已知的各种方法检测诱导发生线粒体炫对对细胞重编程因子甲基化的影响。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1重编程过程中检测线粒体炫
将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)进行重编程处理。处理过程如下:
(1)用Plat-E细胞系包装出用于过表达重编程因子Sox2,Klf4,Oct4和c-Myc以及cpYFP(一种绿色荧光蛋白,可以特异性检测线粒体超氧化物)的逆转录病毒。注射器分别收集含有病毒的上清,将病毒上清经过0.45微米的滤器过滤到离心管中,之后向离心管中补加适量的新鲜培养基(对于10厘米盘收集的病毒体积补加到大概12毫升),之后向离心管中加入polybrene,混匀得病毒液,所得病毒液可保存在4℃,也可立即用作感染。再24小时后,按同样方法收集Plat-E细胞病毒上清,并二次感染MEF细胞。
(2)二次感染后的MEF细胞换成新鲜的小鼠胚胎干细胞培养基(mESC),此为重编程的Day 0天。之后,每天需要更换新鲜培养基,直到实验结束。
MEF细胞在感染完用于表达重编程因子的逆转录病毒后,发明人用激光共聚焦显微镜实时拍摄线粒体炫,使用的激发光波长为488nm。拍摄完毕后统计每个细胞在一定时间内线粒体炫的数量。统计多于30个的细胞,计算在100s内平均每个细胞有多少的线粒体炫。
在重编程过程中,发明人分别检测了Day 0,Day 3,Day 5和Day8细胞中的线粒体炫的发生频率(此处是指在100s内平均每个细胞有多少的线粒体炫,此处的单位时间定义为100s)。
图1中显示在Day 3线粒体的发生频率有显著的升高。
实施例2构建CypD诱导表达质粒
以细胞的cDNA为模板,利用表1所示的引物(SEQ ID NO:6~7所示核苷酸序列)PCR扩增CypD片断,然后用琼脂糖凝胶电泳切胶回收。在pRLenti-TetO-LoxP载体的多克隆位点(经BamHI和EcoRI双酶切后)插入回收产物CypD片段,经连接,转化,挑菌,测序,最后得到用于CypD诱导表达的慢病毒质粒。
表1克隆CypD基因片断的引物
实施例3过表达CypD以及药物paraquat或mastoparan处理促进线粒体炫
对转染了cpYFP的MEF细胞(进行药物处理(1uM paraquat或5uM mastoparan)或过表达CypD,处理48h后进行线粒体炫检测,采用实施例1中所述的方法统计多于30个的细胞,计算在100s内平均每个细胞有多少的线粒体炫。MEF细胞的线粒体炫在药物处理后能显著的提高,如图2所示(其中,图2A显示的是药物处理提高细胞线粒体炫发生频率的结果,图2B显示的是过表达CypD提高细胞线粒体炫发生频率的结果)。
由图2可以看出,药物或CypD的过表达至少使细胞的线粒体炫发生频率提高1.5倍左右。
实施例4过表达CypD以及药物paraquat和mastoparan处理促进重编程
在药物处理实验中,通过采用实施例1中所述的方法对OG2-MEF细胞进行重编程处理(用于过表达重编程因子Sox2,Klf4,Oct4和c-Myc的逆转录病毒感染OG2-MEF细胞),在感染完重编程因子后换成含有药物(1uM paraquat或5uM mastoparan)的mESC,此为重编程的Day 0天,在Day 8天换成新鲜的mESC培养基直到Day 13天统计完GFP阳性克隆数量。统计结果如图3A所示。
图3A显示了在mastoparan和paraquat处理8天能促进重编程但是处理13天不能促进重编程。
在诱导表达CypD实验中,CypD需要用四环素DOX来诱导表达。CypD慢病毒(包装细胞系采用293T细胞,包装过程所用质粒包含实施例2所述的CypD诱导表达质粒和相应慢病毒包装质粒PM-2G、Pspax2)和四因子病毒SKOM(即Sox2,Klf4,Oct4和Myc)同时感染OG2-MEF细胞,在感染完后换成含有2ug/ml DOX药物的mESC培养基,此为重编程的Day 0天,在Day 3天换成新鲜的mESC培养基直到Day 13天统计完GFP阳性克隆数量。统计结果如图3B所示。
图3B显示了在CypD蛋白诱导表达4天能促进重编程但是诱导表达13天不能促进重编程。
在上述药物处理实验和诱导表达CypD实验中,OG2-MEF细胞是内源Oct4启动子上偶联有GFP蛋白的MEF细胞,此细胞的iPSC克隆有GFP荧光时,表明了内源Oct4的表达,即为MEF细胞的成功重编程的标志。此时可以在显微镜下数出GFP荧光阳性的克隆,即为iPSC的诱导效率。
由图3可以看出,在重编程前期促进线粒体炫能有效促进重编程。
实施例5过表达CypD以及药物paraquat和mastoparan处理能促进转录因子Nanog的表达
对MEF细胞进行重编程诱导处理,方法如实施例1所述(用于过表达重编程因子Sox2,Klf4,Oct4和c-Myc的逆转录病毒感染MEF细胞),继而进行诱导过表达CypD或药物(paraquat或mastoparan)处理MEF细胞(方法如实施例4所述)。在Day 4和Day 8天收集CypD过表达(用于过表达CypD的慢病毒同时感染MEF细胞)和药物处理(paraquat或mastoparan处理)的细胞样品蛋白,进行蛋白凝胶电泳(Western Blot)检测发现,Nanog蛋白的表达量在CypD表达和药物处理后有显著的升高,结果如图4所示,图4中GAPDH为内参蛋白。
图4结果显示,Nanog蛋白的表达量在CypD表达和药物处理后有显著的升高。
实施例6过表达CypD以及药物paraquat和mastoparan处理能促进转录因子Nanog启动子的去甲基化
对MEF细胞进行重编程诱导处理,方法如实施例1所述(用于过表达重编程因子Sox2,Klf4,Oct4和c-Myc的逆转录病毒感染MEF细胞),继而进行诱导过表达CypD或药物(paraquat或mastoparan)处理MEF细胞方法(如实施例4所述)。在Day 3和Day 7检测Nanog启动子的甲基化水平。
在本实施例中,发明人采用了亚硫酸氢盐加测序的方法进行Nanog启动子的甲基化水平进行检测。甲基化水平检测是检测待测DNA序列上的GpC上的C是否被甲基化。亚硫酸氢盐加测序的方法的原理是当用亚硫酸氢盐处理时DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),而有甲基化的C则不变,由此待测DNA序列中产生甲基化特异的序列变化,继而通过测序就能确定待测DNA的哪些位点出现了甲基化。
在本实施例中,甲基化水平检测步骤如下所述:
1)收集过表达CypD或p药物处理后的MEF细胞并提取DNA;
2)取1ug的DNA用2.5M的亚硫酸氢盐处理12h;
3)通过PCR扩增Nanog的启动子,将扩增产物测序;
4)通过比较原来的Nanog启动子序列,判断哪些CpG位点发生了甲基化。
发明人发现Nanog启动子的甲基化水平在CypD过表达或药物处理后有显著的降低,结果如图5A和5B所示,图中数字代表Nanog启动子总的甲基化的水平。
图5结果显示,Nanog启动子的甲基化水平在CypD过表达或药物处理后有显著的降低。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (13)
1.一种促进细胞的重编程的方法,其特征在于,包括:
诱导细胞发生线粒体炫,所述细胞为体细胞,所述体细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc;
所述诱导细胞发生线粒体炫是通过下列至少之一实现的:
使所述细胞与百草枯接触;
使所述细胞与黄蜂毒素接触;以及
使所述细胞过表达亲环素D。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,通过将表达载体引入所述细胞中以便过表达所述亲环素D,其中,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示核苷酸序列,
任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。
3.诱导细胞发生线粒体炫的试剂在促进细胞的重编程中的用途,所述细胞为体细胞,所述体细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc;
所述诱导细胞发生线粒体炫的试剂包括选自下列的至少之一:
百草枯;
黄蜂毒素;以及
适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂包括表达载体,其中,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,
任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。
5.诱导细胞发生线粒体炫的试剂在制备用于促进细胞的重编程的试剂盒中的用途,所述细胞为体细胞,所述诱导细胞发生线粒体炫的试剂包括选自下列的至少之一:
百草枯;
黄蜂毒素;以及
适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述适于使所述细胞过表达亲环素D的试剂包括表达载体,其中,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,
任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。
7.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,进一步包括:
适于使所述细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc的试剂,
任选地,所述适于使所述细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc的试剂包括表达载体,所述表达载体携带Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc核苷酸序列的至少之一,
任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。
8.适于诱导细胞发生线粒体炫的试剂在制备促进细胞的重编程的培养基中的用途,所述培养基包括基础培养基,所述细胞为体细胞,所述体细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc,
所述适于诱导细胞发生线粒体炫的试剂包括选自下列的至少之一:
百草枯;
黄蜂毒素;以及
适于使所述细胞过表达亲环素D的病毒,所述病毒携带表达载体,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述病毒独立地选自逆转录病毒、慢病毒的至少之一,
任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一,
任选地,所述百草枯的浓度是1微摩尔/升,
所述黄蜂毒素的浓度是5微摩尔/升,
所述病毒的感染复数为6。
10.一种促进细胞Nanog基因启动子去甲基化水平的方法,其特征在于,包括:
诱导细胞发生线粒体炫,所述细胞为体细胞,所述体细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc,
所述诱导细胞发生线粒体炫是通过下列至少之一实现的:
使所述细胞与百草枯接触;
使所述细胞与黄蜂毒素接触;以及
使所述细胞过表达亲环素D。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,通过将表达载体引入所述细胞中以便过表达所述亲环素D,其中,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示核苷酸序列,
任选地,所述表达载体独立地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体的至少之一。
12.一种形成诱导多能干细胞的方法,其特征在于,包括:
诱导细胞发生线粒体炫,其中,所述细胞为小鼠胚胎成纤维细胞,所述小鼠胚胎成纤维细胞过表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc;
所述诱导细胞发生线粒体炫是通过下列至少之一实现的:
使所述细胞与百草枯接触;
使所述细胞与黄蜂毒素接触;以及
使所述细胞过表达亲环素D。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述诱导细胞发生线粒体炫进一步包括:
利用培养基培养所述小鼠胚胎成纤维细胞,所述培养基包括:基础培养基以及适于诱导细胞发生线粒体炫的试剂,所述诱导细胞发生线粒体炫的试剂包括选自下列的至少之一:
百草枯;
黄蜂毒素;以及
适于使所述细胞过表达亲环素D的病毒,所述病毒携带表达载体,所述表达载体携带SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
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Mitoflash可以在线虫早期预测其寿命;宋春青;《中国博士学位论文全文数据库(基础科学辑)》;20140815(第8期);第3.10节 * |
Superoxide Flashes in Single Mitochondria;Wang Wang 等;《Cell》;20080725;第134卷(第2期);279-290 * |
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