CN105474015A - 用于硫醇标记的3-芳基丙炔腈化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用3-芳基丙炔腈化合物标记包含硫醇部分的化合物的方法，被标签部分取代的3-芳基丙炔腈化合物和特定的3-芳基丙炔腈连接子。

Description

用于硫醇标记的3-芳基丙炔腈化合物
技术领域
本发明涉及用3-芳基丙炔腈化合物标记包含硫醇部分的化合物的方法，被标签部分取代的3-芳基丙炔腈化合物和特定的3-芳基丙炔腈连接子。
背景技术
超过90％的人类蛋白含有半胱氨酸，而人类蛋白质组的计算机模拟消化揭示出，可通过质谱法(MS)检测的所有人类胰蛋白酶肽中仅约15％在其序列中含有至少一个半胱氨酸。这种观测结果与高反应性硫醇基团在其侧链上的存在组合，使得半胱氨酸成为化学标记的有吸引力的靶标。半胱氨酸是唯一的带有亲核巯基(或硫醇)基团(-SH)的编码氨基酸，其在很大程度上超过容许存在于蛋白质中的任何其他亲核功能的反应性。因此，化学特异性半胱氨酸衍生是迄今为止最广泛用于蛋白质的化学标记的方法。迄今为止在文献中所报道的大量化学半胱氨酸修饰方法中，最通常使用试剂如N-取代马来酰亚胺、4-乙烯基吡啶和碘乙酰胺。它们都具有阻止它们成为半胱氨酸标记的理想方法的缺点，但是适合这项任务。这些缺点主要是存在不需要的副反应，特别是对于碘乙酰胺和马来酰亚胺，和由于可逆的硫醇交换和其他副反应而导致的加成产物在生物环境中的不稳定性。
本发明涉及用包含标签部分和3-芳基丙炔腈部分的化合物标记包含至少一个硫醇部分如半胱氨酸的化合物的方法。所述化合物和其与半胱氨酸衍生物的加成产物在广泛多种条件下显示出乎意料的稳定性。本发明的用于标记包含硫醇部分的化合物的方法因此可用于广泛多种应用。
发明内容
本发明的第一个目的是制备被标记的包含硫醇部分的化合物的方法，其包括使包含硫醇部分的化合物与式(I)化合物接触，其中R1至R5如下文所述，并且其中R1至R5中的至少一个包含标签部分。
本发明的另一个目的是式(I)化合物其中R1至R5如下文所定义，并且其中R1至R5中的至少一个包含标签部分。
本发明的另一个目的是式(II)化合物其中R1至R5如下文所定义，并且其中R1至R5中的至少一个不同于氢原子。
本发明的另一个目的是式(III)化合物其中R6-S对应于如上文鉴定的包含至少一个硫醇部分的化合物的部分。
附图说明
图1：对于相同浓度的化合物A和B，在人类血浆中获得的荧光强度随时间的演变。
图2：a)对于相同浓度的化合物A和B，在细胞中获得的荧光强度随时间的演变。
b)在细胞中在不同时间下的化合物B/化合物A强度比率。
c)用化合物A和B处理的细胞的显微镜照片，TAMRA和Hoechst标记叠加。细胞核周围的白点对应于水解探针。A–芳基丙炔腈探针，B–马来酰亚胺探针。
图3：在25℃下1mM浓度的苯基马来酰亚胺(2)在PBS(1×，pH7.6)中的水解的HPLC监测；峰值从最早到最晚对应于 和2通过原料的消失来监测转化率(a)。通过绘制ln([苯基马来酰亚胺])对时间的曲线并通过线性回归分析来测定反应的准一级速率常数。所述常数对应于所确定斜率的绝对值(b)。
图4：在25℃下1mM浓度的N-(4-(氰基乙炔基)苯基)乙酰胺(pNHAc-APN，11)在PBS(1×，pH7.6)中的水解稳定性的HPLC监测。通过原料的消失来监测转化率；峰值从最早到最晚对应于和11在监测5小时后未观测到芳基丙炔腈11的可检测转化。
图5：化合物1、2、3、5、7、11、10和9的MTT测试结果。
图6：a)CD38和CD38A275C突变体的示意性结构和所测量的DLS光谱；b)用49修饰CD38A275C的方案；c)所得结合物的DLS(动态光散射)光谱。
图7：在纯化之前(a)和在纯化之后(b)，用根据本发明的化合物和用相应的马来酰亚胺化合物标记的CD38-C375突变体的凝胶电泳。
图8：用根据本发明的化合物制备抗体-TAMRA结合物的策略，和与相应的马来酰亚胺的比较。
图9：分别用根据本发明的化合物(CBTF)和用相应的马来酰亚胺(SMCC)获得的结合物的凝胶电泳。
图10：用根据本发明的化合物获得的结合物的质谱。
图11：图10的质谱的放大。
图12：用马来酰亚胺获得的质谱。
图13：图12的质谱的放大。
图14：化合物58与部分还原的曲妥珠单抗(Trastuzumab)的直接结合的一般方案。
图15：所得结合物的SDS-PAGE分析显示，化合物58共价连接至抗体。
图16：使用化合物33和34进行抗体片段的再桥接的一般方案。
图17：SDS-PAGE分析显示，抗体片段被化合物33和34成功地桥接。
具体实施方式
本发明的第一个目的是用于标记包含硫醇部分的化合物的方法，其包括使所述包含硫醇部分的化合物与式(I)化合物接触，
其中R1至R5中的每一个在由以下组成的群组中独立地选择：
-氢原子，
-烷基、烯烃或炔烃基团，任选地间杂有选自O、N和S的至少一个杂原子，
-芳基基团，
-烷氧基基团，
-卤素原子，
-氨基(-NRR')基团，其中R和R'独立地是氢原子、烷基、烯烃、炔烃或如下文所定义的芳基基团，
-羟基胺(-ONH2)基团，
-肼(-NH-NH2)基团，
-硝基(-NO2)基团，
-叠氮基(-N3)基团，
-重氮(-N2 +)基团，任选地在平衡离子的存在下，
-马来酰亚胺基团，
-烷基-羧基或芳基-羧基(-C(＝O)OR)基团，其中R如上文所述，
-烷基-羰基或芳基-羰基(-C(＝O)R)基团，其中R如上文所述，
-羟基(-OH)基团，
-硼酸-B(OR”)2基团，其中R”是氢原子或烷基基团，
-膦或鏻基团，
-异氰酸酯(-N＝C＝O)或异硫氰酸酯(-N＝C＝S)基团，
-氯磺酰基(-SO2Cl)基团，
--O-C(＝O)-C(N2)-CF3基团或-C(＝O)-C(N2)-CF3基团，
-活化酯如-C(＝O)-NHS(其中NHS代表N-氢琥珀酰亚胺基)、全氟化酯和酰脲，
--C≡C-C≡N基团，
-标签，和
-被先前所列出基团中的至少一个取代的烷基基团，
其中R1至R5中的至少一个包含标签部分并且优选是标签部分。
R1至R5中的两个可能可选地与其所连接的苯基环的碳原子一起形成饱和、不饱和或芳族的单环或多环，其任选地包含至少一个杂原子如P、O或S。
包含在所述式(I)化合物中的标签部分可直接键合至所述苯基环。其也可经由“连接子”基团如COO、NH-C(＝O)-NH、NH-C(＝O)-O、三唑或CONH基团键合至所述苯基环。其也可作为如上所述的R1至R5基团之一的取代基存在。
在一个优选的实施方案中，R3包含标签部分，优选地R3是标签部分。
在本发明中，术语“烷基”是指包含1至20个碳原子、优选地1至6个碳原子、特别是1至3个碳原子的直链、环状或支链的烃基团。在烷基基团中可以提到例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基和环己基基团。根据本发明的烷基基团可间杂有选自Si、N、O和S的至少一个杂原子。在间杂有至少一个杂原子的烷基基团中可提到式-(OCH2-CH2)n-OH的聚乙二醇基团，其中n是1至1000，优选地1至100，特别是1至8。根据本发明的烷基基团可被至少一个卤素原子取代。
术语“烯烃”是指还包含至少一个C＝C双键的如上文所定义的烷基基团。
术语“炔烃”是指还包含至少一个C≡C三键的如上文所定义的烷基基团。在炔烃基团中可以提到例如乙炔和环辛炔基团。
术语“烷氧基”是指经由氧原子连接至分子其余部分的如上文所定义的烷基基团。
术语“芳基”是指包含至少一个包括由双键和/或非键合电子对构成的共轭π体系的平面环的基团，其中每个环原子包含p轨道，所述p轨道彼此重叠，并且π电子的离域降低分子能量。优选地，所述芳基基团是任选地包含选自N、O和S的至少一个杂原子的烃芳基基团。优选地，芳基基团选自由苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、二氢异噁唑基、三唑基、二嗪基、四嗪基、吡唑基和萘基基团组成的群组。特别是，芳基基团选自异噁唑基、二氢异噁唑基、三唑基、二嗪基、四嗪基和吡唑基基团。
术语“卤素”是指选自由F、Cl、Br和I原子组成的群组的原子。优选地，卤素是Cl或Br原子。
本发明的式(I)、(II)、(III)和(IV)的范围也涵盖化合物的光学和几何异构体、外消旋体、互变异构体、盐、水合物、溶剂化物和其混合物。
当根据本发明的化合物呈盐形式时，它们优选是药学上可接受的盐。这类盐包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的碱加成盐、药学上可接受的金属盐、铵和烷基化铵盐。酸加成盐包括无机酸以及有机酸的盐。合适的无机酸的代表性实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。合适的有机酸的代表性实例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、乙醇酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水盐酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、酒石酸、抗坏血酸、扑酸、双亚甲基水盐酸、乙二磺酸、葡糖酸、柠康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、EDTA、乙醇酸、对氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、硼酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、羟基萘甲酸盐、甘油磷酸盐、酮戊二酸盐等。药学上可接受的无机或有机酸加成盐的其他实例包括药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)1977,66,2中列出的药学上可接受的盐。优选地，所述盐不包含任何硫醇部分。
“平衡离子”可为适于补偿重氮基团的电荷的任何离子，并且本领域普通技术人员可容易地选择。例如，平衡离子可选自卤离子、BF4 -、NO3 -、HSO4 -、PF6 -CH3COO-、N(SO2CF3)2 -、CF3SO3 -、CH3SO3 -、CF3COO-、(CH3O)(H)PO2 -和N(CN)2 -。
在本发明中，羟基(OH)、氨基(NH2或NHR)和羧基(COOH)基团可用适当的保护基团保护。可提及T.W.Green,P.G.M.Wuts,有机合成中的保护基团(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis),Wiley-Interscience,NewYork,1999。
在用于羟基基团的保护基团中可提到乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基、[双(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMT)、甲氧基甲醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基，MMT)]、对甲氧基苄醚(PMB)、甲硫 基甲醚、三甲基乙酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)和三苯甲基(三苯基甲基，Tr)。
在用于氨基基团的保护基团中可提到氨基甲酸叔丁酯(Boc)、氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基乙酯(Teoc)、氨基甲酸1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙酯(Adpoc)、氨基甲酸1-甲基-1-(4-联苯基)乙酯(Bpoc)、氨基甲酸1-(3,5-二叔丁基苯基)-1-甲基乙酯(t-Bumeoc)、氨基甲酸1-金刚烷酯(Adoc)、氨基甲酸对甲氧基苄酯(Moz)、氨基甲酸9-蒽基甲酯、氨基甲酸二苯基甲酯、氨基甲酸9-芴基甲酯(Fmoc)、氨基甲酸9-(2-磺基)芴基甲酯、氨基甲酸9-(2,7-二溴)芴基甲酯、氨基甲酸2,7-二叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻吨基)]甲酯(DBD-Tmoc)、氨基甲酸2-(N,N-二环己基甲酰氨基)乙酯、氨基甲酸2-鏻基乙酯(Peoc)、氨基甲酸2-苯基乙酯、氨基甲酸苄酯(Cbz)、氨基甲酸烯丙酯(Alloc)、氨基甲酸1-异丙基烯丙酯(Ipaoc)、氨基甲酸4-硝基肉桂酰基酯(Noc)、氨基甲酸8-喹啉酯和N-邻苯二甲酰亚胺。
在用于羧基基团的保护基团中可提到甲酯、苄酯、叔丁酯、甲硅烷酯、2,6-二甲基苯酚、2,6-二异丙基苯酚和2,6-二叔丁基苯酚。
术语“标签”或“标签部分”是指适于允许以下中的一项或几项的化学基团：
-化合物的检测，
-化合物对所关注试剂的矢量化，
-化合物的增溶，
-化合物的稳定化，
-化合物的提取和/或纯化的改进，
-化合物的ADME(施用、分布、代谢、排泄)参数中的至少一个的改进；
-增添化合物的生物活性；
-增添点击化学的适当功能性。
包含这些标签和根据本发明的化合物因此可以用作用于检测、所关注试剂的矢量化、增溶、稳定化、提取和/或纯化的改进、ADME(施用、分布、代谢、排泄)参数中的至少一个的改进；增添生物活性；和/或增添点击化学的适当功能性的工具。
适于允许检测本发明化合物的化学基团可为可以通过本领域中已知的任何分析技术来鉴定和/或定量的任何化学基团。在用于检测的标签中可以提到荧光如荧光探针，例如荧光素、量子点、花青染料和Alexa染料、染料、染料、染料、染料、染料、染料、尼罗红、FL或羧基四甲基罗丹明(TAMRA)；核磁共振(NMR)标签，例如氙或镧系元素(特别是铽Tb或铕Eu)；磁共振成像(MRI)造影剂，例如Gd螯合物；质谱标签，例如三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻(TMPP)或同位素编码的标签；红外(IR)标签；正电子发射断层扫描(PET)标签；单光子发射计算机断层扫描(SPECT)标签；氚或氘原子；显微镜标签，例如金纳米粒子；淬灭剂，例如dabsyl(二甲基氨基偶氮苯磺酸)。
适于允许用本发明化合物进行所关注试剂的矢量化的化学基团可为适于帮助所述化合物和/或所关注试剂到达适当的组织或器官如肝脏或膀胱的任何化学基团或生物部分。例如，矢量化标签可为能够形成胶束、反胶束或脂质体的化学基团，例如两亲性化学基团、纳米粒子或微粒、病毒载体、聚合物、叶酸、铵基团、肽、EGFR(表皮生长因子受体)配体或抗体。
适于允许化合物的稳定化的化学基团是优选在体内增加化合物的半衰期的化学基团。例如，稳定化标签可为白蛋白，例如人血清白蛋白HSA或牛血清白蛋白BSA。
适于允许化合物的ADME参数的改进的化学基团可以例如是治疗剂；药物；前药；式-(OCH2-CH2)n-OR”的聚乙二醇，其中R”是氢原子或烷基基团，其中n是1至1000，优选地1至100，特别是1至8；肽，例如脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(Pro-Ala-Ser)或聚谷氨酸；多肽，例如XTEN重组多肽；脂质，例如棕榈酸、碳水化合物、羟乙基淀粉；核酸，例如DNA或RNA，特别是siRNA。术语“前药”是指可以在体内转化成药物的药物变体。术语“肽”是指包含1至20个、优选地1至10个氨基酸的肽。
取决于所希望的ADME改进饰，本领域普通技术人员可以容易地调节适当标签的选择，例如测定乙二醇部分的数目。
适于允许化合物的提取和/或纯化的化学基团可为有利于和/或促进本发明化合物的提取和/或纯化的任何化学基团。在提取和/或纯化标签中可以提到生物素，螯合标签如DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、EDTA(乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)和D4(八甲基环四硅氧烷)，蛋白质标签如聚精氨酸或聚组氨酸标签(优选地His6或His10标签)、FLAG标签、Strep标签、c-myc标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、SBP标签、几丁质结合结构域、谷胱甘肽S转移酶标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA和DsbA标签，硼酸标签如[(3-氧代螺[异苯并呋喃-1(3H),9′-[9H]呫吨]-3′,6′-二基)双(亚氨基亚甲基-2,1-亚苯基)]双-(9Cl)，全氟烷基基团，离子(阳离子或阴离子)基团如铵基团，和固体表面如聚合材料，特别是聚乙烯珠粒，纳米粒子，特别是磁性纳米粒子，芯片，二氧化硅珠粒或二氧化硅晶片。
适于增添生物活性的化学基团可为例如包含至少一个放射性同位素如131I、90Y、89Sr或153Sm的化学基团或其衍生物。
适于在点击化学中反应的化学基团可为例如选自由叠氮化物(例如N3)和变形炔烃特别是环状炔烃组成的群组的化学基团。在环状炔烃中可提到例如双环壬炔(BCN)和四甲基硫杂环庚烯鎓(TMTI)部分。
在一个实施方案中，R1至R5中的每一个在由以下组成的群组中独立地选择：
-炔烃基团，
-氨基基团，
-羟基胺(-ONH2)基团，
-肼(-NH-NH2)基团，
-叠氮基(N3)基团，
-重氮(N2 +)基团，优选地在平衡离子的存在下，
-马来酰亚胺基团，
-羧酸基团，
-醛(-CHO)基团，
-硼酸-B(OR”)2基团，其中R”如上文所述，和
-活化酯。
在一个优选的实施方案中，R1至R5都不包含游离SH基团。在一个优选的实施方案中，R1和/或R5不包含任何亲核基团，例如氨基基团、羟基胺基团、肼基团或羟基基团。
在特定实施方案中，R1至R5中的1、2、3、4或5个不同于氢原子。
在特定实施方案中，R1至R5中的至少一个包含适于与在由硫醇(SH)部分、胺(NH2)部分和羧酸(COOH)部分组成的群组中选择的化学基团进一步形成共价键的至少一个部分。在适于与硫醇部分形成共价键的部分中，可以提到马来酰亚胺部分。在适于与胺部分形成共价键的部分中，可以提到NHS酯部分。
在根据本发明的式(I)化合物中可提到以下化合物：
在式(I)化合物中也可提到以下化合物：
本发明化合物的合成
根据本发明的式(I)或(II)的化合物可以例如从相应的碘芳烃通过与炔丙醇偶联(例如经由Sonogashira偶联)以两个步骤合成。偶联之后优选接着进行氧化；例如，氧化可为在氨溶液存在下用MnO2进行的串联氧化。可选地，本发明化合物可通过芳基炔烃的氰化合成。可例如用CuCN、芳基异氰酸酯、氰基苯并三唑或氰基咪唑进行氰化。
包含至少一个硫醇部分的化合物的标记
式(I)化合物可用于标记包含至少一个硫醇SH部分的化合物的方法中。优选地，本发明的方法包括使至少一种式(I)化合物与包含至少一个硫醇SH部分的化合物或易于包含这种化合物的样品接触。
优选地，所述样品是生物样品，特别是水性样品。
在本发明中的术语“标记”是指硫醇部分的硫原子与式(I)化合物的丙炔腈部分之间的共价键的形成。
包含硫醇部分的化合物(R6-SH化合物)可为例如荧光团、淬灭剂、氨基酸、肽、蛋白质、酶、药物、前药和/或药物代谢物。
R6可为键合至硫醇(SH)基团以形成“包含硫醇部分的化合物”的任何化学基团。R6优选包含碳、氢、氧、氮、磷和/或硫原子。
特别是，包含硫醇部分的化合物可为半胱氨酸、或其衍生物如酯、或包含至少一个半胱氨酸残基的肽或蛋白质。可选地，包含硫醇部分的化合物可为呈现至少一个游离SH基团的表面。
用式(I)化合物标记包含硫醇部分的化合物可用于多种应用。
在第一实施方案中，用式(I)化合物标记包含硫醇部分的化合物可用于检测和/或定量样品中包含硫醇部分的化合物。检测在本发明中意味着鉴定所希望的化合物在样品中的存在或不存在。
所述样品可为容许包括包含至少一个硫醇部分的化合物的任何样品。例如，所述样品可为生物样品，例如生物流体如血液、血浆、血清、唾液、尿液等，天然产物的提取物，生物组织，或其部分，或包含细胞的培养基。
在第二实施方案中，用式(I)化合物标记包含硫醇部分的化合物可用于包含硫醇部分的化合物与改进其物理-化学特性的部分的结合。例如，所述结合部分可改进包含硫醇部分的化合物的溶解性，或改进其合成和/或纯化。
在第三实施方案中，用式(I)化合物标记包含硫醇部分的化合物可用于包含硫醇部分的化合物与所关注化合物如药物、前药、碳水化合物或蛋白质的生物结合。
例如，包含所关注化合物作为标签的式(I)化合物可允许所关注化合物与包含至少一个硫醇部分的化合物的选择性矢量化和/或结合。
本发明的另一个目的是如上文所定义的式(I)化合物其包括所述特定实施方案。
本发明还公开式(II)化合物其中R1至R5中的每一个在由以下组成的群组中独立地选择：
-氢原子，
-烷基、烯烃或炔烃基团，任选地间杂有选自O、N和S的至少一个杂原子，
-芳基基团，
-烷氧基基团，
-卤素原子，
-氨基(-NRR')基团，其中R和R'独立地是氢原子或烷基、烯烃、炔烃或如上文所定义的芳基基团，
-羟基胺(-ONH2)基团，
-肼(-NH-NH2)基团，
-硝基(-NO2)基团，
-叠氮基(-N3)基团，
-重氮(-N2 +)基团，任选地在平衡离子的存在下，
-马来酰亚胺基团，
-烷基-羧基或芳基-羧基(-C(＝O)OR)基团，
-烷基-羰基或芳基-羰基(-C(＝O)R)基团，
-羟基(-OH)基团，
-硼酸-B(OR”)2基团，其中R”是氢原子或烷基基团，
-膦或鏻基团，
-异氰酸酯(-N＝C＝O)或异硫氰酸酯(-N＝C＝S)基团，
-氯磺酰基(-SO2Cl)基团，
--O-C(＝O)-C(N2)-CF3基团或-C(＝O)-C(N2)-CF3基团，
-活化酯如-C(＝O)-NHS、全氟化酯和酰脲，
-标签，和
-被先前所列出基团中的至少一个取代的烷基基团。
所述式(II)化合物是可加成至少一个标签以形成如上所述的式(I)化合物的连接子。
在根据本发明的式(II)化合物中可提到以下化合物：
在根据本发明的式(II)化合物中也可提到以下化合物：
根据本发明的用于标记包含硫醇部分的化合物的方法还可包括：在使包含硫醇部分的化合物与式(I)化合物接触的步骤之前，制备所述式(I)化合物的预备步骤，其包括使式(II)化合物与包含标签部分的化合物或其前体接触。
术语“前体”在本情况下是指在与式(II)化合物接触后能够形成标签部分的化学基团。
优选地，R1至R5中的至少一个不同于氢原子。
本发明的一个目的是式(II)化合物，其中R1至R5中的至少一个包含并且优选是马来酰亚胺、叠氮化物(N3)基团、炔烃或NHS酯部分。
所述马来酰亚胺和NHS酯部分分别允许所述化合物与另一个硫醇或胺基团进一步连接；所述N3基团允许所述化合物与另一个炔烃基团进一步连接并且所述炔烃基团允许所述化合物与另一个N3基团进一步连接。
在一个实施方案中，根据本发明的式(II)化合物选自以下化合物：
本发明还涉及式(I)或(II)的化合物，其中R1至R5中的至少一个进一步键合至所关注的化合物。
所关注的化合物可为例如分子如荧光团(例如罗丹明)，包含至少一个放射性原子(例如14C、3H或131I)的原子团，已知质量的原子团(质量标签)，配体，药物，治疗剂，生物分子如抗体，蛋白质如BSA(牛血清白蛋白)，DNA片段，纳米物体如纳米粒子(即0.1至1000nm的物体或粒子)，或支撑物如聚合物。
当用这种式(I)或(II)的化合物(其中R1至R5中的至少一个进一步键合至所关注的化合物)进行根据本发明的标记方法时，所述方法提供所关注化合物与包含硫醇部分的化合物之间的结合物的形成。
在一个实施方案中，所关注化合物是生物分子如蛋白质或抗体，并且包含硫醇部分的化合物是荧光团如包含TAMRA部分和硫醇部分的化合物(TAMRA-SH)。
在一个实施方案中，所关注化合物是生物分子如蛋白质或抗体，并且包含硫醇部分的化合物是药物或治疗剂。通过根据本发明的标记方法获得的结合物是治疗性抗体。
本发明的另一个目的是式(III)化合物：
其中R6-S对应于包含如上文所定义的至少一个硫醇部分的化合物的部分。特别是，所述式(III)化合物具有式(IV)：
其中R7和R8在由OH、标签、烷基、O-烷基和肽部分组成的群组中选择，其中所述烷基基团可被至少一个标签部分取代。肽部分是包含至少一个氨基酸的部分，当所述部分呈现一个以上氨基酸(2、3、4、5、……)时，所述氨基酸通过肽键彼此连接。优选地，式(III)或(IV)的化合物的双键具有(Z)构型。所述标签和烷基基团如上文所定义。
在根据本发明的式(III)化合物中可提到以下化合物：
已经令人惊讶地发现，所述式(I)化合物在水性介质中比相应化合物更稳定，在所述相应化合物中3-芳基丙炔腈部分被马来酰亚胺部分置换，其通常用于标记硫醇部分。例如，化合物1在缓冲溶液中在1小时后水解约25％(k观测＝7×10-5s-1)，而对于化合物11未能检测到水解。有趣的是，即使在室温下一周后，对于化合物11也未能检测到水解产物的踪迹。
另外，相比于不包含游离硫醇部分的其他氨基酸，根据本发明的式(II)化合物显示对于半胱氨酸的显著选择性。相比较而言，对于其中3-芳基丙炔腈部分被马来酰亚胺部分置换的相应化合物获得的化学选择性较低。
最后，如上所述的式(III)化合物已证实在生物条件下比其中3-芳基丙炔腈部分被马来酰亚胺部分置换的相应化合物更稳定。例如，化合物与半胱氨酸衍生物3之间的加成产物在广泛多种条件如生理条件下特别稳定。特别是，所述加成产物在广泛多种pH(0至14)中是稳定的，并且在与过量的苯基硫醇和谷胱甘肽反应一小时后未能观测到交换产物。
将参考以下实施例更详细地说明本发明，但应理解，本发明不被认为受所述实施例限制。
实施例
实施例1：本发明化合物的合成
式(II)化合物的合成
合成一系列式(I)或(II)的化合物并且根据以下程序表征。
一般方案：
Sonogashira偶联
标准反应方案：
A.向经过脱气的适当芳基卤化物(1当量，1mmol)于DMF(5mL)和DIPEA(10当量，10mmol)中的溶液中添加预混合的PdCl2(PPh3)2(0.03当量，30μmol)和CuI(0.06当量，60μmol)。将所得反应物质脱气，再搅拌5分钟，接着添加炔丙醇(1.2当量，1.2mmol)。将反应物质搅拌1-24小时(通过TLC监测)。添加1MHCl(50mL)(如果含有游离氨基基团，则改为添加50mL水)并且用乙酸乙酯(3×20mL)萃取反应混合物。将合并的乙酸乙酯部分用水(1×10mL)洗涤，经MgSO4干燥并蒸发，得到粗产物。通过快速色谱法(从100％环己烷至100％乙酸乙酯的梯度，20分钟)纯化产物。
B.向经过脱气的适当的芳基卤化物(1当量，1mmol)于THF(5mL)和TEA(5mL)中的溶液中添加预混合的PdCl2(PPh3)2(0.03当量，30μmol)和CuI(0.06当量，60μmol)，接着添加炔丙醇(2当量，1.2mmol)。将反应物质搅拌1-24小时(通过TLC监测)。蒸发THF和TEA并且通过快速色谱法(从100％环己烷至100％乙酸乙酯的梯度，20分钟)纯化粗产物。
C.向经过脱气的适当的芳基卤化物(1当量，1mmol)于丙胺或吡咯烷(3mL)中的溶液中添加Pd(PPh3)4(0.05当量，50μmol)。将反应物质加热过夜(30-50℃)，蒸发并且通过快速色谱法(从100％环己烷至100％乙酸乙酯的梯度，20分钟)纯化粗产物。
高活性MnO2的制备
在通风橱中在搅拌下在10分钟内向KMnO4(1当量，1摩尔，160g)于水(2L)中的60℃溶液中逐渐添加MnCl2 .4H2O(1当量，1摩尔，200g)于水(2L)中的70℃溶液。剧烈反应，随之氯气溢出；将悬浮液搅拌2小时并且在室温下保持过夜。过滤出沉淀物，用水(4L)充分洗涤直至pH6.5-7并且洗涤得到可忽略的氯化物测试。然后将滤饼在120-130℃下干燥18小时；这得到巧克力褐色的高度分散的无定形粉末。
MnO2氧化
由McAllister等描述的稍微修改的程序824。向适当的炔丙醇(1当量，1mmol)于THF(4.5mL)中的溶液中添加MgSO4(15当量，15mmol)、高活性MnO2(25当量，25mmol)和NH3于IPA(4当量，4mmol，2mL)中的2M溶液。所得反应物质在室温下剧烈搅拌0.5-12小时(通过TLC监测)。添加DCM(20mL)并且所得反应物质经硅藻土过滤，蒸发，得到粗产物并且在需要时通过快速色谱法纯化。
被取代的3-(芳基)丙-2-炔-1-醇(1a-12a)：
3-(2-甲氧基苯基)丙-2-炔-1-醇(1a)
反应时间：18小时；产率：72％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.36(dd,J＝1.5,7.5Hz,1H),7.26-7.33(m,1H),6.97(d,J＝8.3Hz,1H),6.86-6.93(m,1H),4.43(s,2H),3.84(s,3H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ161.6,134.5,131.0,121.5,113.4,112.0,92.7,82.0,56.2,51.5。
3-(3-甲氧基苯基)丙-2-炔-1-醇(2a)
反应时间：16小时；产率：87％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.15-7.24(准t,J＝7.5Hz,1H),7.00(d,J＝7.5Hz,1H),6.93-6.98(m,1H),6.87(dd,J＝2.13,7.5Hz,1H),4.41(s,2H),3.73(s,3H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ160.9,130.6,125.4,125.1,117.8,115.7,88.8,85.6,55.9,51.4。
3-(4-甲氧基苯基)丙-2-炔-1-醇(3a)
反应时间：16小时；产率：92％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.40(d,J＝8.78Hz,2H),6.86(d,J＝8.78Hz,2H),4.51(d,J＝4.9Hz,2H),3.83(s,3H),1.78(t,J＝4.9Hz,1H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ159.8,133.2,114.6,114.0,85.9,85.7,55.3,51.7。
3-(2-氨基苯基)丙-2-炔-1-醇(4a)
反应时间：24小时；产率：62％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.19(dd,J＝1.25,7.9Hz,1H),7.03-7.12(m,1H),6.75(d,J＝7.9Hz,1H),6.56-6.65(m,1H),4.47(s,2H),4.26(s,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ150.3,133.0,130.6,118.2,115.6,93.8,78.9,69.5,51.0。
3-(3-氨基苯基)丙-2-炔-1-醇(5a)
反应时间：18小时；产率：77％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.08(t,J＝7.8Hz,1H),6.83(d,J＝7.8Hz,1H),6.76(s,1H),6.64(dd,J＝1.5,7.8Hz,1H),4.46(s,2H),2.17(s,1H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ146.3,129.2,123.4,122.0,118.0,115.5,87.0,85.6,51.4。
3-(4-氨基苯基)丙-2-炔-1-醇(6a)
反应时间：18小时；产率：42％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.11-7.21(d,J＝8.5Hz,2H),6.53-6.68(d,J＝8.5Hz,2H),4.37(s,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ149.7,133.8,115.7,112.5,86.7,85.9,51.4。
3-(2-硝基苯基)丙-2-炔-1-醇(7a)
反应时间：15小时；产率：35％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.97(d,J＝8.0Hz,1H),7.54-7.60(d,J＝8.0Hz,1H),7.46-7.54(t,J＝8.0Hz,1H),7.36-7.44(t,J＝8.0Hz,1H),4.49(s,2H),1.68(br.s.,1H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ149.9,134.8,132.8,128.9,124.6,118.0,95.2,80.9,51.7。
4-(3-羟基丙-1-炔基-1-基)-N-甲基苯甲酰胺(8a)
反应时间：12小时；产率：91％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.72-7.82(m,J＝8.28Hz,2H),7.41-7.53(m,J＝8.28Hz,2H),4.43(s,2H),2.92(s,3H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ169.9,135.2,132.7,128.3,127.6,91.5,84.7,51.3,27.1。
N-(4-(3-羟基丙-1-炔基-1-基)苯基)乙酰胺(9a)
反应时间：18小时；产率：85％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.56-7.64(d,J＝8.8Hz,2H),7.47-7.56(d,J＝8.8Hz,2H),4.74(s,2H),2.04(s,3H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ171.9,143.8,135.7,120.7,112.8,106.2,84.5,62.7,24.1。
3-(邻甲苯基)丙-2-炔-1-醇(10a)
反应时间：5小时；产率：70％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.40(d,J＝7.5Hz,1H),7.11-7.24(m,3H),4.54(s,2H),2.43(s.,3H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ138.2,131.2,128.4,128.0,119.3,115.3,86.5,85.2,51.2,21.2。
3-(2,6-二甲基苯基)丙-2-炔-1-醇(11a)
反应时间：24小时；产率：25％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.03(t,J＝7.5Hz,1H),6.95(d,J＝7.5Hz,2H),4.50(s,2H),2.34(s,7H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ140.5,127.9,126.7,122.3,95.6,83.3,51.9,21.1。
3-(2,6-二甲氧基苯基)丙-2-炔-1-醇(12a)
反应条件：30℃，丙胺，16小时；产率：38％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.25(t,J＝8.4Hz,1H),6.62(d,J＝8.4Hz,2H),4.46(s,2H),3.84(s,6H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ163.0,131.0,104.7,102.5,97.0,78.1,56.4,51.7。
被取代的3-芳基-丙炔腈(1-12)：
3-(2-甲氧基苯基)丙炔腈(1，APN-o-OMe)
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.51-7.65(m,2H),7.12(d,J＝8.3Hz,1H),7.01(t,J＝7.7Hz,1H),3.94(s,4H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ164.7,136.4,135.3,122.0,112.6,107.7,106.4,81.8,66.7,56.7；IR(纯膜，cm-1):2946,2264,21421596,1490,1245,1164,1122,1047,1021,752,498；GC-ESI-HRMS:157.05276；实验值157.05044。
3-(3-甲氧基苯基)丙炔腈(2，APN-m-OMe)
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.38(t,J＝7.8Hz,1H),7.27(d,J＝7.8Hz,1H),7.20-7.24(m,1H),7.12-7.20(m,1H),3.83(s,3H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ161.2,131.4,127.1,120.0,119.4,119.2,106.0,84.1,62.7,56.1；IR(纯膜，cm-1):2491,2264,2144,1595,1573,1488,1464,1420,1324,1294,1207,1178,1045,783,681,494；GC-ESI-HRMS:157.05276；实验值157.05298。
3-(4-甲氧基苯基)丙炔腈(3，APN-p-OMe)
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.46-7.70(m,J＝8.8Hz,2H),6.86-6.96(m,J＝8.8Hz,2H),3.86(s,3H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ161.4,134.4,113.7,108.2,104.8,82.7,61.5,54.5；IR(纯膜，cm-1):2985,2358,2342,2263,2178,2149,1603,1514,1307,1270,1180,1028,835,808,669,424；GC-ESI-HRMS:157.05276；实验值157.05337。
3-(2,6-二甲氧基苯基)丙炔腈(4，APN-o,o'-diOMe)：
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.38(t,J＝8.5Hz,1H),6.53(d,J＝8.5Hz,2H),3.88(s,6H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ164.4,133.8,106.2,103.4,96.5,77.7,70.5,56.2；IR(纯膜，cm-1):2847,2359,2259,2201,2139,1926,1586,1574,1478,1432,1302,1255,1188,1109,1025,778,727,648,632,545,506,488,420；GC-ESI-HRMS:187.06333；实验值184.06465。
3-(2-氨基苯基)丙炔腈(5，APN-o-NH2)
1HNMR(500MHz,甲醇-d4)δ6.81(d,J＝7.88Hz,1H),6.65-6.76(m,1H),6.08-6.19(m,2H),3.85(br.s.,1H)；13CNMR(126MHz,氯仿-d)δ151.4,134.0,133.4,118.2,115.0,105.8,101.0,81.6,68.5；IR(纯膜，cm-1):3413,3332,3211,2925,2853,2250,2136,1632,1600,1563,1486,1452,1312,1273,1252,1161,740,673,493；GC-ESI-HRMS:142.05310；实验值142.05458。
3-(3-氨基苯基)丙炔腈(6，APN-m-NH2)
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.17(t,J＝7.6Hz,1H),6.99(d,J＝7.6Hz,1H),6.74-6.89(m,2H),3.85(br.s.,2H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ146.8,129.8,123.6,118.7,118.7,118.0,105.7,83.7,62.3；IR(纯膜，cm-1):3426,3340,2923,2852,2265,2142,1630,1594,1579,1513,1448,1326,1313,1300,1220,1164,993,882,862,784,680,534,456；GC-ESI-HRMS:142.05310；实验值142.05197。
3-(4-氨基苯基)丙炔腈(7，APN-p-NH2)
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.26(d,J＝8.6Hz,2H),6.51(d,J＝8.6Hz,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ152.5,135.1,113.6,105.6,102.3,86.3,60.2；IR(纯膜，cm-1):3431,3333,3211,2250,2132,1632,1599,1513,1438,1303,1178,1043,949,826,814,526,495,452；GC-ESI-HRMS:142.05310；实验值142.05464。
3-(邻甲苯基)丙炔腈(8，APN-o-Me)
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.47(d,J＝7.78Hz,1H),7.28-7.36(m,1H),7.18(d,J＝8.03Hz,1H),7.08-7.16(m,1H),2.39(s,3H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ143.4,134.1,131.8,130.1,126.1,117.4,105.6,82.4,66.4,20.5；IR(纯膜，cm-1):2295,2257,2141,1599,1484,1456,1383,1291,1199,1162,1116,1039,757,711,672,548,490,452；GC-ESI-HRMS:141.05785；实验值141.05926。
3-(2,6-二甲基苯基)丙炔腈(9，APN-o,o'-diMe)
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.12-7.27(t,J＝7.5Hz,1H),7.01(d,J＝7.5Hz,2H),2.38(s,6H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ143.8,131.2,127.3,117.6,105.6,81.5,70.2,20.8；IR(纯膜，cm-1):2923,2856,2261,2138,1732,1595,1468,1381,1265,1168,1033,774,728,490；GC-ESI-HRMS:155.07350；实验值155.07507。
3-(2-硝基苯基)丙炔腈(10，APN-o-NO2)
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.28-8.35(m,1H),7.96-8.06(m,1H),7.81-7.90(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ151.9,138.3,135.2,134.1,126.6,114.2,105.7,79.0,68.6；IR(纯膜，cm-1):2268,1604,1567,1528,1502,1480,1345,851,787,744,709,687,537,491；GC-ESI-HRMS:172.02728；实验值172.02869。
N-(4-(氰基乙炔基)苯基)乙酰胺(11，APN-p-NHAc)
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.56-7.63(m,J＝8.8Hz,2H),7.49-7.56(m,J＝8.8Hz,2H),2.04(s,3H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ171.9,143.8,135.7,120.7,112.8,106.2,84.5,62.7,24.1；IR(纯膜，cm-1):3303,3174,3098,2278,2262,2139,1670,1594,1535,1407,1364,1321,1263,1177,834,534；GC-ESI-HRMS:184.06366；实验值184.06212。
4-(氰基乙炔基)-N-甲基苯甲酰胺(12，APN-p-CONHMe)：
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.96-8.05(m,J＝7.78Hz,2H),7.85-7.93(m,J＝7.78Hz,2H),3.03(s,3H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ169.1,138.3,134.9,129.0,121.6,105.9,83.0,64.6,28.8；IR(纯膜，cm-1):3348,2270,1641,1549,1502,1408,1392,1327,1303,1283,1162,854,760,617,488；GC-ESI-HRMS:184.06366；实验值184.06465。
3-(4-碘苯基)丙炔腈(13)：
根据MnO2氧化的一般程序来合成产物。反应时间：30分钟；产率：61％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.78(d,J＝8.5Hz,2H),7.32(d,J＝8.5Hz,3H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ138.1,134.4,116.8,105.2,99.2,81.9,64.2。
化合物13可用于根据本发明的标记方法(利用放射性同位素125I)。
3-(4-(三氟甲基)苯基)丙炔腈(14)：
根据MnO2氧化的一般程序来合成产物。反应时间：1小时；产率：45％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.76(d,J＝8.3Hz,2H),7.70(d,J＝8.3Hz,2H)。
化合物14可用于根据本发明的标记方法(利用放射性同位素18F)。
4-(3-羟基丙-1-炔基-1-基)苯甲酸叔丁酯(15a)：
根据用于偶联的一般程序B来合成产物。产率：98％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.93(d,J＝8.1Hz,2H),7.47(d,J＝8.1Hz,2H),4.53(s,2H),1.60(s,9H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ＝165.1,131.7,131.4,129.3,126.6,89.8,85.1,81.4,51.6,28.1。
4-(氰基乙炔基)苯甲酸叔丁酯(15)：
根据MnO2氧化的一般程序来合成产物。反应时间：15分钟；产率：48％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.00(d,J＝8.3Hz,2H),7.94(d,J＝8.3Hz,2H),1.56(s,9H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ＝164.3,134.8,133.3,129.7,121.3,105.2,82.2,81.9,64.8,28.1。
4-(氰基乙炔基)苯甲酸(16)：
向4-(2-氰基乙-1-炔基-1-基)苯甲酸叔丁酯(1当量，350mg，1.54mmol)于MeCN(14mL)中的溶液中添加TFA(30.6当量，5.372g，3.5mL，47.1mmol)。将混合物在室温下搅拌36小时，然后过滤并用3×2mL的Et2O洗涤。沉淀物由纯的4-(2-氰基乙-1-炔基-1-基)苯甲酸(140mg，0.823mmol，53％产率)组成。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝8.12(d,J＝8.3Hz,3H),7.83(d,J＝8.3Hz,2H)。
4-(氰基乙炔基)苯甲酸全氟苯酯(17)：
将五氟苯酚(1当量，89.2mg，0.484mmol)和4-(2-氰基乙-1-炔基-1-基)苯甲酸(1当量，82.9mg，0.484mmol)于THF(4.84mL)中的溶液冷却至0℃并且向混合物中添加DCC(1当量，99.9mg，0.484mmol)。将所得溶液在室温下搅拌14小时，然后过滤并用Et2O洗涤。蒸发滤液，得到呈白色固体状的4-(2-氰基乙-1-炔基-1-基)苯甲酸五氟苯酯(120mg，0.358mmol，74％产率)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.29(d,J＝8.3Hz,2H),8.08(d,J＝8.3Hz,2H)。
化合物17可用于根据本发明的生物结合方法。
4-((4-(氰基乙炔基)苯甲酰基)氧基)-2,3,5,6-四氟苯磺酸钠(18)：
向4-(2-氰基乙-1-炔基-1-基)苯甲酸(1当量，54.2mg，0.317mmol)和2,3,5,6-四氟-4-羟基苯-1-磺酸钠(1当量，84.9mg，0.317mmol)于无水DMF(0.792mL)中的溶液中添加DCC(1当量，65.3mg，0.317mmol)。将所得混合物在室温下搅拌36小时，然后冷却至0℃，搅拌1小时，过滤并用0.8mL的无水DMF洗涤。将滤液用16mLEt2O稀释，搅拌15分钟以完全结晶并且过滤沉淀物，得到呈白色固体状的4-((4-(氰基乙炔基)苯甲酰基)氧基)-2,3,5,6-四氟苯磺酸钠(72.5mg，0.172mmol，54％产率)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.31(d,J＝6.3Hz,2H),8.09(d,J＝6.3Hz,2H)。
化合物18可用于根据本发明的生物结合方法。
N-((1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰胺(20)：
将5-(二甲基氨基)-N-(丙-2-炔基-1-基)萘-1-磺酰胺(1当量，395mg，1.37mmol)和3-(4-叠氮基苯基)丙-2-炔腈(1当量，230mg，1.37mmol)溶解在tBuOH(6.91mL)中。向这种混合物中添加五水合硫酸铜(10％，34.2mg，0.137mmol)于0.5mL水中的溶液，接着添加抗坏血酸钠(0.5当量，135mg，0.685mmol)于0.5mL水中的溶液。将所得溶液搅拌2小时，然后在旋转蒸发仪上浓缩。用DCM萃取残余物。将有机层用饱和NH4Cl水溶液和水洗涤，经MgSO4干燥并蒸发，得到呈绿色固体状的20(544mg，1.19mmol，87％产率)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.59(br.s.,1H),8.34(d,J＝7.3Hz,1H),8.33(s,1H)8.26(d,J＝8.8Hz,1H),8.13(d,J＝7.3Hz,1H),8.00(d,J＝8.8Hz,2H),7.83(d,J＝8.8Hz,2H),7.61-7.51(m,2H),7.18(d,J＝7.5Hz,1H),4.21(s,2H),2.71(s,6H)。13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ＝151.2,144.8,138.4,135.7,135.6,129.4,128.9,128.8,128.6,127.8,123.4,121.3,119.9,119.0,116.0,114.9,105.3,82.5,63.1,44.9,37.6。
化合物20可用于根据本发明的检测方法(例如用染料)。
3-(4-异硫氰酸根合苯基)丙炔腈(21)：
在50mLRB烧瓶中，将碳酸氢钠(886mg，10.55mmol)于10mL水中的溶液搅拌10分钟并且向其中添加二氯甲烷(10mL)，接着添加3-(4-氨基苯基)丙-2-炔腈(500mg，3.52mmol)。将反应混合物冷却至0℃，经30分钟的时期逐滴引入硫光气(402μL，5.28mmol)并且在室温下连续搅拌1小时。将有机相分离并且经无水MgSO4干燥。浓缩溶液，得到黄色固体形式的纯21(609mg，3.31mmol，94％产率)。
1HNMR(400MHz,乙腈-d3)δ＝7.71(d,J＝8.5Hz,2H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H)。
化合物21可用于根据本发明的生物结合方法。
(1-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-1-硫代-6,9,12-三氧杂-2-氮杂十五烷-15-基)氨基甲酸叔丁酯(22)：
将(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(1当量，91.5mg，0.271mmol)溶解在DCM(2mL)中并冷却至0℃。向这种溶液中缓慢添加含3-(4-异硫氰酸根合苯基)丙-2-炔腈(1当量，50mg，0.271mmol)的1mLDCM并且将混合物搅拌30分钟。将反应混合物浓缩至1mL并且通过快速色谱法(DCM/MeOH梯度，100/0至90/10)纯化残余物，得到呈黄色油状的(1-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-1-硫代-6,9,12-三氧杂-2-氮杂十五烷-15-基)氨基甲酸叔丁酯(126mg，0.25mmol，92％产率)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝7.66(s,4H),3.65-3.54(m,12H),3.50(t,J＝6.1Hz,2H),3.12(t,J＝6.8Hz,2H),1.91(quin,J＝6.1Hz,2H),1.72(quin,J＝6.4Hz,2H),1.45(s,9H)。
13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ＝182.0,158.5,144.6,135.6,106.4,84.8,80.0,71.6,71.5,71.3,71.3,70.0,68.2,63.0,38.8,31.0,29.8,29.0。
4-(氰基乙炔基)苯甲酰氯(23)：
将4-(2-氰基乙-1-炔基-1-基)苯甲酸(1当量，30mg，0.175mmol)溶解在DCM(2mL)中并且添加SOCl2(31.5当量，400μL，5.51mmol)。将混合物在回流下搅拌，直至固体完全溶解，然后蒸发，得到呈白色固体状的纯23(29.6mg，0.156mmol，89％产率)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.08(d,J＝8.3Hz,2H),7.67(d,J＝8.3Hz,2H)。
化合物23可用于根据本发明的生物结合方法。
(1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-1-氧代-6,9,12-三氧杂-2-氮杂十五烷-15-基)氨基甲酸叔丁酯(24)：
将(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(1当量，50mg，0.156mmol)和NEt3(5当量，78.9mg，0.108mL，0.78mmol)溶解在1mLDCM中并冷却至-78℃。向这种溶液中缓慢添加含23(1当量，29.6mg，0.156mmol)的1mLDCM。将混合物逐渐升温至室温并搅拌2小时。然后将反应混合物注入快速色谱柱中并用DCM/MeOH(梯度100/0至90/10)洗脱，得到呈黄色油状的纯24(40.6mg，0.086mmol，55％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝7.92(d,J＝8.3Hz,2H),7.82(d,J＝8.3Hz,2H),3.72-3.45(m,14H),3.12(t,J＝6.8Hz,2H),1.90(quin,J＝6.3Hz,2H),1.72(quin,J＝6.4Hz,2H),1.44(s,9H)。
4-(氰基乙炔基)-N-(15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂三十九碳-24,26-二炔基-1-基)苯甲酰胺(25)：
将4-(2-氰基乙-1-炔基-1-基)苯甲酸(1当量，29.7mg，0.173mmol)悬浮在DCM中并且添加SOCl2(39.8当量，820mg，0.5mL，6.89mmol)。将混合物在回流下搅拌1.5小时，蒸发，溶解在DCM中，并且在-78℃下添加至N-(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基)二十五碳-10,12-二炔酰胺(1当量，100mg，0.173mmol)和TEA(4当量，70.2mg，0.0964mL，0.693mmol)于DCM中的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌1小时并蒸发。通过快速色谱法(DCM/MeOH：10/0至9/1)纯化残余物，得到呈黄色油状的所需产物(35.4mg，0.0485mmol，28％产率)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.90(d,J＝8.3Hz,2H),7.67(d,J＝8.3Hz,2H),7.48(br.s,1H),6.18(br.s,1H),3.71-3.45(m,14H),3.32(t,J＝6.0Hz,2H),2.23(t,J＝6.8Hz,4H),2.15(t,J＝7.5Hz,2H),1.90(td,J＝6.0,11.7Hz,2H),1.73(quin,J＝6.1Hz,2H),1.65-1.42(m,6H),1.41-1.32(m,4H),1.32-1.19(m,22H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H)。
化合物25可用于根据本发明的标记(例如光标记)方法或用于结合和/或固定化合物。
(4-(氰基乙炔基)苯基)氨基甲酸乙酯(26)：
向三光气(1当量，49.5mg，27.8μL，0.167mmol)于DCM(4mL)中的溶液中添加3-(4-氨基苯基)丙-2-炔腈(3当量，71.1mg，0.5mmol)于DCM(1mL)中的溶液。然后逐滴添加含三乙胺(6当量，101mg，138μL，1mmol)的1mLDCM。将混合物搅拌15分钟，允许形成异氰酸酯中间体，然后逐滴添加乙醇(0.1mL)。将反应混合物搅拌1小时，然后用2×5mL水洗涤并蒸发。通过快速色谱法纯化残余物，得到呈白色固体状的(4-(氰基乙炔基)苯基)氨基甲酸乙酯(102mg，0.48mmol，96％产率)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.56(d,J＝8.5Hz,2H),7.46(d,J＝8.5Hz,2H),6.79(br.s.,1H),4.26(q,J＝7.0Hz,2H),1.33(t,J＝7.0Hz,3H)。
1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-3-(丙-2-炔基-1-基)脲(27)：
向三光气(1当量，49.5mg，27.8μL，0.167mmol)于DCM(2mL)中的溶液中添加3-(4-氨基苯基)丙-2-炔腈(3当量，71.1mg，0.5mmol)于DCM(3mL)中的溶液。然后添加三乙胺(6当量，101mg，138μL，1mmol)，将混合物搅拌5分钟，然后添加含炔丙胺(4.69当量，43mg，50.1μL，0.782mmol)和三乙胺(2当量，33.7mg，46.3μL，0.333mmol)的1mLDCM。将反应混合物搅拌1小时，然后用5mL水洗涤，经MgSO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(DCM/MeOH梯度)纯化残余物，得到呈白色固体状的1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-3-(丙-2-炔基-1-基)脲(94.9mg，0.425mmol，85％产率)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝7.60(d,J＝8.8Hz,2H),7.52(d,J＝8.8Hz,2H),4.00(d,J＝2.4Hz,2H),2.61(t,J＝2.4Hz,1H)。
化合物27可用于根据本发明的点击化学。
(4-(氰基乙炔基)苯基)氨基甲酸丙-2-炔基-1-基酯(28)：
向三光气(1当量，49.5mg，27.8μL，0.167mmol)于DCM(2mL)中的溶液中添加3-(4-氨基苯基)丙-2-炔腈(3当量，71.1mg，0.5mmol)于DCM(3mL)中的溶液。然后添加三乙胺(6当量，101mg，138μL，1mmol)。将混合物搅拌5分钟，然后添加含2-丙炔-1-醇(6当量，56.1mg，59.1μL，1mmol)和三乙胺(2当量，33.7mg，46.3μL，0.333mmol)的1mLDCM。将反应混合物搅拌1小时，然后用5mL水洗涤，经MgSO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(环己烷/EtOAc梯度)纯化残余物，得到呈白色固体状的(4-(氰基乙炔基)苯基)氨基甲酸丙-2-炔基-1-基酯(104mg，0.465mmol，93％产率)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.57(d,J＝8.6Hz,2H),7.48(d,J＝8.6Hz,2H),4.80(d,J＝2.3Hz,2H),2.54(t,J＝2.3Hz,1H)。
化合物28可用于根据本发明的点击化学。
(4-(氰基乙炔基)苯基)氨基甲酸双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲酯(29)：
向三光气(1当量，34.8mg，19.5μL，0.117mmol)于DCM(4mL)中的溶液中添加3-(4-氨基苯基)丙-2-炔腈(3当量，50mg，0.352mmol)于DCM(1mL)中的溶液。然后逐滴添加三乙胺(6当量，71.2mg，97.8μL，0.703mmol)。将混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加含双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇(3当量，52.8mg，0.352mmol)和三乙胺(2当量，23.7mg，32.6μL，0.234mmol)的1mLDCM。将反应混合物在室温下搅拌2小时。在通过HPLC证实完全转化后，将混合物浓缩至1mL体积并通过快速色谱法(环己烷/EtOAc梯度)纯化，得到呈白色固体状的(4-(氰基乙炔基)苯基)氨基甲酸双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲酯(68.3mg，0.215mmol，183％)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.55(d,J＝8.8Hz,2H),7.47(d,J＝8.8Hz,2H),7.09(br.s,1H),2.38-2.14(m,6H),1.67-1.51(m,2H),1.42(quin,J＝8.7Hz,1H),1.04-0.91(m,2H)。
化合物29可用于根据本发明的点击化学(例如力引发的点击(strain-promotedclick))。
3-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)丙-2-炔-1-醇(30a)：
根据用于偶联的一般程序B来合成产物。产率：99％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.41(d,J＝8.4Hz,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),4.50(d,J＝5.5Hz,2H),1.89(t,J＝5.5Hz,1H),0.25(s,9H)。
3-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)丙炔腈(30)：
根据MnO2氧化的一般程序来合成产物。反应时间：3小时；产率：29％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.55(d,J＝8.4Hz,2H),7.48(d,J＝8.4Hz,2H),0.27(s,9H)。
13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ＝133.2,132.2,126.9,117.1,105.3,103.4,99.4,82.3,64.5,-0.3。
3,3'-(5-氨基-1,3-亚苯基)二丙炔腈(31)：
根据MnO2氧化的一般程序来合成产物。反应时间：3小时；产率：11％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.20(t,J＝1.3Hz,1H),6.98(d,J＝1.3Hz,2H),4.02(br.s.,2H)。
13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ＝147.1,127.5,121.6,119.5,105.0,81.0,63.6。
化合物31可用于根据本发明的再桥接(diAPN)。
3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊硼烷-2-基)苯基)丙炔腈(32)：
根据MnO2氧化的一般程序来合成产物。反应时间：4小时；产率：63％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.84(d,J＝8.2Hz,2H),7.60(d,J＝8.2Hz,2H),1.36(s,12H)。
3,3'-(1,2-亚苯基)二丙炔腈(33)：
33a：3,3'-(1,2-亚苯基)双(丙-2-炔基-1-醇)
向经过脱气的1,2-二碘苯(1当量，661mg，0.262mL，2mmol)和炔丙醇(2.3当量，272μL，4.61mmol)于丁胺(15.8mL)中的溶液中添加Pd(PPh3)4(4％，92.6mg，0.0801mmol)并且将所得反应物质回流过夜。蒸发溶剂并且通过快速色谱法(20分钟梯度EtOAc/环己烷)纯化所得粗产物，得到呈浅褐色固体状的33a(150mg，0.8mmol，40％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.38-7.53(m,2H),7.25-7.38(m,2H),4.48(s,4H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)d135.6,131.9,129.2,95.6,86.6,53.9；ESI-MS:C12H11O2 +[M+H]+,187.1；实验值187.1。
33：3,3'-(1,2-亚苯基)二丙炔腈
所述化合物以标准MnO2氧化方案的唯一产物形式获得。反应时间：75分钟。褐色固体，产率：42％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.89(dd,J＝3.30,5.80Hz,2H),7.73(dd,J＝3.30,5.80Hz,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ136.0,133.5,126.5,105.5,80.2,67.2；GC-ESI-MS:C12H5N2 +[M+H]+,177.0；实验值177.0。
3,3'-(1,3-亚苯基)二丙炔腈(34)：
34a：3,3'-(1,3-亚苯基)双(丙-2-炔基-1-醇)
与关于33a合成相同的程序。浅褐色固体，产率：55％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.47(s,1H),7.36-7.43(m,2H),7.29-7.36(m,1H),4.41(s,4H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ135.3,132.5,129.8,124.8,89.7,84.5,51.2；ESI-MS:C12H11O2 +[M+H]+,187.1；实验值187.0。
34：3,3'-(1,3-亚苯基)二丙炔腈
所述化合物以标准MnO2氧化方案的唯一产物形式获得。反应时间：2小时。褐色固体，产率：35％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.10(d,J＝1.50Hz,1H),7.93(dd,J＝1.50,8.00Hz,1H),7.63(t,J＝8.00Hz,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ139.3,137.8,131.2,120.0,105.7,81.7,64.2；GC-ESI-MS:C12H5N2 +[M+H]+,177.0；实验值177.1。
3,3'-(1,4-亚苯基)二丙炔腈(35)：
35a：3,3'-(1,4-亚苯基)双(丙-2-炔基-1-醇)
与关于33a合成相同的程序，但回流72小时。浅褐色固体，产率：35％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.39(s,4H),4.41(s,4H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ132.6,124.3,101.4,90.8,84.9,51.2；ESI-MS:C12H11O2 +[M+H]+,187.1；实验值187.1。
35：3,3'-(1,4-亚苯基)二丙炔腈
所述化合物以标准MnO2氧化方案的唯一产物形式获得。反应时间：2小时。褐色固体，产率：19％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.94(s,4H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ135.0,121.6,105.5,82.0,65.9；GC-ESI-MS:C12H5N2 +[M+H]+,177.0；实验值177.0。
化合物33-35可用于根据本发明的再桥接(diAPN)。
(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)苯基)丙酸叔丁酯(36b)：
经20分钟(使用加压注射器)向冷却至0℃的2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-(4-羟基苯基)丙酸叔丁酯(1当量，518mg，1.54mmol)于吡啶(2.5mL)中的溶液中逐滴添加三氟甲磺酸酐(1.1当量，476mg，0.28mL，1.69mmol)。使所得深色溶液升温至室温，倒入水(10mL)中，并且用乙酯(15mL)萃取。将醚萃取物用水(5mL)、1NHCl(2×5mL)、水(5mL)、盐水(5mL)依序洗涤，经MgSO4干燥并蒸发，得到呈深红色油状的目标产物(614mg，1.31mmol，85％)。所述产物未经进一步纯化而用于下一步骤中。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.03-7.18(m,3H),6.82-7.03(m,2H),4.87(d,J＝7.28Hz,1H),4.24(d,J＝7.03Hz,1H),2.65-2.95(m,2H),1.17(s,9H),1.21(s,9H)。
13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ170.5,148.5,137.3,131.3,121.1,120.3,117.1,82.5,80.0,54.7,38.1,28.3,27.9。
(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(4-(3-羟基丙-1-炔基-1-基)苯基)丙酸叔丁酯(36a)：
因此向三氟甲磺酸苯酚(phenoltryphlate)(1当量，136mg，0.291mmol)于吗啉(1mL)中的溶液中添加PdCl2(PPh3)2(5％，10.2mg，0.0145mmol)、CuI(10％，5.53mg，0.0291mmol)和炔丙醇(2当量，32.6mg，0.0343mL，0.581mmol)。将所得反应混合物脱气并且在60℃下加热24小时。将所得黑色溶液倒入水(10mL)中，用EtOAc(3×10mL)萃取。将合并的有机层用1NHCl(2×10mL)、水(1×10mL)洗涤，经MgSO4干燥并蒸发，得到粗产物，在通过快速色谱法纯化后，得到呈浅黄色固体状的目标产物(8.73mg，0.0232mmol，8％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.30-7.45(m,J＝7.78Hz,2H),7.14-7.30(m,J＝8.03Hz,2H),4.40(s,2H),4.18-4.32(m,1H),3.06(dd,J＝6.27,13.80Hz,1H),2.91(dd,J＝8.66,13.68Hz,1H),1.45-1.53(m,1H),1.42(d,J＝3.26Hz,19H)。
2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(4-(氰基乙炔基)苯基)丙酸叔丁酯(36)：
根据MnO2氧化的一般程序来合成产物。反应时间：2小时；产率：56％。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.54(d,J＝8.2Hz,2H),7.24(d,J＝8.2Hz,2H),5.05(d,J＝7.3Hz,1H),4.46(td,J＝6.1,7.3Hz,1H),3.14(dd,J＝6.1,13.7Hz,1H),3.05(dd,J＝6.1,13.7Hz,1H),1.42(s,9H),1.41(s,9H)。
13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ＝170.3,154.9,141.4,133.4,130.1,115.9,105.5,82.9,82.5,79.9,63.2,54.5,38.8,28.3,27.9。
化合物36可用于根据本发明的纯化和/或固定。
4-(氰基乙炔基)-N-(2-(2-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺(37)
向N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(1当量，222mg，0.593mmol)于无水DMF(1mL)中的溶液中添加4-((4-(氰基乙炔基)苯甲酰基)氧基)-2,3,5,6-四氟苯磺酸钠(1.2当量，300mg，0.712mmol)和DIEA(5.1当量，391mg，0.5mL，3.03mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时，然后通过半制备型HPLC纯化，得到呈黄色油状的所需产物(68.8mg，0.13mmol，22％产率)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝7.92(d,J＝8.5Hz,2H),7.81(d,J＝8.5Hz,2H),4.49(dd,J＝4.8,7.8Hz,1H),4.30(dd,J＝4.5,7.8Hz,1H),3.71-3.56(m,8H),3.54(t,J＝5.5Hz,2H),3.34(t,J＝5.5Hz,2H),3.24-3.14(m,1H),2.92(dd,J＝4.8,12.8Hz,1H),2.70(d,J＝12.8Hz,1H),2.19(t,J＝7.4Hz,2H),1.78-1.50(m,4H),1.48-1.35(m,2H)。
13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ＝176.3,168.8,166.2,138.9,135.0,129.1,121.5,105.9,83.1,71.5,71.4,70.7,70.6,64.6,63.5,61.8,57.1,41.2,40.4,36.9,29.9,29.6,27.0。
三氟乙酸2-((4-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)-氨基)-2-氧代乙基)三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻(38)：
38d：(4-((4-碘苯基)氨基)-4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯
向冷却至0℃的Boc-GABA(1当量，0.928g，4.57mmol)、TEA(3当量，1.39g，1.9mL，13.7mmol)和DMAP(0.05当量，0.0279g，0.228mmol)于DCM(11.7mL)中的溶液中添加EDC(1当量，0.875g，4.57mmol)。将所得反应物质在10℃下再搅拌10分钟，移走冰浴，并且添加对碘苯胺(1当量，1g，4.57mmol)并且使反应在25℃下过夜。将所得反应物质用1MHCl(2×20mL)、水(1×20mL)洗涤，并且经Na2SO4干燥，得到38d(1125mg，2.79mmol，61％)，其未经进一步纯化即使用。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ9.04(br.s.,1H),7.58-7.72(m,J＝8.50Hz,2H),7.37-7.51(m,J＝8.50Hz,2H),4.81(br.s.,1H),3.27(m,2H),2.30-2.50(m,2H),1.88(m,2H),1.49(s,9H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ174.2,157.4,137.8,120.9,120.0,87.3,77.0,33.1,32.8,28.4,26.0；ESI-MS:C15H22N2O3 +[M+H]+,405.0；实验值405.1。
38c：(4-((4-(3-羟基丙-1-炔基-1-基)苯基)-氨基)-4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯
遵循关于Sonogashira偶联的方案B进行合成。浅黄色固体，产率：79％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.54-7.58(m,J＝8.50Hz,2H),7.34-7.38(m,J＝8.50Hz,2H),4.40(s,2H),3.13(t,J＝6.90Hz,2H),2.41(t,J＝7.40Hz,2H),1.81-1.89(m,2H),1.44(s,9H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ174.0,158.6,140.1,133.2,120.8,119.5,88.3,85.3,80.1,51.3,40.9,35.3,28.8,27.1；ESI-MS:C18H25N2O4 +[M+H]+,332.1；实验值332.0。
38b：(4-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯
使用MnO2氧化的标准方案进行合成。反应时间：1小时。白色固体，产率：85％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.61-7.65(m,J＝8.80Hz,2H),7.54-7.59(m,J＝8.50Hz,2H),3.04(t,J＝6.85Hz,2H),2.34(t,J＝7.40Hz,2H),1.74-1.81(m,2H),1.34(s,9H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ174.3,159.1,143.8,135.7,120.8,112.8,106.3,84.6,62.7,40.8,35.3,34.8,28.8,26.9；ESI-MS:C18H22N3O3 +[M+H]+,328.1；实验值328.1。
38a：三氟乙酸4-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-4-氧代丁-1-铵
向38b(1当量，62.8mg，0.192mmol)于DCM(1mL)中的悬浮液中添加TFA(20当量，285μL，3.83mmol)并且将所得溶液在25℃下搅拌30分钟。在反应物质蒸发后获得目标产物38a(TFA盐，65.0mg，0.19mmol，99％)并且其未经进一步纯化即用于下一步骤中。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.71-7.79(m,J＝9.15Hz,2H),7.63-7.70(m,J＝9.15Hz,2H),3.04(t,J＝6.80Hz,2H),2.6(t,J＝7.05Hz,2H),1.98-2.08(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ173.1,143.6,135.7,120.7,112.9,106.2,84.5,62.7,40.4,34.5,24.0；ESI-MS:C13H14N3O+[M+H]+,228.1；实验值228.1。
38：三氟乙酸(2-((4-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)氨基)-2-氧代乙基)三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻
向38a(1当量，10.1mg，0.0296mmol)于DMF(250μL)中的溶液中添加TEA(1当量，4μL，0.0296mmol)。向所得溶液中添加TMPP-Ac-OSu(1当量，22.7mg，0.0296mmol)并且将反应物质在室温下搅拌15分钟。通过HPLC纯化粗产物以分离作为主要产物的38(9.9mg，0.0126mmol，42％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.44-7.59(m,4H),6.13(d,J＝4.52Hz,6H),3.75(s,9H),3.50(s,18H),3.00(td,J＝7.91,15.31Hz,2H),2.26(t,J＝6.90Hz,2H),1.64-1.75(m,2H),1.25-1.43(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ174.2,167.4,167.4,165.3,143.6,135.8,120.6,112.8,106.3,92.2(d,J＝8Hz),84.5,62.7,56.5,56.2,37.5,29.4(d,J＝64Hz),27.9,27.7,24.9；ESI-HRMS:C42H47N3O11P+[M]+,800.29427；实验值800.29401。
溴化(5-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-5-氧代戊基)三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻(39)：
39d：5-溴戊酰氯
将经过脱气的5-溴戊酸(1当量，2.85g，15.7mmol)和SOCl2(1当量，1.87g，1.14mL，15.7mmol)于DCM(50mL)中的溶液回流3小时。所得反应物质在减压下蒸发，得到呈浅黄色油状的39d(3.11g，100％)。粗产物未经纯化即用于下一步骤中。
39c：5-溴-N-(4-碘苯基)戊酰胺
将39d(1当量，3.11g，15.7mmol)于DCM(50mL)中的溶液倒入被冷却至-78℃的4-碘苯胺(1当量，3.45g，15.7mmol)和DIPEA(1当量，2.03g，2.6mL，15.7mmol)于DCM(50mL)中的溶液中。使所得反应物质升温至室温，再搅拌30分钟，用1NHCl(2×25mL)、水(1×25mL)洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发，得到呈褐色固体状的39c(5.60g，14.66mmol，93％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.62-7.66(m,2H),7.38-7.43(m,2H),3.50(t,J＝6.53Hz,2H),2.42(t,J＝7.28Hz,2H),1.81-1.98(m,4H),1.37-1.42(m,1H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ174.0,140.5,138.9,123.1,87.6,36.9,33.8,33.4,25.3；ESI-MS:C11H14BrINO+[M+H]+,381.9；实验值381.8。
39b：5-溴-N-(4-(3-羟基丙-1-炔基-1-基)苯基)戊酰胺：
遵循关于Sonogashira偶联的方案A进行合成。褐色固体，产率：92％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.49-7.63(m,J＝8.53Hz,2H),7.32-7.43(m,J＝8.53Hz,2H),4.40(s,2H),4.26(s,1H),3.50(t,J＝6.53Hz,2H),2.43(t,J＝7.15Hz,2H),1.90-2.04(m,2H),1.74-1.90(m,2H),1.32(s,1H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ173.9,140.0,133.1,120.7,119.6,88.2,85.2,51.2,36.8,33.7,33.3,25.3；ESI-MS:C14H17BrNO+[M+H]+,310.0；实验值310.0。
39a：5-溴-N-(4-(氰基乙炔基)苯基)戊酰胺
将NH3(4当量，94.8mg，5.56mmol)于IPA中的2M溶液和无水MgSO4(15当量，2511mg，20.9mmol)添加至被搅拌的39b(1当量，431mg，1.39mmol)于THF(3.42mL)中的溶液中。向所述溶液中添加活性MnO2(15当量，1814mg，20.9mmol)并且将所得混合物在室温下搅拌4小时(通过TLC控制，无更多原料醇；NB：过长的反应时间将得到水解产物)，用DCM(13mL)稀释。将混合物过滤，用DCM充分洗涤并且在减压下浓缩合并的滤液。通过快速色谱法(EtOAc-环己烷，从0至100％EtOAc的20分钟梯度)纯化固体残余物，得到呈白色固体状的39(288mg，0.946mmol，68％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.69-7.79(m,J＝8.78Hz,2H),7.59-7.69(m,J＝8.78Hz,2H),3.50(t,J＝6.53Hz,2H),1.79-1.99(m,4H),1.26(t,J＝7.15Hz,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ174.3,143.8,135.7,120.7,112.8,106.2,101.4,84.6,37.0,33.7,33.4,25.2。ESI-MS:C14H14BrN2O+[M+H]+,304.0；实验值304.0。
39：溴化(5-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-5-氧代戊基)三(2,4,6-三甲氧基-苯基)鏻
将39a(1当量，20mg，0.0655mmol)和三(2,4,6-三甲氧基-苯基)磷烷(TMPP，1.2当量，41.9mg，0.0786mmol)溶解在无水甲苯(1mL)中并且在室温下搅拌过夜。在反相HPLC后获得呈白色固体状的39(TFA盐，22mg，39％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.51-7.55(m,4H),6.13(d,J＝4.77Hz,6H),3.75(s,9H),3.50(s,18H),3.00(td,J＝6.90,15.31Hz,2H),2.26(t,J＝6.90Hz,2H),1.73(m,2H),1.22-1.45(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ174.2,167.4,165.3,143.6,135.8,120.6,112.8,106.2,93.6,92.3,92.2,84.5,62.7,56.3,37.5,29.7,27.7,24.9；ESI-HRMS:C41H46N2O10P+[M]+,757.28846；实验值757.29552。
三氟乙酸(4-(4-(氰基乙炔基)苯甲酰胺基)丁基)三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻(40)：
40c：N-(4-溴丁基)-4-碘苯甲酰胺
将4-碘苯甲酸(1当量，1.45g，5.85mmol)在SOCl2(9当量，3.8mL，52.6mmol)中在110℃下加热，直至完全溶解(约15分钟)。在真空中除去过量SOCl2并且将所得固体倒入DCM(15mL)中，冷却至-78℃并且在剧烈搅拌下添加DIPEA(3.1当量，3mL，18.2mmol)。将3-溴丙胺氢溴酸盐(1.5当量，1.90g，8.77mmol)添加至所得反应物质，仍在-78℃下保持搅拌5分钟，使其升温至室温，同时再搅拌20分钟。添加乙酸乙酯(100mL)与1MHCl(5mL)，将所得固体过滤(产物)，用水洗涤并干燥，得到呈白色固体状的40c(2.09g，5.67mmol，97％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.85(m,J＝8.40Hz,2H),7.58(m,J＝8.40Hz,2H),3.48-3.56(m,4H),2.12-2.23(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ160.1,139.2,136.0,132.8,102.4,50.1,43.2,23.0；ESI-MS:C10H12BrINO+[M+H]+,367.9；实验值368.0。
40b：N-(4-溴丁基)-4-(3-羟基丙-1-炔基-1-基)苯甲酰胺
遵循关于Sonogashira偶联的方案B进行合成。褐色固体，产率：81％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.73(m,J＝8.40Hz,2H),7.38(m,J＝8.40Hz,2H),4.37(t,J＝5.30Hz,2H),4.34(s,2H),3.51(t,J＝5.80Hz,2H),1.92-1.98(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ159.2,134.2,132.4,128.2,127.1,91.2,84.8,67.2,51.2,43.3,22.5；ESI-MS:C13H15BrNO2 +[M+H]+,295.0；实验值295.0。
40a：N-(3-溴丙基)-4-(氰基乙炔基)苯甲酰胺
使用MnO2氧化的标准方案进行合成。反应时间：45分钟。褐色固体，产率：52％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.90(m,J＝8.50Hz,2H),7.80(m,J＝8.50Hz,2H),3.42-3.55(m,2H),3.25-3.35(m,2H),2.13-2.23(m,2H),1.92-1.98(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ168.7,138.8,134.9,128.9,121.4,105.8,83.0,67.3,41.9,39.8,22.8；ESI-MS:C13H12BrN2O+[M+H]+,291.0；实验值291.2。
40：三氟乙酸(4-(4-(氰基乙炔基)苯甲酰胺基)丁基)三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻
将40a(1当量，30mg，0.103mmol)和三(2,4,6-三甲氧基苯基)磷烷(TMPP，1当量，54.9mg，0.103mmol)溶解在无水甲苯(2mL)中。使所得溶液在室温下过夜。将沉淀物过滤，再次溶解在DMSO中，并通过HPLC纯化，得到呈白色固体状的40(35mg，0.0409mmol，40％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.75(d,J＝8.50Hz,2H),7.69(d,J＝8.50Hz,2H),6.16(d,J＝4.70Hz,2H),3.76(s,9H),3.51(s,18H),3.35(t,J＝7.10Hz,2H),2.98-3.10(m,2H),1.53-1.64(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ168.5,167.5,165.3,138.7,134.9,128.8,121.2,105.8,94.0,92.9,92.3,82.9,64.5,56.5,41.7,27.8,25.7；ESI-HRMS:C40H44N2O10P+[M]+,743.22728；实验值743.23946。
化合物38-40可用于根据本发明的检测和/或分离方法。
3-(4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基)丙炔腈(41)：
41a：(Z)-4-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-4-氧代丁-2-烯酸
向7(1当量，76.8mg，0.541mmol)于丙酮(2mL)中的溶液中添加马来酸酐(2当量，106mg，1.08mmol)。在搅拌约7小时后获得浅黄色固体。将反应物质蒸发，用甲醇洗涤过量的马来酸酐和马来酸。获得呈浅黄色固体状的41a(127mg，0.53mmol，98％)，无需进一步纯化。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.90(br.s.,1H),10.70(s,1H),7.62-7.90(m,4H),6.50(d,J＝11.90Hz,1H),6.34(d,J＝11.90Hz,1H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.8,163.8,142.4,135.0,131.7,130.1,119.3,110.2,105.6,84.3,61.9；ESI-MS:C13H7N2O3 -[M-H]-,239.0；实验值239.0。
41：3-(4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基)-丙炔腈
向41a(1当量，75mg，0.312mmol)于无水DMF(1.21mL)中溶液中添加三氟乙酸酐(2当量，86.9μL，0.624mmol)。在室温下再继续搅拌5分钟并且添加K2CO3(3当量，129mg，0.937mmol)。将反应物质再搅拌60分钟，然后通过HPLC直接纯化，得到呈浅黄色固体状的41(65.9mg，0.297mmol，95％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.81(m,J＝8.50Hz,2H),7.52(m,J＝8.50Hz,2H),6.96(s,2H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.0,134.4,134.0,126.0,117.3,117.0,82.2,78.5,62.3；ESI-MS:C13H7N2O2 +[M+H]+,223.0；实验值229.9。
化合物41可用于根据本发明的生物结合方法。
5-((4-(氰基乙炔基)-苯基)-氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(42)：
42a：5-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸
向7(1当量，200mg，1.41mmol)于丙酮(1mL)中的溶液中添加戊二酸酐(2当量，321mg，2.81mmol)。将所得溶液在室温下搅拌24小时。将丙酮蒸发，使粗产物从IPA-环己烷中重结晶，得到呈灰色固体状的42a(324mg，1.27mmol，90％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.21(s,1H),8.15(br.s.,1H),7.60(d,J＝8.72Hz,2H),7.52(d,J＝8.72Hz,2H),2.52-2.62(m,4H),2.22-2.32(m,2H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ170.0,168.5,140.9,134.2,119.0,111.9,105.4,84.1,63.3,30.1,29.0,21.2；ESI-MS:C14H11N2O3 -[M-H]-,255.1；实验值255.1。
42：5-((4-(氰基乙炔基)苯基)-氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向42a(1当量，18mg，0.0702mmol)于DCM(1mL)中的溶液中添加DCC(1.02当量，14.8mg，0.0716mmol)和TEA(1当量，6.52mg，0.00895mL，0.0644mmol)。将所得反应物质搅拌5分钟，添加NHS(1当量，8.08mg，0.0702mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌2小时。通过快速色谱法(环己烷-EtOAc)纯化粗产物，得到呈白色固体状的42(6.45mg，0.0183mmol，26％)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.27(br.s.,1H),7.64(d,J＝8.78Hz,2H),7.57(d,J＝8.78Hz,2H),2.94(s,4H),2.74(t,J＝6.53Hz,2H),2.52(t,J＝6.90Hz,2H),2.23(m,2H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)d170.3,169.5,168.2,141.3,134.6,119.4,112.4,105.7,83.2,62.9,35.6,29.9,25.7,21.2；ESI-MS:C18H16N3O5 +[M+H]+,353.1；实验值353.2。
化合物42可用于根据本发明的生物结合方法。
3-(4-叠氮基苯基)丙炔腈(43)：
将7(1当量，151mg，1.07mmol)溶解在25mL圆底烧瓶中的乙腈(2.34mL)中并在冰浴中冷却至0℃。向这种搅拌混合物中依次逐滴添加亚硝酸异戊酯(IAN，1.5当量，215μL，1.6mmol)和三甲基甲硅烷基叠氮化物(1.2当量，147mg，0.168mL，1.28mmol)。将所得溶液在室温下搅拌45分钟。将反应混合物在真空下浓缩并且将粗产物再次溶解在EtOAc中，用水洗涤，干燥并蒸发，得到43(177mg，1.06mmol，99％)。
1HNMR(400MHz,乙腈-d3)δ7.58-7.81(m,J＝8.78Hz,2H),7.11-7.26(m,J＝8.78Hz,2H)；13CNMR(101MHz,乙腈-d3)δ144.9,136.0,120.4,113.6,105.9,83.4,62.9；GC-ESI-MS:C9H5N4 +[M+H]+,169.0；实验值169.0。
5-叠氮基-N-(4-(氰基乙炔基)苯基)戊酰胺(44)：
44a：5-叠氮基戊酰氯
将5-叠氮基戊酸(1当量，1.1g，6.99mmol)在SOCl2(10当量，5.1mL，69.9mmol)中回流30分钟。在真空中除去过量的SOCl2并且所得粗固体未经纯化即用于下一步骤中。
44：5-叠氮基-N-(4-(氰基乙炔基)苯基)戊酰胺
将7(1当量，16.1mg，0.113mmol)和TEA(1.5当量，24μL，0.17mmol)溶解在DCM(3mL)中，冷却至-78℃，并且向反应混合物中添加44a(1.1当量，20.1mg，0.125mmol)，然后使其升温至室温，同时再搅拌1小时。将反应物质用1MHCl(2×1mL)、水(2mL)洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发，得到粗产物，通过快速色谱法纯化，得到呈灰色固体状的44(25.5mg，0.101mmol，89％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.58-7.67(m,J＝8.70Hz,2H),7.40-7.58(m,J＝8.70Hz,2H),3.23-3.28(m,2H),2.34(t,J＝7.28Hz,2H),1.61-1.72(m,2H),1.49-1.61(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ173.0,144.0,135.7,134.3,120.7,113.0,106.2,84.5,40.4,34.4,28.8,24.0；ESI-MS:C14H14N5O+[M+H]+,268.1；实验值268.1。
三氟甲磺酸1-[4-(氰基乙炔基)苄基]-3,3,6,6-四甲基-4,5-二脱氢-2,3,6,7-四氢噻吩鎓(45)：
45c：3-(对甲苯基)丙-2-炔基-1-醇
使用关于Sonogashira偶联的方案A进行合成。浅黄色固体，产率：88％。
1HNMR(400MHz,乙腈-d3)δ7.25-7.49(m,J＝8.03Hz,2H),7.04-7.25(m,J＝8.03Hz,2H),4.34(d,J＝6.02Hz,2H),3.31(t,J＝6.02Hz,1H),2.32(s,3H)；13CNMR(101MHz,乙腈-d3)δ139.8,132.4,130.3,120.8,88.8,85.1,51.2,21.5；ESI-MS:C10H11O+[M+H]+,146.1；实验值146.0。
45b：3-(对甲苯基)丙炔腈
所述化合物以标准MnO2氧化方案的唯一产物形式获得。反应时间：3小时。白色固体，产率：67％。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.37-7.59(m,J＝8.03Hz,2H),7.02-7.31(m,J＝8.03Hz,2H),2.29(s,3H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ143.2,133.3,129.5,114.0,104.8,83.2,61.3,20.4；ESI-MS:C10H8N+[M+H]+,141.1；实验值141.0。
45a：3-(4-(溴甲基)苯基)丙炔腈
将经过脱气的45b(1当量，68mg，0.482mmol)于DCM(1mL)中的溶液微波照射(100℃)持续5分钟。蒸发反应混合物，通过制备型HPLC纯化粗物质，得到呈浅黄色固体状的45a(42.4mg，0.193mmol，40％)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.56-7.71(m,J＝8.28Hz,2H),7.40-7.49(m,J＝8.28Hz,2H),4.48(s,2H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ141.8,133.9,129.5,117.5,105.3,82.3,63.7,31.8；GC-ESI-MS:C10H7BrN+[M+H]+,219.0；实验值219.0。
45：三氟甲磺酸1-[4-(氰基乙炔基)苄基]-3,3,6,6-四甲基-4,5-二脱氢-2,3,6,7-四氢噻吩鎓
向经过脱气的45a(1当量，43.7mg，0.199mmol)和TMTH(1.29当量，43mg，0.255mmol；遵循先前描述的程序831进行合成)于DCM(1.34mL)中的溶液中添加LiOTf(11.6当量，360mg，2.31mmol)于经过蒸馏和脱气的H2O(0.668mL)中的溶液。将所得双相混合物在25℃下剧烈搅拌5天(每天脱气一次)。分离两相，用DCM(5×2mL)洗涤有机相。将合并的有机部分蒸发并且通过HPLC纯化粗物质，得到呈无色油状的45(46.9mg，0.111mmol，56％)(在0℃下缓慢结晶以得到白色固体)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.65-7.73(m,J＝8.03Hz,2H),7.56-7.65(m,J＝8.03Hz,2H),5.07(s,2H),4.12(d,J＝12.30Hz,2H),3.72(d,J＝12.30Hz,2H),1.36(s,6H),1.30(s,6H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ135.1,133.6,131.9,117.8,106.4,105.8,83.3,63.6,60.1,43.2,34.6,26.4,25.4；HR-ESI-MS:C20H22NS+[M]+,308.1；实验值308.1。
化合物43-45可用于根据本发明的点击化学(例如叠氮化物点击反应)。
化合物45可用于根据本发明的力引发的点击。
三氟乙酸1-({4-[1-{[2-({3-羧酸根基-4-[6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚铵基)-3H-呫吨-9-基]苯基}甲酰胺基)乙基]硫基}-2-氰基乙-1-烯-1-基]苯基}甲基)-3,3,6,6-四甲基-1-硫杂环庚-4-炔-1-鎓(46)：
46a：2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)-5-((2-巯基乙基)氨甲酰基)苯甲酸酯
随后向TAMRA-5'-COOH(1当量，68.3mg，0.159mmol)于DMF(0.228mL)中的溶液中添加HATU(1当量，60.3mg，0.159mmol)、DIPEA(6当量，123mg，0.157mL，0.952mmol)和二氯化胱胺(5当量，178mg，0.793mmol)；将所得溶液物质搅拌过夜。向反应物质中添加DTT(5当量，122mg，0.118mL，0.793mmol)于DCM(0.911mL)中的溶液，持续搅拌2小时。蒸发溶剂；通过HPLC纯化所得粗物质，得到呈深紫色固体状的46a(33.5mg，0.0555mmol，35％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.06(t,J＝5.4Hz,1H,8.70(d,J＝1.8Hz,1H),8.30(dd,J＝1.8,8.0Hz,1H),7.59(d,J＝8.0Hz,1H),7.08-7.02(m,4H),6.95(s,2H),3.52-3.42(m,2H),3.26(s,12H),2.72(dt,J＝6.8,8.0Hz,2H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.0,164.7,156.8,156.6,135.9,131.2,130.6,114.6,96.3,42.9,40.5,23.3；HR-ESI-MS:C27H27N3O4S:489.1722；实验值489.1723。
46：三氟乙酸1-({4-[(1Z)-1-{[2-({3-羧酸根基-4-[6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚铵基)-3H-呫吨-9-基]苯基}甲酰胺基)乙基]硫基}-2-氰基乙-1-烯-1-基]苯基}甲基)-3,3,6,6-四甲基-1-硫杂环庚-4-炔-1-鎓(TAMRA-APN-TMTI)
将45(1当量，6.74mg，0.016mmol)于ACN(1mL)中的溶液与46a(1当量，9.64mg，0.016mmol)于DMF(1mL)中的溶液混合。然后添加DIPEA(5当量，132μL，0.08mmol)并且在反应5分钟后将所得反应物质注入HPLC中，得到呈深紫色固体状的46(11.9mg，0.0149mmol，93％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.98(t,J＝5.40Hz,1H),8.30(d,J＝8.28Hz,1H),8.10-8.20(m,1H),7.85(s,1H),7.57-7.69(m,4H),6.97-7.15(m,5H),6.07(s,1H),4.85(s,2H),2.81-2.90(m,4H),3.28(br.s.,16H),1.25(s,6H),1.05(s,6H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)-无信息(低解析信号)；HR-ESI-MS:C47H49N4O4S2 +,797.31897；实验值797.32739。
1-({4-[2-氰基-1-[(2-{4-[(E)-2-[4-(二甲基氨基)苯基]二氮烯-1-基]苯磺酰胺基}乙基)硫基]乙-1-烯-1-基]苯基}甲基)-3,3,6,6-四甲基-1-硫杂环庚-4-炔-1-鎓(47，BHQ2-APN-TMTI)：
47a：(E)-4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)-N-(2-巯基乙基)苯磺酰胺
随后向冷却至0℃的Dabsyl氯化物(1当量，100mg，0.309mmol)于无水ACN(3mL)中的溶液中添加TEA(7当量，218mg，0.3mL，2.16mmol)和胱胺二盐酸盐(5当量，347mg，1.54mmol)。在搅拌2小时后，向反应物质中添加DTT(6当量，285mg，0.275mL，1.85mmol)。将所得溶液再搅拌2小时，蒸发并且通过快速色谱法(环己烷-EtOAc)纯化所得粗产物，得到呈橙色固体状的47a(105.9mg，94％)。
47：三氟乙酸1-({4-[(2-氰基-1-[(2-{4-[(E)-2-[4-(二甲基氨基)苯基]二氮烯-1-基]苯磺酰胺基}乙基)硫基]乙-1-烯-1-基]苯基}甲基)-3,3,6,6-四甲基-1-硫杂环庚-4-炔-1-鎓
与关于46的合成相同的程序。产率：94％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.03(t,J＝4.89Hz,1H),7.91(d,J＝8.53Hz,2H),7.80-7.87(m,J＝9.04Hz,2H),7.72-7.79(m,J＝8.53Hz,2H),7.68(s,4H),6.87(d,J＝9.04Hz,2H),6.08(s,1H),4.86(s,2H),3.92(d,J＝12.05Hz,2H),3.84(d,J＝12.30Hz,2H),3.10(s,6H),2.71-2.87(m,4H),1.32(s,6H),1.17(s,6H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ160.2,158.6,158.3,155.1,153.7,143.1,140.3,136.8,131.9,131.3,129.5,128.2,125.9,122.8,117.2,112.1,106.4,99.4,60.0,43.3,42.9,34.5,26.4,25.3；HR-ESI-MS:C36H42N5O2S3 +,672.24951；实验值672.25042。
化合物46-47可用于制备以其他方式不可获得的化合物(TMTI)。
5-(3-{4-[1-(4-{[4-(2-氰基乙-1-炔-1-基)苯基]氨甲酰基}丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]丁酰胺基}丙基)-2-[(E)-2-[4-羟基-2-(2-{2-[2-(2-{5-[(4S)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯基]二氮烯-1-基]苯甲酸(48，APN-HAZA-生物素)：
化合物48可用于根据本发明的纯化和/或固定。
48a：2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)-5-((2-巯基乙基)氨甲酰基)苯甲酸酯
遵循先前报道的方案来合成这种化合物。
48：5-(3-{4-[1-(4-{[4-(2-氰基乙-1-炔-1-基)苯基]氨甲酰基}丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]丁酰胺基}丙基)-2-[(E)-2-[4-羟基-2-(2-{2-[2-(2-{5-[(4S)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯基]二氮烯-1-基]苯甲酸(APN-HAZA-生物素)
向48a(1当量，10mg，0.0123mmol)和77(1当量，3.12mg，0.0123mmol)于DMSO(0.472mL)中的溶液中添加抗坏血酸钠(10当量，24.4mg，0.123mmol)和CuSO4 .5H2O(5当量，15.4mg，0.0617mmol)于水中的溶液。将所得反应物质脱气并在25℃下搅拌过夜。通过HPLC直接纯化反应物质，得到呈黄色固体状的48(8.3mg，0.0078mmol，63％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.78(br.s.,2H),7.72(d,J＝8.28Hz,1H),7.67(s,1H),7.58(d,J＝8.78Hz,2H),7.50(d,J＝8.78Hz,2H),7.29(d,J＝8.28Hz,1H),7.25(d,J＝8.53Hz,1H),6.29(d,J＝7.78Hz,1H),3.70-3.81(m,8H),3.62(d,J＝4.77Hz,2H),3.58(d,J＝5.02Hz,2H),3.48-3.53(m,2H),3.41-3.48(m,2H),3.01-3.07(m,6H),2.89-3.00(m,10H),2.78(dd,J＝4.89,12.93Hz,1H),2.52-2.67(m,8H),2.33(t,J＝7.28Hz,2H),2.09-2.19(m,2H),1.81-1.91(m,4H),1.65-1.78(m,2H),1.52-1.63(m,2H),1.42-1.52(m,1H),1.23-1.31(m,1H)；HR-ESI-MS:C56H67N11O11S,1077.47422；实验值1077.45931。
三氟乙酸2-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-N,N,N-三甲基-2-氧代乙-1-铵(49)：
49a：2-氯-N,N,N-三甲基-2-氧代乙-1-铵
如先前由Vassel和Skelly(10.1002/0471264180.os035.09)所述进行合成。
49：三氟乙酸2-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-N,N,N-三甲基-2-氧代乙-1-铵
向3-(4-氨基苯基)丙-2-炔腈(1当量，66.3mg，0.466mmol)和DIPEA(1.1当量，66.3mg，0.0848mL，0.513mmol)于DMF(1mL)中的溶液中添加冷却至-20℃的氯化(2-氯-2-氧代乙基)三甲基铵氮(1.1当量，88.3mg，0.513mmol)于DMF(1mL)中的溶液。将所得反应物质在25℃下搅拌10小时，通过RP快速色谱法纯化，得到呈浅黄色固体状的49(39mg，0.110mmol，24％)。
1HNMR(400MHz,乙腈-d3)δ11.14(br.s.,1H),7.70-7.83(m,J＝8.78Hz,2H),7.56-7.70(m,J＝8.78Hz,2H),4.33(s,2H),3.28(s,9H)；13CNMR(101MHz,乙腈-d3)δ163.5,142.5,135.8,121.2,113.5,106.5,84.4,66.3,63.1,55.2；ESI-MS:C14H16N3O+[M]+,242.13；实验值242.13。
3-(1-(1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2,5,8,11,14-五氧杂十七烷-17-酰胺基)戊二酸(50)：
向43(1当量，5.65mg，0.0336mmol)于DMSO(0.0331mL)中的溶液中添加二酸-炔烃(1当量，14.6mg，0.0336mmol)于水(0.0331mL)中的溶液。向所得反应物质中添加五水合硫酸铜(0.1当量，0.839mg，0.00336mmol)于最少量的水中的溶液，接着添加抗坏血酸钠(0.5当量，3.33mg，0.0168mmol)于最少量的水中的溶液。在30分钟后重复添加，直至原料完全消失(总共2次)。将过量水蒸发至真空(不应使用加热，否则开始出现水解产物)，在经由针筒过滤器过滤铜盐后通过HPLC纯化所得粗物质，得到呈白色固体状的50(11mg，0.01828mmol，54％)。
1HNMR(400MHz,乙腈-d3)δ8.41(s,1H),7.95-8.02(m,2H),7.88-7.94(m,2H),6.86(d,J＝7.78Hz,1H),4.71(s,2H),4.49(td,J＝6.71,8.41Hz,1H),3.68-3.76(m,3H),3.49-3.68(m,21H),2.53-2.64(m,5H),1.97(td,J＝2.42,4.96Hz,15H)；13CNMR(101MHz,乙腈-d3)δ188.7,173.3,161.6,146.5,135.1,131.3,130.8,122.5,121.0,117.9,115.4,64.2,40.4,39.5,36.7,30.6；ESI-MS:C28H34N5O10 -[M-H]-,600.21；实验值600.23。
N1,N5-双(23-氨基-3,6,9,12,15,18,21-七氧杂二十三烷基)-3-(1-(1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2,5,8,11,14-五氧杂十七烷-17-酰胺基)戊二酰胺(51)：
将43(1当量，1.64mg，0.00973mmol)和PEG-炔烃(1当量，11mg，0.00973mmol)于DMSO中的溶液添加至DMSO(0.00958mL)和水(0.00958mL)的混合物中。将五水合硫酸铜(0.1当量，0.243mg，0.000973mmol)于最少量的水中的溶液添加至所得反应物质，接着添加抗坏血酸钠(0.5当量，0.964mg，0.00487mmol)于最少量的水中的溶液。将反应物质过滤并通过HPLC纯化，得到呈无色液体状的51(5mg，0.003839mmol，39％)。
ESI-HRMS:C60H103N9O22,1301.72177；实验值1301.72204。
N-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)-1-(1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2,5,8,11,14-五氧杂十七烷-17-酰胺(52)：
向3-(4-叠氮基苯基)丙-2-炔腈(1当量，14.9mg，0.0886mmol)于DMSO(0.0872mL)中的溶液中添加PEG-炔烃(1当量，50.2mg，0.0886mmol)于水(0.0872mL)中的溶液。向所得混合物中添加五水合硫酸铜(0.1当量，2.21mg，0.00886mmol)于最少量的水中的溶液，接着添加抗坏血酸钠(0.5当量，8.77mg，0.0443mmol)于最少量的水中的溶液。如果仍存在原料叠氮化物，则在30分钟后重复添加五水合硫酸铜(0.1当量，2.21mg，0.00886mmol)和抗坏血酸钠(0.5当量，8.77mg，0.0443mmol)。将过量水蒸发至真空，通过HPLC纯化粗产物，得到呈无色油状的52(55mg，0.07485mmol，84％)。
1HNMR(400MHz,乙腈-d3)δ8.42(s,1H),7.95-8.02(m,J＝9.03Hz,2H),7.86-7.95(m,J＝8.78Hz,2H),7.30(br.s.,2H),7.19(br.s.,1H),4.71(s,2H),3.73-3.79(m,2H),3.65-3.73(m,7H),3.54-3.65(m,29H),3.51(t,J＝5.40Hz,2H),3.34(q,J＝5.35Hz,2H),3.13(d,J＝4.52Hz,2H),2.37-2.46(m,2H),1.92-2.01(m,5H)；13CNMR(126MHz,氯仿-d)δ177.5,151.3,144.6,140.7,140.7,140.6,127.2,126.0,125.9,125.8,122.4,110.5,87.2,75.4,75.3,75.3,75.2,75.2,75.1,75.1,75.1,75.0,74.9,74.8,74.8,72.2,71.9,68.9,68.5,45.0,44.2,41.6；ESI-MS:C35H55N6O11 +[M+H]+,735.39；实验值735.20。
1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-3-(3-(二甲基氨基)丙基)脲(53)：
向三光气(1当量，56.3mg，31.6μL，0.19mmol)于THF(0.404μL)中的溶液中添加3-(4-氨基苯基)丙-2-炔腈(3当量，80.9mg，0.569mmol)于THF(0.404μL)中的溶液。然后添加三乙胺(6当量，115mg，158μL，1.14mmol)。将混合物搅拌5分钟，然后添加含3-二甲基氨基丙胺(3当量，58.1mg，71.8μL，0.569mmol)和三乙胺(2当量，38.4mg，52.7μL，0.379mmol)的THF(0.404μL)。将反应混合物搅拌10分钟，然后浓缩。通过HPLC纯化所得残余物，得到呈白色固体状的53(47mg，0.1764mmol，93％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.45-7.50(m,2H),7.41-7.45(m,2H),3.23-3.25(m,1H),3.04-3.11(m,2H),2.80(s,6H),1.77-1.91(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ156.5,143.7,134.4,118.0,109.3,105.0,83.7,61.0,55.2,42.1,35.9,25.3；ESI-MS:C15H20N4O+[M+H]+,271.16；实验值271.15。
3-((3-(3-(4-(氰基乙炔基)苯基)脲基)丙基)二甲基铵基)丙烷-1-磺酸酯(54)：
将53(1当量，27mg，0.0702mmol)和1,3-丙磺酸内酯(1.1当量，9.44mg，0.00678mL，0.0773mmol)溶解在IPA(0.5mL)中并回流3小时。将反应混合物冷却至室温并且过滤沉淀物并用冷蒸馏水洗涤以除去任何未反应的丙磺酸内酯，得到呈白色固体状的54(27mg，0.0688mmol，98％)。
1HNMR(400MHz,氧化氘)δ7.45-7.67(m,2H),7.33(br.s.,2H),3.61(br.s.,4H),3.53(br.s.,1H),3.39(br.s.,2H),3.31(br.s.,2H),3.25(br.s.,2H),3.03(br.s.,7H),2.89(br.s.,7H),2.13(br.s.,1H),1.89(br.s.,7H),1.08(br.s.,2H)；ESI-HRMS:C18H24N4O4S,392.15183；实验值392.15254。化合物49-54可用于根据本发明的结合方法，例如用于改变ADME参数(增溶剂)。
3-(4-(4-(羟基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)丙炔腈(55)：
将3-(4-叠氮基苯基)丙-2-炔腈(1当量，300mg，1.78mmol)、2-丙炔-1-醇(2当量，200mg，0.211mL，3.57mmol)溶解在THF(9mL)中。向这种混合物中添加五水合硫酸铜(10％，44.5mg，0.178mmol)于1.5mL水中的溶液，接着添加抗坏血酸钠(0.5当量，176mg，0.892mmol)于1.5mL水中的溶液。将所得溶液搅拌2小时，然后在旋转蒸发仪上浓缩。用DCM萃取残余物。将有机层用NH4Cl(饱和)和水洗涤，经MgSO4干燥，然后蒸发。将残余物再次溶解在DCM中并且过滤产物，得到呈浅黄色固体状的55(23.28mg，0.08108mmol，92％)。
1HNMR(400MHz,MeOD)δ8.58(s,1H),8.04(d,J＝7.4Hz,2H),7.93(d,J＝7.4Hz,2H),4.77(s,2H)；ESI-MS:C12H9N4O+[M+H]+,225.08；实验值225.05。
3-(4-(4-(溴甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)丙炔腈(56)：
在室温下在氮气下将55(1当量，19.8mg，0.0881mmol)溶解在THF(1mL)中并且添加3-{4-[4-(溴甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]苯基}丙-2-炔腈(23.3mg，0.0811mmol，92％)。将反应混合物在室温下搅拌15小时。蒸发溶剂，通过HPLC纯化粗产物，得到呈白色固体状的56(23.3mg，0.0811mmol，92％)。
1HNMR(400MHz,乙腈-d3)δ8.44(s,1H),7.78-8.03(m,5H),4.74(s,2H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ150.9,144.3,140.6,140.5,126.0,125.9,110.4,87.1,68.5,27.0；ESI-MS:C12H8BrN4 +[M+H]+,286.99；实验值287.08。
化合物56可用于根据本发明的生物结合方法。
三氟乙酸1-({1-[4-(氰基乙炔基)苯基]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲基)-3,3,6,6-四甲基-4,5-二脱氢-2,3,6,7-四氢噻吩鎓(57)：
向经过脱气的3-{4-[4-(溴甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]苯基}丙-2-炔腈(1当量，19.6mg，0.0684mmol)和TMTH(1.89当量，21.7mg，0.129mmol)于DCM(0.982mL)中的溶液中添加三氟甲磺酸锂(10当量，106mg，0.684mmol)于水(0.982mL)中的溶液。将所得两相混合物在25℃下剧烈混合2天。分离各相，用DCM(5×2mL)洗涤有机相。将合并的有机部分蒸发并且通过HPLC纯化粗物质，得到呈白色固体状的57(23.7mg，0.0451，66％)。
ESI-HRMS:C22H23N4S,375.16434；实验值375.16497。
化合物57可用于根据本发明的点击化学(力引发的点击)。
4-(((1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯(58)：
将2-[6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚铵基)-3H-呫吨-9-基]-4-[(丙-2-炔基-1-基)氨甲酰基]苯甲酸酯(1当量，52.8mg，0.113mmol)和3-(4-叠氮基苯基)丙-2-炔腈(1当量，19mg，0.113mmol)溶解在THF(1mL)中。向所得反应混合物中添加H2O(1mL)，接着添加五水合硫酸铜(10％，2.82mg，0.0113mmol)和抗坏血酸钠(50％，11.2mg，0.0565mmol)于最少量的水中的溶液(分别地)。将所得反应混合物再搅拌30分钟，蒸发并通过HPLC纯化，得到呈深紫色固体状的58(66.8mg，0.105mmol，93％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.51(s,1H),8.33(d,J＝8.28Hz,1H),8.16(dd,J＝1.51,8.28Hz,1H),7.86-8.02(m,2H),7.64-7.86(m,3H),7.02-7.12(m,2H),6.84-7.02(m,4H),4.58-4.71(m,2H)；ESI-HRMS:C37H29N7O4,635.22811；实验值635.22861。
3-(9-(二乙基氨基)-5-氧代-5H-苯并[a]吩噁嗪-2-基)丙炔腈(59)：
59b：将8-(二乙基氨基)-3-羟基-12H-10-氧杂-5-氮杂四苯基-12-酮(1当量，65mg，0.194mmol)溶解在无水DCM(2mL)中并冷却至5℃。然后添加TEA(1.2当量，23.6mg，0.0324mL，0.233mmol)，接着添加TfCl(1.2当量，39.3mg，0.0249mL，0.233mmol)。重复添加Tf2O，直至原料完全消失。蒸发溶剂并且用水处理残余物。过滤出沉淀物并且用水和庚烷洗涤，得到呈深紫色固体状的所需产物(76mg，0.163mmol，84％)。
ESI-HRMS:C21H17F3N2O5S,466.08103；实验值466.08221。
59a：在惰性气氛下，将DIPEA(2当量，16.1mg，0.0206mL，0.124mmol)和炔丙醇(1.5当量，5.23mg，0.00551mL，0.0933mmol)添加至59b(1当量，29mg，0.0622mmol)、PdCl2(PPh3)2(5％，2.18mg，0.00311mmol)和CuI(10％，1.18mg，0.00622mmol)于DMF(1mL)中的溶液中。在90℃下搅拌2小时后，在减压下除去溶剂。通过快速色谱法(DCM-MeOH，从100-0至80-20)纯化粗产物。
ESI-HRMS:C23H20N2O3,372.14739；实验值372.14735。
59：向59a(1当量，10mg，0.0269mmol)于THF(0.121mL)中的溶液中添加MgSO4(15当量，48.5mg，0.403mmol)、NH3(4当量，2M，0.0537mL，0.107mmol)和MnO2(15当量，35mg，0.403mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟并通过HPLC追踪。在完成后，将混合物经由硅藻土过滤并用THF充分洗涤。蒸发滤液，得到粗制59(9.47mg，0.0258mmol，96％)，通过HPLC将其纯化。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.91(s,1H),8.26(d,J＝8.03Hz,1H),7.79(dd,J＝1.51,8.03Hz,1H),7.62(d,J＝9.29Hz,1H),6.74(dd,J＝2.63,9.16Hz,1H),6.51(d,J＝2.51Hz,1H),6.35(s,1H),5.31(s,2H),3.49(q,J＝7.11Hz,4H),1.09-1.36(m,6H)；ESI-HRMS:C23H17N3O2,367.13208；实验值367.13145。
(E)-3-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯基)丙炔腈(60)：
将7(1当量，167mg，1.17mmol)溶解在乙腈(2.58mL)中。向这种搅拌混合物中添加亚硝酸异戊酯(1.5当量，206mg，0.237mL，1.76mmol)，再持续搅拌2分钟，然后添加二甲基苯胺(1.1当量，156mg，0.165mL，1.29mmol)。将所得反应混合物搅拌过夜(变成红色)，蒸发并通过快速色谱法(DCM，第一峰)纯化，得到呈红色固体状的60(120mg，0.437mmol，37％)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.91(d,J＝9.03Hz,2H),7.82-7.88(m,J＝8.53Hz,2H),7.62-7.77(m,J＝8.53Hz,2H),6.77(d,J＝9.03Hz,2H),3.08-3.18(m,6H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ154.7,153.2,143.7,134.4,125.8,122.5,117.3,111.6,105.6,83.3,64.2,40.3；ESI-HRMS:C17H14N4,274.12185；实验值274.12247。
化合物58-60可用于根据本发明的检测方法。
((1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(61)：
向43(1当量，51.5mg，0.306mmol)和boc-炔丙胺(1当量，47.5mg，0.306mmol)于THF(2mL)中的溶液中添加H2O(1mL)和CuSO4(10％，4.89mg，0.0306mmol)和抗坏血酸钠(50％，30.3mg，0.153mmol)于水(各50μL)中的溶液。持续搅拌10分钟，添加另一份CuSO4(10％，4.89mg，0.0306mmol)和抗坏血酸钠(50％，30.3mg，0.153mmol)。再搅拌15分钟，添加Et2O(15mL)和NH4Cl(饱和，10mL)。将有机相用NH4Cl(饱和，10mL)再洗涤两次，经MgSO4干燥并蒸发，得到呈黄色固体状的61(98mg，0.303mmol，99％)。未经进一步纯化即使用。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.97(s,1H),7.74-7.81(m,J＝8.78Hz,2H),7.67-7.74(m,J＝8.78Hz,2H),4.41(d,J＝6.02Hz,2H),1.32-1.41(m,9H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ139.0,135.1,120.4,117.8,107.2,105.1,81.3,64.5,28.4；ESI-MS:C17H18N5O2 +[M+H]+,323.14；实验值323.13。
三氟乙酸(1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲铵(62)：
向61(1当量，21.5mg，0.0665mmol)于DCM(1mL)中的溶液中添加TFA(20当量，151mg，0.0988mL，1.33mmol)。使所得反应混合物在室温下过夜(或在37℃下2小时)，在蒸发所有挥发性化合物后得到目标产物(22.4mg，0.0665mmol，100％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.74(s,1H),7.99-8.15(m,2H),7.85-7.97(m,2H),4.25-4.45(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ141.2,138.9,135.2,122.3,120.3,117.7,104.4,81.1,62.9,34.0；ESI-MS:C12H10N5 +[M]+,227.09；实验值227.10。
N-((1-(4-(氰基乙炔基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-4-(3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基)苯甲酰胺(63)：
将4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苯甲酸(1当量，57.8mg，0.251mmol)、HATU(1当量，95.5mg，0.251mmol)和DIPEA(3当量，97.4mg，0.125mL，0.753mmol)于DMF(2mL)中的溶液添加在62(1当量，84.7mg，0.251mmol)上。将所得反应物质搅拌10分钟并通过HPLC纯化，得到呈白色固体状的目标化合物(76.5mg，0.176mmol，70％)。
ESI-HRMS:C21H12F3N7O,435.10554；实验值435.10512。
化合物63可用于根据本发明的标记方法，例如用于蛋白质的光标记。
(2-((2-(4-(氰基乙炔基)苯甲酰胺基)乙基)二硫基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(64)：
向23(1当量，36mg，0.143mmol)于ACN(1mL)中的溶液中添加N-{2-[(2-氨基乙基)二硫基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(1当量，36mg，0.143mmol)和DIPEA(2.12当量，39.1mg，0.05mL，0.303mmol)于ACN(1mL)中的溶液。使所得反应混合物静置10分钟，然后蒸发溶剂并且通过快速色谱法纯化粗产物，得到呈浅黄色固体状的目标产物(29.3mg，0.0723mmol，51％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.74-7.84(m,J＝8.53Hz,2H),7.58-7.74(m,J＝8.53Hz,2H),3.60(t,J＝6.78Hz,2H),3.23-3.35(m,2H),2.85(t,J＝6.78Hz,2H),2.71(t,J＝6.90Hz,2H),1.32(s,9H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ167.3,157.0,137.3,133.5,127.5,120.1,104.4,81.5,78.8,63.1,39.3,39.1,37.8,27.4,26.6；ESI-MS:C19H24N3O3S2 +[M+H]+,406.12；实验值406.10。
三氟乙酸2-((2-(4-(氰基乙炔基)苯甲酰胺基)乙基)二硫基)乙-1-铵(65)：
向64(1当量，29.3mg，0.0723mmol)于ACN-DCM混合物(1mL的每种溶剂)中的溶液中添加TFA(10当量，82.4mg，0.0537mL，0.723mmol)。将所得反应混合物搅拌24小时，并蒸发，得到呈无色液体状的目标化合物65(30mg，0.0715mmol，99％)。
ESI-HRMS:C14H16N3OS2 +,306.07293；实验值306.07312。
三氟乙酸2-((2-(4-(氰基乙炔基)苯甲酰胺基)乙基)二硫基)乙-1-铵(66)：
将62(0.567当量，10.1mg，0.0299mmol)于MeOH(0.0881mL)中的溶液缓慢添加至2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酸(1当量，21.4mg，0.0528mmol)于水(0.661mL)中的溶液中。利用冰冷却混合物并且使用DIPEA(25.2当量，172mg，0.22mL，1.33mmol)调节pH至5。逐滴添加EDC(0.65当量，6.59mg，0.0344mmol)的水溶液并且在冰冷却下搅拌20分钟。使用DIPEA使pH升高至8并且在室温下反应30分钟。使用HPLC监测反应终点。
ESI-HRMS:C28H35N9O7 +,609.26594；实验值609.26417。
化合物66可以用作螯合剂。
5-((4-((4-(2-氰基-1-((2-(4-((4-((E)-(2,5-二甲氧基-4-((E)-(4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基苯基)-(甲基)氨基)丁酰胺基)乙基)硫基)乙烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)氨甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯(A)：
4-((4-((E)-(2,5-二甲氧基-4-((E)-(4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)(甲基)氨基)-丁酸(BHQ-2)
将FastBlackK(氯化锌)半盐(实用级，约30％染料含量)(7.76g)悬浮在冷水(150.0mL，0℃)中并搅拌20分钟。将悬浮液过滤，并且将红色溶液逐滴添加至4-(甲基(苯基)氨基)丁酸(1.33g，6.88mmol)、浓盐酸(3.1mL)和乙酸钠(3.6g，43.90mmol)于水-丙酮混合物(1:1)(150.0mL)中的冷(0℃)混合物中。将反应混合物在10℃下搅拌15分钟并且在室温下搅拌2小时。然后用乙酸乙酯(3×150mL)萃取粗反应物并且将合并的有机层经Na2SO4干燥。通过柱色谱法在硅胶(100％EtOAc，然后100％DCM至DCM/MeOH(95:5))上纯化粗产物。获得呈深紫色固体状的BHQ-2(1.36g，39％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.31(d,J＝9.0Hz,2H),8.00(d,J＝9.0Hz,2H),7.86(d,J＝9.0Hz,2H),7.45(s,1H),7.40(s,1H),6.77(d,J＝9.0Hz,2H),4.05(s,3H),4.00(s,3H),3.5(t,J＝7.1Hz,2H),2.36(t,J＝7.1Hz,2H),1.98-1.90(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ176.2,157.1,154.3,153.0,151.4,149.0,147.4,145.0,142.6,126.9,125.3,124.2,112.1,101.7,100.7,57.2,52.3,39.0,31.6,22.9。
65b：4-((4-((E)-(2,5-二甲氧基-4-((E)-(4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)(甲基)氨基)-N-(2-巯基乙基)丁酰胺((BHQ-2)-SH)
将BHQ-2(1当量，92.2mg，0.182mmol)溶解在DMF(5mL)和DCM(10mL)的混合物中。添加TEA(6当量，152μL，1.09mmol)和二氯化胱胺(5当量，204mg，0.91mmol)。将混合物冷却至0℃并且添加HBTU(1当量，69mg，0.182mmol)。使溶液达到室温并搅拌15小时。当达到总转化率时，添加DTT(6当量，168mg，0.162mL，1.09mmol)。在所得混合物已经在室温下搅拌10分钟后，将粗物质用饱和NaHCO3溶液(75mL)稀释并用EtOAc(2×50mL)萃取。将有机层合并，用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤并经Na2SO4干燥。通过柱色谱法在硅胶(DCM/MeOH，从100:0至95:5)上纯化粗产物，得到呈深紫色固体状的(BHQ-2)-SH(60.7mg，0.107mmol，59％)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.33(d,J＝9.0Hz,2H),8.0(d,J＝9.1Hz,2H),7.9(d,J＝9.1Hz,2H),7.42(s,1H),7.42(s,1H),6.75(d,J＝9.00Hz,2H),5.90(t,J＝5.6Hz,1H),4.06(s,3H),4.01(s,3H),3.49(t,J＝7.4Hz,2H),3.41(dt,J＝6.2,6.4Hz,2H),2.64(td,J＝6.4,8.47Hz,2H),2.24(t,J＝7.4Hz,2H),2.01-1.94(m,2H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ172.2,156.6,153.8,152.4,151.1,148.5,147.0,144.7,142.3,126.4,124.9,123.7,111.6,101.2,100.3,57.0,56.9,51.8,42.5,38.7,33.4,24.9,23.0；HR-ESI-MS:C27H31N7O5S,565.2107；实验值565.2105。
67：5-((4-((4-(氰基乙炔基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)氨甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯
在0℃下向冷却至0℃的经过脱气的62a(1当量，17.3mg，0.0507mmol)和TAMRA-5'-COOH(1当量，21.8mg，0.0507mmol)于DMF(1.4mL)中的溶液中添加HBTU(1当量，19.2mg)。将所得反应物质搅拌5分钟并且添加TEA。将反应物质在25℃下搅拌1小时，蒸发并通过HPLC纯化，得到呈深紫色固体状的65a(22mg，68％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.8(br.s,1H),8.7(s,1H),8.08-8.16(d,J＝8.2Hz,1H),7.60-7.70(d,J＝8.9Hz,2H),7.49-7.58(d,J＝8.9Hz,2H),7.32-7.39(d,J＝8.2,1H),δ7.01(s,4H),6.93(s,2H),3.48-3.58(m,2H),3.26(s,12H),2.44-2.54(t,J＝7.17Hz,2H),1.98-2.12(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)-无信息；HR-ESI-MS:639.24817；实验值639.24310。
A：5-((4-((4-(2-氰基-1-((2-(4-((4-((E)-(2,5-二甲氧基-4-((E)-(4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基苯基)-(甲基)氨基)丁酰胺基)乙基)硫基)乙烯基)苯基)氨基)-4-氧代丁基)氨甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯
向经过脱气的BHQ-SH(1.13当量，2mg，0.00354mmol)于DCM(0.5mL)中的溶液中添加经过脱气的67(1当量，2mg，0.00313mmol)于甲醇(0.5mL)中的溶液。添加TEA(4.6当量，2μL，0.0144mmol)并且使所得反应物质在25℃下过夜。蒸发溶剂；将粗产物溶解在DMSO(0.5mL)中并通过HPLC纯化，得到呈深紫色固体状的BHQ-APN-TAMRA(A，2.7mg，0.00225mmol，72％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.63(d,J＝2.0Hz,1H),8.34(d,J＝8.8Hz,2H),8.22(dd,J＝7.8,2.0Hz,1H),8.00(d,J＝8.8Hz,2H),7.75(d,J＝9.0Hz,2H),7.69(d,J＝8.5Hz,2H),7.53(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(d,J＝8.5Hz,2H),7.34(d,J＝9.0Hz,2H),6.75-6.86(m,8H),5.48(s,1H),4.02(s,3H),3.92(s,3H),3.58-3.63(m,2H),3.45-3.52(m,2H),3.21(s,12H),3.16(t,J＝6.9Hz,2H),3.08(s,3H),2.71(t,J＝6.5Hz,2H),2.55(t,J＝6.2Hz,2H),2.22(t,J＝6.9Hz,2H),2.08-2.16(m,2H),1.88-1.96(m,2H),1.61(br.s,1H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)-无信息；HR-ESI-MS:C65H65N12O10S+[M+H]+,1205.46618；实验值1205.46748。
5-((3-(3-((2-(4-((4-((E)-(2,5-二甲氧基-4-((E)-(4-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)(甲基)氨基)丁酰胺基)乙基)硫基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丙基)氨甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯(B)：
B-4：3a,4,7,7a-四氢-1H-4,7-环氧基异吲哚-1,3(2H)-二酮
根据先前所述的程序合成这种化合物。845
B-3：(3-((3aR,7aS)-1,3-二氧代-3a,4,7,7a-四氢-1H-4,7-环氧基异吲哚-2(3H)-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯
向B-4(1当量，1.76g，10.7mmol)和N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯(2当量，5.07g，21.3mmol)于DMF(20mL)中的溶液中添加K2CO3(1.2当量，1.77g，12.8mmol)。将所得反应物质在50℃下加热18小时。使溶液冷却；过滤固体残余物并用DMF洗涤。将合并的有机部分蒸发，向所得浆液物质中添加己烷(50mL)。将所得悬浮液再搅拌一小时，过滤并用己烷洗涤，得到呈白色固体状的B-3(3.36g，10.4mmol，98％)。
1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ6.49(s,2H),5.23(s,2H),3.52(t,J＝6.5Hz,2H),2.96-3.09(m,2H),2.82(s,2H),1.66-1.75(m,2H),1.41(s,9H)；13CNMR(101MHz,氯仿-d)δ176.5,155.9,136.5,81.0,79.3,47.5,37.1,36.0,28.4,27.8。
B-2：1-(3-氨基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(TFA盐)
将66c(1当量，243mg，0.754mmol)于甲苯(25mL)中的溶液回流3小时。蒸发甲苯；将所得白色粗产物再次溶解在DCM(5mL)中，添加TFA(0.5mL)。持续搅拌2小时直至原料完全消失(通过TLC控制)。在通过甲醇(3mL)淬灭反应后蒸发溶剂。所得1-(3-氨基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(B-2，TFA盐，190mg，94％)未经进一步纯化即使用。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ6.76(s,2H),3.52(t,J＝6.7Hz,2H),2.80-2.88(m,2H),1.76-1.88(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ170.6,135.6,38.5,35.4,28.0。
B-1：2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)-5-((3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙基)氨甲酰基)苯甲酸酯(TAMRA-马来酰亚胺)：
此处向TAMRA-5'-COOH(1当量，71.5mg，0.166mmol)于DMF(3.21mL)中的溶液中添加TEA(2.5当量，57.7μL，0.415mmol)和HATU(1.12当量，70.7mg，0.186mmol)。将所得反应物质再搅拌5分钟并且添加B-2(1当量，71.5mg，0.166mmol)。持续搅拌25分钟并且将反应物质减压蒸发至约1mL的体积，并且通过制备型HPLC纯化反应物质，得到呈粉红色固体状的TAMRA-马来酰亚胺(B-1，34.8mg，0.0615mmol，37％)。
1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.66(d,J＝1.8Hz,1H),8.14(dd,J＝1.8,8.0Hz,2H),7.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.02(d,J＝9.5Hz,1H),6.92(dd,J＝9.5,2.2Hz,2H),6.81(d,J＝2.2Hz,2H),6.72(s,2H),3.52(t,J＝6.8Hz,2H),3.34(t,J＝7.0Hz,2H),3.17(s,12H),1.80-1.90(m,2H)；13CNMR(101MHz,甲醇-d4)δ172.5,168.2,167.4,160.6,159.0,158.9,138.1,137.7,137.6,135.5,132.9,132.3,132.0,131.4,115.6,114.8,97.5,82.4,41.0,38.6,36.4,29.3。HR-ESI-MS:C32H30N4O6,566.21653；实验值566.21654。
B：5-((3-(3-((2-(4-((4-((E)-(2,5-二甲氧基-4-((E)-(4-硝基-苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)(甲基)氨基)丁酰胺基)乙基)硫基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丙基)氨甲酰基)-2-(6-(二甲基氨基)-3-(二甲基亚氨基)-3H-呫吨-9-基)苯甲酸酯
向经过脱气的BHQ-SH(1.15当量，4.6mg，0.00812mmol)于DCM(0.5mL)中的溶液中添加经过脱气的TAMRA-马来酰亚胺(B-1)(1当量，4mg，0.00313mmol)于甲醇(0.5mL)中的溶液。添加TEA(5当量，5μL，0.0353mmol)并且使所得反应物质在25℃下过夜。蒸发溶剂；将粗产物溶解在DMSO(0.5mL)中并通过HPLC纯化，得到呈深紫色固体状的B(7mg，0.00621mmol，88％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.91(t,J＝6.1Hz,1H),8.68(s,1H),8.43(d,J＝9.1Hz,2H),8.31(d,J＝8.9Hz,1H),8.01-8.10(m,3H),7.77(d,J＝9.1Hz,2H),7.60(d,J＝7.8Hz,1H),7.39(s,1H),7.33(s,1H),6.99(s,3H),6.89(s,1H),6.85(d,J＝9.1Hz,2H),4.04(dd,J＝3.9,8.9Hz,1H),3.98(s,3H),3.92(s,3H),3.41-3.45(m,2H),3.27-3.38(m,6H),3.23(m,12H),3.06(s,3H),2.85-2.95(m,1H),2.72-2.81(m,1H),2.52-2.56(m,2H),2.17(t,J＝7.3Hz,2H),1.74-1.88(m,4H)。HR-ESI-MS:C59H62N11O11S+[M+H]+,1132.43455；实验值1132.43384。
实施例2：用本发明化合物标记半胱氨酸衍生物
一般程序
随后向含有985μL的PBS(1×，pH7.6)的小瓶中添加5μL的苯甲酰胺储备溶液(10mM于水中)、5μL的芳基丙炔腈储备溶液(1-12，10mM于DMSO中)和5μL的AcCysNHBn储备溶液(7m，10mM于DMSO中)。通过HPLC(在反应0分钟和30分钟时注入)分析反应混合物的等分试样(50μL)。根据内标峰面积对原料和水解产物的峰下面积进行归一化。
结果
所得结果总结在下表2中，其呈现在50μM浓度的每种试剂和25℃下在7m存在下化合物1-12在30分钟内的转化率。反应对由丙炔腈基团邻位的取代基(条目1、5、8-9、4)诱导的空间位阻以及取代基的电子作用极其敏感：-I和-M取代基增加化合物的反应性(条目10和12)，而+M取代基降低化合物的反应性(条目3和7)。
*观测到副产物；**在60分钟内的转化率。
表2
实施例3：式(I)化合物的水解稳定性和与苯基马来酰亚胺的比较
随后向含有980μL的PBS(1×，pH7.6)的小瓶中添加10μL的苯甲酰胺储备溶液和10μL的亲电子试剂储备溶液(苯基马来酰亚胺1或11)，得到1mM的最终浓度(内标和亲电子试剂)。对于水解5小时(每30分钟注入)，通过HPLC分析反应混合物的等分试样(50μL)。根据内标峰面积对原料和水解产物的峰下面积进行归一化。
所得结果呈现于图4和图5中。仅对于苯基马来酰亚胺1观测到显著的水解(PhMal，k观测＝7×10-5s-1)。11未显示可检测的浓度变化。
实施例4：式(III)化合物的稳定性
下列化合物在不同条件下的稳定性
在DMSO中制备“加成产物”的100mM储备溶液并储存在-20℃。将1μL储备溶液添加至999μL工作溶液中，得到100μM最终浓度的基质。在0、30和60分钟时分析等分试样。根据内标(苯甲酰胺)的峰面积对原料的峰下面积进行归一化。所有测量都在25℃下进行。
下表3示出“加成产物”在不同介质中在一个小时内的转化率。
表3
这个实验清楚地表明，加成产物是稳定的并且在广泛多种条件下经历很少降解，特别是对于0至14范围内的pH。
另外，当加成产物持续1小时暴露于包含过量的另一种硫醇如苯基硫醇或谷胱甘肽的介质时，几乎未观测到任何硫醇交换。
式(III)化合物的稳定性和与马来酰亚胺的比较
在不同生物条件下研究下文化合物A(根据本发明)和B(参考化合物)的稳定性。
细胞培养：
使来自小鼠的正常肝脏BNLCL.2细胞在补充有10％胎牛血清(Perbio,Brebieres,France)、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Eurobio)的含1g/l葡萄糖(Eurobio,LesUlis,France)的达尔伯克氏MEM培养基(Dulbecco'sMEMmedium)中生长。将细胞维持在37℃下5％CO2加湿气氛中。
显微镜法：
在实验之前24小时，将2.5×104BNLCL.2细胞接种在8孔Lab-TekII腔室玻璃罩板(ref155409，Nunc,Naperville,IL,USA)中的每个孔中。将所需量的探针A和B在MEM完全培养基中稀释至300μl，得到1μM的最终浓度，然后添加在细胞上。使用5μg/ml的Hoechst118溶液作为核标记物。在用10％FBS不含酚红的伊格尔MEM培养基(Eagle'sMEMmedium)洗涤后，利用共焦LeicaTSCSPEII显微镜观测细胞。
血细胞计数：
在实验前一天，将BNLCL.2细胞在达尔伯克氏MEM完全培养基中以2.0×104个细胞/孔接种在96孔板(GreinerBioOne,Frickenhausen,Germany)中。在达尔伯克氏MEM完全培养基中以1μM浓度制备两种探针(A和B)并且在不同时间(2、6和24小时)添加在细胞上。在用PBS(Eurobio)洗涤后，用40μl胰蛋白酶温育5分钟，并且添加160μl的PBSEDTA5mM，通过流式细胞术在PCA-96Guava流式细胞仪(GuavaTechnologiesMerckMillipore,Billerica,MA,USA)上用绿色激光分析细胞。
首先，化合物A在人类血浆中远比化合物B更稳定(参见图1)。
其次，化合物A在细胞中远比化合物B更稳定(参见图2)。
实施例4：本发明化合物对硫醇部分的选择性
对于非保护的氨基酸的苯甲酰胺进行选择性筛选。在DMSO中制备氨基酸的苯甲酰胺(呈TFA盐形式)和亲电子试剂(苯基丙炔腈和苯基马来酰亚胺)的100mM储备溶液并储存在-20℃。在蒸馏水中制备苯甲酰胺(用作内标)的100mM储备溶液并储备在-20℃。利用ShimadzuLC用SunFireTMC185μM4.6×150mm柱(Waters)进行反应混合物的分析。HPLC参数如下：流动速率1mL/min，梯度为从0至20分钟的5％至95％的流动相B，接着5分钟为95％的流动相和回复时间为5分钟。流动相A为0.05％TFA的水溶液(mQ)(v/v)，并且流动相B为乙腈(HPLC级)。使用Shimadzu分析软件来分析数据。根据内标(苯甲酰胺)的峰面积对信号进行归一化。使用氨基酸苯甲酰胺的峰下面积来计算其在反应期间的转化率。
将10μL的氨基酸苯甲酰胺储备溶液和2.5μL的苯甲酰胺储备溶液添加至含有977.5μLPBS(1×，pH7.6)的小瓶。搅拌溶液并且添加10μL的亲电子试剂储备溶液，得到1mM最终浓度的试剂和0.25mM浓度的苯甲酰胺。对于水解1小时(在0、30和60分钟注入)，通过HPLC分析反应混合物的等分试样(50μL)。根据内标峰面积对原料和水解产物的峰下面积进行归一化。在苯基丙炔腈的情况下，没有氨基酸模型得到大于1.6％的转化率(参见下表3)。相反，当测试苯基马来酰亚胺时，一些氨基酸苯甲酰胺显示高达8.5％的转化率。在一些情况下通过质谱法(ESI-LCMS)检测相应加合物的质量(以粗体显示，表4)。
下表4呈现在苯基丙炔腈(1)的存在下苯甲酰胺在PBS(1×，pH7.6)中在1小时内的转化率。
氨基酸苯甲酰胺 转化率 氨基酸苯甲酰胺 转化率
CysNHBn(7a) 98％ TyrNHBn(7g) 1.6％63 -->
GlyNHBn(7b) 0.2％ HisNHBn(7h) 0.6％
AlaNHBn(7c) 0.1％ GlnNHBn(7i) 0.1％
ValNHBn(7d) 0.7％ TrpNHBn(7j) 1.3％
SerNHBn(7e) 0.3％ ArgNHBn(7k) 0.4％
MetNHBn(7f) 0.1％ AspNHBn(7l) 0.6％
表4
下表5呈现在苯基马来酰亚胺的存在下苯甲酰胺在PBS(1×，pH7.6)中在1小时内的转化率。粗体值对应于通过ESI-LCMS检测相应加合物质量的值。
氨基酸苯甲酰胺 转化率 氨基酸苯甲酰胺 转化率
CysNHBn(7a) 100％ TyrNHBn(7g) 2.4％
GlyNHBn(7b) 3.3％ HisNHBn(7h) 8.5％
AlaNHBn(7c) 0.2％ GlnNHBn(7i) 1.7％
ValNHBn(7d) 0.9％ TrpNHBn(7j) 1.0％
SerNHBn(7e) 2.8％ ArgNHBn(7k) 2.9％
MetNHBn(7f) 1.9％ AspNHBn(7l) 1.3％
表5
总之，本发明化合物对硫醇部分(当与其他部分比较时)的选择性明显高于相应化合物所获得的选择性，其中丙炔腈部分被马来酰亚胺部分置换。
实施例5：毒性测试
通过MTT测定法对HaCaT细胞系研究以下式(II)的“连接子”化合物的毒性：
使用MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)测定法来测量体外细胞毒性。在96孔板中进行实验，其中HaCaT细胞在细胞培养基(补充有10％胎牛血清和1mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基，每孔200μL)中生长至汇合。在37℃下用不同浓度(通过连续1/2稀释，100μM至0.78μM)的化学试剂温育细胞24小时。在温育后，用含有MTT(300μg/mL)的新鲜培养基替换上清液。在37℃下温育2小时后，小心地除去培养基并且添加100μLDMSO以溶解通过MTT的线粒体酶诱导还原而产生的甲腊(formazan)晶体。使用微量板读取器(Biotek,SynergyHT)测量595nm下的吸光度。细胞存活率以未处理的对照细胞的百分比形式表示。
MTT测试的结果呈现于图5上，并且清楚地表明，式(II)化合物不具毒性并且因此可例如用于生物应用。
实施例6：用式(I)化合物标记溶菌酶：
溶菌酶的胰蛋白酶消化物的标记
将1nmol溶菌酶溶解在NH4HCO3(25mM)中并且在57℃下在1小时内用1mMTCEP还原。将APN-TMPP溶液(1mM于DMSO中)以1:200的摩尔比添加至蛋白质中。然后，利用猪胰蛋白酶(PromegaV5111)对标记蛋白进行蛋白水解。在35℃下在25mM碳酸氢铵中用1:100(w/w)胰蛋白酶消化样品过夜。进行NanoLC-MS/MS分析以追踪反应。在与配备有纳米电喷雾源的Q-TOFmaXis(BrukerDaltonics,Bremen,Germany)质谱仪耦合的nanoACQUITY超性能LC系统(Waters,Milford,MA)上利用C18反相nanoHPLC分析所得肽混合物。在nanoACQUITY超性能LC上进行色谱分离。在ACQUITYBEH130C18柱(Waters公司)(75μm×200mm，1.7μm粒径)上分离肽。溶剂体系由0.1％甲酸的水溶液(溶剂A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(溶剂B)组成。在20×0.18mm、5μmSymmetryC18预柱(Waters公司)上在3分钟内在5μL/min下用99％的溶剂A和1％的溶剂B进行捕捉。在50℃下使用1-50％梯度的溶剂B持续30分钟，接着快速升至80％(5分钟)的溶剂B，以300nL/min的流动速率进行洗脱。利用Hystar3.2(BrukerDaltonics)完全控制整个系统。在以下设置下操作Q-TOF仪器：源温度设置为200℃，干燥气体流速为4l/h，并且纳米电喷雾电压为4kV。使用ES-TOF调谐混合(AgilentTechnologies)在50至2200m/z范围上以正模式实现TOF的质量校准。对于串联MS实验，在m/z范围[50-2200]上在MS与MS/MS模式之间的自动切换下操作系统。在MS中，累积时间为0.2秒。在MS/MS中，以母离子强度为函数，累积时间在0.2秒与1.4秒之间加权。在每个MS光谱上选择2种最丰富的肽(强度阈值400au)，优选地具有两个、三个、四个或五个电荷的离子用于进一步分离并且使用碰撞能量分布用2个能量组进行CID片段化。使用氩气作为碰撞气体来进行片段化。对胰蛋白酶肽进行手动测序(从头)以确认其序列并找到由APN-TMPP探针标记的半胱氨酸。基于所计算肽序列的单同位素质量，使用提取离子色谱图(EIC)鉴定肽。
通过在室温下研究在200:1摩尔比的APN-TMPP(1μM)与蛋白质(与半胱氨酸部分为约10:1)下APN-TMPP与胰蛋白酶消化物的反应来评估APN-TMPP化学选择性，持续一小时。通过LC-MS/MS分析在不存在和存在化学衍生下获得的肽混合物。所有可检测的含半胱氨酸的肽与探针反应并且延迟，而不含半胱氨酸的肽不受影响。通过LC-MS基于标记肽强度与非标记肽强度之间的比率来评估标记效率。98％以上的所检测肽被完全标记。LC-MS结果清楚地表明，含半胱氨酸的肽由于添加疏水性TMPP基团而具有增加的滞留时间，而所有其他肽的滞留时间未改变(表6)。
下表6示出在与APN-TMPP反应之前和之后的溶菌酶的胰蛋白酶消化物的LC-MS分析结果。
[a]半胱氨酸残基呈粗体。
表6
实施例7：增溶APN试剂(49-54)与CD38A275C突变体的结合
该实验的一般方案(关于用49修饰CD38突变体的实施例)示于图6上。
向300μL的CD38C275溶液(1mg/mL)中添加6μL的增溶APN试剂(49-54)于DMSO中的50mM溶液。并行地，作为对照，向300μL的CD38C275中添加6μL的DMSO。将两种样品在25℃下温育15小时，然后透析5次(膜截止为10k)，得到各30μL的最终体积(10mg/mL)。通过DLS测量聚集体的尺寸。
实施例8：CD38-CD375突变体的标记和与马来酰亚胺的比较
a)本发明化合物和相应马来酰亚胺的稳定性
合成以下化合物：
稳定性研究证实，根据本发明的化合物在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中稳定24小时。相比较而言，包含马来酰亚胺部分的相应化合物在PBS中在一小时后降解70％。
b)与CD38突变体反应
使两种化合物与CD38-C375突变体的2μM溶液反应。
在纯化后的凝胶电泳显示，相比于利用相应的马来酰亚胺化合物，利用根据本发明的化合物可获得较高的标记率。图7呈现在纯化之前和之后利用本发明化合物和马来酰亚胺获得的凝胶电泳。
实施例9：使用化合物18进行曲妥珠单抗与TAMRA的结合
该实验的一般方案示于图8上。
向曲妥珠单抗溶液(100μL，10mg/mL，于50mM硼酸盐缓冲液中，pH8.5)中添加1.74μL的18的溶液(10mg/mL，于DMSO中)。在25℃下温育1小时后，添加0.69μL的TAMRA-SH(100mM，于DMSO中)。将混合物在25℃下温育16小时并且通过尺寸排阻色谱法纯化结合物。
使用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)代替18来进行比较实验。
所得结合物的SDS-PAGE分析(图9)显示，相比于SMCC，化合物18允许更高水平的结合。
使用18制备的结合物的天然ESI-MS分析(图10、图11)表明，每个抗体结合平均一个TAMRA分子。
使用SMCC制备的结合物的天然ESI-MS分析(图12、图13)表明不可区分物种的复杂混合物。
实验表明，化合物18允许更高水平的结合并且相比于一般应用的SMCC提供更清洁的结合物群体。
实施例10：化合物58与部分还原的曲妥珠单抗的直接结合
该实验的一般方案示于图14上。
向曲妥珠单抗溶液(100μL，10mg/mL，于50mMPBSpH7.4中，具有10mMEDTA)中添加TCEP溶液(10mM于水中，1.1或2.2当量)。将混合物在37℃下温育2小时，然后添加58的溶液(8.25μL，10mM于DMSO中)。将混合物在25℃下温育16小时并且通过尺寸排阻色谱法纯化结合物。
所得结合物的SDS-PAGE分析(图15)表明，化合物58共价连接至抗体。ESI-MS分析表明，使用2.2当量的TCEP，每个抗体结合平均4个分子。
实施例11：使用化合物33和34进行抗体片段的再桥接
该实验的一般方案示于图16上。
向曲妥珠单抗溶液(100μL，10mg/mL，于50mMPBSpH7.4中，具有10mMEDTA)中添加TCEP溶液(10mM于水中，5当量)。将混合物在37℃下温育2小时，然后添加33或34的溶液(10mM于DMSO中，15当量)。将所得溶液在25℃下温育16小时，然后通过SDS-PAGE在还原条件下分析。
SDS-PAGE分析表明，抗体片段被化合物33和34成功桥接(图17)。

Claims (9)

1.一种制备被标记的包含硫醇部分的化合物的方法，其包括使包含硫醇部分的化合物与式(I)化合物接触：
其中R1至R5中的每一个在由以下组成的群组中独立地选择：
-氢原子，
-烷基、烯烃或炔烃基团，任选地间杂有选自O、N和S的至少一个杂原子，
-芳基基团，
-烷氧基基团，
-卤素原子，
-氨基(-NRR')基团，其中R和R'独立地是氢原子、烷基、烯烃、炔烃或芳基基团，
-羟基胺(-ONH2)基团，
-肼(-NH-NH2)基团，
-硝基(-NO2)基团，
-叠氮基(-N3)基团，
-重氮(-N2 +)基团，
-马来酰亚胺基团，
-烷基-羧基或芳基-羧基(-C(＝O)OR)基团，
-烷基-羰基或芳基-羰基(-C(＝O)R)基团，
-羟基(-OH)基团，
-硼酸-B(OR”)2基团，其中R”是氢原子或烷基基团，
-膦或鏻基团，
-异氰酸酯(-N＝C＝O)或异硫氰酸酯(-N＝C＝S)基团，
-氯磺酰基(-SO2Cl)基团，
--O-C(＝O)-C(N2)-CF3基团或-C(＝O)-C(N2)-CF3基团，
-活化酯如-C(＝O)-NHS、全氟化酯和酰脲，
--C≡C-C≡N基团，
-标签，和
-被先前所列出基团中的至少一个取代的烷基基团，
可选地，R1至R5中的两个可能与其所连接的苯基环的碳原子一起形成单环或多环，并且
其中R1至R5中的至少一个包含标签部分，其选自由适于允许以下中的一项或几项的化学基团组成的群组：
-所述化合物的检测，
-所述化合物对所关注试剂的矢量化，
-所述化合物的增溶，
-所述化合物的稳定化，
-所述化合物的提取和/或纯化的改进，
-所述化合物的ADME(施用、分布、代谢、排泄)参数中的至少一个的改进；
-增添所述化合物的生物活性；和
-增添点击化学的适当功能性。
2.一种式(I)化合物：
其中R1至R5如权利要求1中所定义，并且其中R1至R5中的至少一个包含标签部分，其选自由适于允许以下中的一项或几项的化学基团组成的群组：
-所述化合物的检测，
-所述化合物对所关注试剂的矢量化，
-所述化合物的增溶，
-所述化合物的稳定化，
-所述化合物的提取和/或纯化的改进，
-所述化合物的ADME(施用、分布、代谢、排泄)参数中的至少一个的改进；
-增添所述化合物的生物活性；和
-增添点击化学的适当功能性。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组：
4.一种式(II)化合物：
其中R1至R5中的每一个在由以下组成的群组中独立地选择：
-氢原子，
-烷基、烯烃或炔烃基团，任选地间杂有选自O、N和S的至少一个杂原子，
-芳基基团，
-烷氧基基团，
-卤素原子，
-氨基(-NRR')基团，其中R和R'独立地是氢原子、烷基、烯烃、炔烃或芳基基团，
-羟基胺(-ONH2)基团，
-肼(-NH-NH2)基团，
-硝基(-NO2)基团，
-叠氮基(-N3)基团，
-重氮(-N2 +)基团，
-马来酰亚胺基团，
-烷基-羧基或芳基-羧基(-C(＝O)OR)基团，
-烷基-羰基或芳基-羰基(-C(＝O)R)基团，
-羟基(-OH)基团，
-硼酸-B(OR”)2基团，其中R”是氢原子或烷基基团，
-膦或鏻基团，
-异氰酸酯(N＝C＝O)或异硫氰酸酯(-N＝C＝S)基团，
-氯磺酰基(-SO2Cl)基团，
-O-C(＝O)-C(N2)-CF3基团或-C(＝O)-C(N2)-CF3基团，
-活化酯如-C(＝O)-NHS、全氟化酯和酰脲，
-标签，和
-被先前所列出基团中的至少一个取代的烷基基团，
可选地，R1至R5中的两个可能与其所连接的苯基环的碳原子一起形成单环或多环，并且
其中R1至R5中的至少一个包含马来酰亚胺、NHS酯、叠氮化物或炔烃部分。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组：
6.一种式(II)化合物：
其中R1至R5中的每一个在由以下组成的群组中独立地选择：
-氢原子，
-烷基、烯烃或炔烃基团，任选地间杂有选自O、N和S的至少一个杂原子，
-芳基基团，
-烷氧基基团，
-卤素原子，
-氨基(-NRR')基团，其中R和R'独立地是氢原子、烷基、烯烃、炔烃或芳基基团，
-羟基胺(-ONH2)基团，
-肼(-NH-NH2)基团，
-硝基(-NO2)基团，
-叠氮基(-N3)基团，
-重氮(-N2 +)基团，
-马来酰亚胺基团，
-烷基-羧基或芳基-羧基(-C(＝O)OR)基团，
-烷基-羰基或芳基-羰基(-C(＝O)R)基团，
-羟基(-OH)基团，
-硼酸-B(OR”)2基团，其中R”是氢原子或烷基基团，
-膦或鏻基团，
-异氰酸酯(N＝C＝O)或异硫氰酸酯(-N＝C＝S)基团，
-氯磺酰基(-SO2Cl)基团，
-O-C(＝O)-C(N2)-CF3基团或-C(＝O)-C(N2)-CF3基团，
-活化酯如-C(＝O)-NHS、全氟化酯和酰脲，
-标签，和
-被先前所列出基团中的至少一个取代的烷基基团，
可选地，R1至R5中的两个可能与其所连接的苯基环的碳原子一起形成单环或多环，并且
其中R1至R5中的至少一个键合至所关注化合物，所述化合物选自由荧光团、包含至少一个放射性原子的原子团、已知质量的原子团、配体、药物、治疗剂、生物分子、DNA片段、纳米物体或支撑物组成的群组。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中所述所关注化合物是生物分子，其中所述生物分子是抗体或蛋白质。
8.一种式(III)化合物：
其中R1至R5如权利要求2中所述，并且其中R6-SH是包含至少一个硫醇部分的化合物。
9.一种式(III)化合物：
其中R1至R5如权利要求3中所述，并且其中R6-SH是包含至少一个硫醇部分的化合物，R6是包含碳、氢、氧、氮、磷和/或硫原子的化学基团。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106748955A (zh) * 2016-12-07 2017-05-31 南开大学 N‑取代‑5‑亚甲基‑吡咯‑2‑酮类化合物的合成方法及应用
CN112153987A (zh) * 2018-04-10 2020-12-29 伊纳泰里斯公司 抗体-药物缀合物及其用于治疗癌症的用途
CN113135846A (zh) * 2021-04-07 2021-07-20 吉和昌新材料(荆门)有限公司 一种磺基甜菜碱型水性聚氨酯扩链剂的制备方法
US11192883B2 (en) * 2018-10-26 2021-12-07 University Of South Alabama Functionalized materials and compounds
US12006309B2 (en) 2021-11-30 2024-06-11 University Of South Alabama Functionalized materials and compounds

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6241654B2 (ja) * 2013-10-17 2017-12-06 Dic株式会社 重合性化合物及び光学異方体
EP3079668A1 (en) 2013-12-09 2016-10-19 Durect Corporation Pharmaceutically active agent complexes, polymer complexes, and compositions and methods involving the same
EP3225257A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-04 Université de Strasbourg Amphiphilic monomers based nanovectors and their use for sirna delivery
EP3624854A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 Université de Strasbourg Protein-drug conjugates and their use in the treatment of cancers
WO2019210190A2 (en) * 2018-04-26 2019-10-31 Oregon Health & Science University Nile red derivatives for improved ratiometric imaging for nerve-specific contrast
KR20230133289A (ko) 2021-01-18 2023-09-19 아지노모토 가부시키가이샤 화합물 또는 이의 염, 및 이들에 의해 얻어지는 항체
CN113461650B (zh) * 2021-06-15 2022-06-07 贵州大学 一种杯芳烃-罗丹明超分子共组装体及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5025006A (en) * 1990-06-26 1991-06-18 Merck & Co., Inc. 2-biphenyl-carbapenem antibacterial agents
SE0102616D0 (sv) * 2001-07-25 2001-07-25 Astrazeneca Ab Novel compounds
CA2848301A1 (en) 2004-01-09 2005-07-28 United Parcel Service Of America, Inc. System, method and apparatus for capturing telematics data with an active rfid tag
EP3141905B1 (en) * 2008-03-27 2019-03-06 Promega Corporation Protein labeling with cyanobenzothiazole conjugates
US9156862B2 (en) * 2011-11-01 2015-10-13 The Florida International University Board Of Trustees Silylated azulenyl nitrone spin traps as chromotropic superoxide detectors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADAM R.LACY等: "Post-Cycloaddition–Retroelectrocyclization Transformations of Polycyanobutadienes"", 《EUROPEAN JOURNAL OF ORGANIC CHENMISTRY》 *
BORIS A等: "（Synthesis of Functionalized L-Cysteine and L-Methionine by Reaction with Electron-Deficient Acetylenes", 《SYNTHESIS》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106748955A (zh) * 2016-12-07 2017-05-31 南开大学 N‑取代‑5‑亚甲基‑吡咯‑2‑酮类化合物的合成方法及应用
CN112153987A (zh) * 2018-04-10 2020-12-29 伊纳泰里斯公司 抗体-药物缀合物及其用于治疗癌症的用途
CN112153987B (zh) * 2018-04-10 2024-01-09 伊纳泰里斯公司 抗体-药物缀合物及其用于治疗癌症的用途
TWI829683B (zh) * 2018-04-10 2024-01-21 法商英納特利斯 抗體藥物綴合物、包含其的醫藥組合物、組合物和凍乾調配物、預填充注射器或小瓶及獲得其的方法
US11192883B2 (en) * 2018-10-26 2021-12-07 University Of South Alabama Functionalized materials and compounds
CN113135846A (zh) * 2021-04-07 2021-07-20 吉和昌新材料(荆门)有限公司 一种磺基甜菜碱型水性聚氨酯扩链剂的制备方法
US12006309B2 (en) 2021-11-30 2024-06-11 University Of South Alabama Functionalized materials and compounds

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