CN105473726A - 酮异戊酸脱羧酶及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了具有酮异戊酸脱羧酶活性的多肽和编码此类多肽的多核苷酸。还提供了包含此类多肽和多核苷酸的重组宿主细胞以及将a-酮异戊酸转化成异丁醛的方法或通过使用本发明所公开的多肽生产异丁醇的方法。

Description

酮异戊酸脱羧酶及其使用方法

政府许可权利

本发明是在根据美国能源部批准的协议DE-AR0000006的政府支持下作出的。政府拥有本发明中的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请涉及并要求2011年7月28日提交的美国临时专利申请61/512,866的优先权，该专利申请以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及具有适合在异丁醇生产途径中发挥作用的α-酮异戊酸脱羧酶活性的多肽。

背景技术

丁醇是重要的工业化学品，作为燃料添加剂、在塑料工业中作为化学原料、以及在食品和风味剂工业中作为食品级的提取剂是有用的。每年有100至120亿磅的丁醇通过石油化学方法被生产，并且对这种日用化学品的需求未来将很可能增加。

丁醇异构体异丁醇的化学合成的方法是已知的，例如羰基合成，一氧化碳的催化氢化(Ullmann′sEncyclopediaofIndustrialChemistry，第6版，2003，Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.，Weinheim，Germany，第5卷，第716-719页)以及甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合(Carlini等人，J.Molec.Catal.A.Chem.220：215-220，2004)。这些方法使用来源于石油化学品的起始材料。由植物来源的原材料生产异丁醇能够使化石燃料的使用最小化，并将代表本领域中的进步。

美国专利7,851,188描述了在重组微生物中用于生产异丁醇的酶途径。在其中描述的用于生产异丁醇的一种代谢途径中的倒数第二步是α-酮异戊酸至异丁醛的转化。本领域中仍然存在鉴定适合用于异丁醇生物合成途径中的附加的酶的需求。

发明内容

本文提供了重组宿主细胞和利用本发明所公开的多肽将α-酮异戊酸转化成异丁醛的方法。在实施例中，所述方法包括：(a)提供多肽，其中所述多肽包含下列中的至少一种：(i)与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性；或(ii)α-酮异戊酸脱羧酶活性，大于约1的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约20mM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及(b)在其中产生异丁醛的条件下使所述多肽与α-酮异戊酸接触。在实施例中，所述多肽包含SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63的氨基酸序列。在实施例中，所述多肽包含来自格氏李斯特菌(Listeriagrayi)或解酪蛋白巨大球菌(Macrococcuscaseolyticus)的序列。在实施例中，所述多肽包含SEQIDNO：58或61的氨基酸序列。在实施例中，所述接触在小于约30mg/L、小于约20mg/L、或小于约10mg/L硫胺素的存在下发生。在实施例中，所述接触在重组宿主细胞内发生，并且其中所述多肽对于重组宿主细胞是异源性的。在实施例中，所述重组宿主细胞是下列属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或糖酵母属(Saccharomyces)。在实施例中，所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；以及(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸。在实施例中，所述宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变、和/或替换。在实施例中，所述重组宿主细胞包含fra2的缺失。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的甘油-3-磷酸脱氢酶活性。

本文还提供了生产异丁醇的方法，所述方法包括：(a)提供包含异丁醇生产途径的重组宿主细胞，所述生产途径包含多肽，其中所述多肽包含下列中的至少一种：(i)与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性；或(ii)α-酮异戊酸脱羧酶活性，大于1的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约20μM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及(b)在其中产生异丁醇的条件下使所述重组宿主细胞与碳底物接触。在实施例中，所述多肽包含SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63的氨基酸序列。在实施例中，所述多肽包含来自格氏李斯特菌或解酪蛋白巨大球菌的序列。在实施例中，所述多肽具有使用hmmsearch程序小于1E-223的KIVD簇序型HMME值。在实施例中，所述方法还包括分离异丁醇，并且在实施例中，分离包括液-液提取。在实施例中，用于液-液提取的提取剂包括C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物。在实施例中，所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母。在实施例中，本文提供的生产异丁醇的方法包括：(a)提供包含异丁醇生物合成的重组宿主细胞，所述异丁醇生物合成包含与SEQIDNO：52或61具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性的多肽；以及(b)在其中产生异丁醇的条件下使所述重组宿主细胞与碳底物接触。在实施例中，所述接触在小于约30g/L硫胺素的存在下发生。

在实施例中，本文提供的方法和重组宿主细胞包含与SEQIDNO：SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61、63、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、或416、或它们的活性片段具有至少约80％、85％、90％、95％、或98％同一性的多肽。

附图说明以及本文所附以电子方式提交的序列表和表格的并入

图1描绘了针对底物α-酮异戊酸和丙酮酸的特异性比率，例如KIVD多肽(从左至右：Mca、乳酸乳球菌(L.lactis)、KdcA、kivD81)。

图2展示了对于如实例中所述的重组宿主细胞在0mg/L、1mg/L和30mg/L硫胺素的存在下α-酮异戊酸和丙酮酸的收率。

图3显示了对于重组宿主细胞，如实例中所述在0、1mg/L、和30mg/L硫胺素的存在下α-酮异戊酸的浓度对发酵时间。

本文所附以电子方式提交并以引用方式全文并入本文的表Z是本文所述的KIVD簇序型HMM。表Z构成了本说明书的一部分。

本文所附提交的以引用方式并入本文的序列表(20120727_CL5253USNP_SEQ_ST25.txt；大小：1,304,771字节；创建日期：2012年7月26日)中提供的序列，符合37C.F.R.1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“RequirementsforPatentApplicationsContainingNucleotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRules”))，并且符合世界知识产权组织(WorldIntellectualPropertyOrganization)(WIPO)ST.25标准(2009)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(α-β)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。

具体实施方式

除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本申请(包括其定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。

为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而能够包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。

如本文所用，术语“由...组成”、或变型如“由...构成”或“包括”，如本说明书和权利要求通篇所使用的，表示任何所列举的整数或整数的组的涵盖，但是没有附加的整数或整数的组可被添加至所指定的方法、结构、或组合物。

如本文所用，术语“基本上由...组成”、或变型如“基本上由...构成”或“基本上包括”，如本说明书和权利要求通篇所使用的，表示任何所列举的整数或整数的组的涵盖，以及不从实质上改变所指定的方法、结构、或组合物的基本的或新的性能的任何所列举的整数或整数的组的任选的涵盖。参见M.P.EP.§2111.03。

此外，涉及元素或组分实例(即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在为非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施例。

如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，优选在报告数值的5％范围内。

术语“异丁醇生物合成途径”是指生产异丁醇的酶途径。有时“异丁醇生物合成途径”与“异丁醇生产途径”同义地被使用。

术语“碳底物”或“可发酵碳底物”是指能够被本文所公开的重组宿主细胞代谢的碳源。本文提供了碳底物的非限制性例子，其包括但不限于单糖、寡糖、多糖、乙醇酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、一碳底物或它们的混合物。

如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵生产的异丁醇的总量。异丁醇的总量包括：(i)发酵培养基中的异丁醇量；(ii)从发酵液体培养基回收的异丁醇的量，例如，通过与有机提取剂接触；和(iii)如果使用了气提，从气相回收的异丁醇的量。

如本文所用，术语“有效速率”是指每小时的发酵每升发酵培养基通过发酵生产的异丁醇的总量。

如本文所用，术语“有效收率”是指由生物催化剂消耗的每单位可发酵碳底物生产的异丁醇的量。

术语“乙酰乳酸合酶”是指催化丙酮酸至乙酰乳酸和CO₂的转化的酶。乙酰乳酸具有两种立体异构体((R)和(S))；该酶偏好由生物系统产生的(S)-异构体。乙酰乳酸合酶可被分类为EC编号2.2.1.6(EnzymeNomenclature1992，AcademicPress，SanDiego)。

术语“酮醇酸还原异构酶”(缩写为“KARI”)、和“乙酰羟酸异构还原酶”将被可互换地使用，并且是指能够催化(S)-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的反应的酶。KARI酶可被分类为EC编号EC1.1.1.86(EnzymeNomenclature1992，AcademicPress，SanDiego)。

术语“乙酰羟酸脱水酶”和“二羟酸脱水酶”(DHAD)是指催化2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化的酶。乙酰羟酸脱水酶可被分类为EC编号4.2.1.9，并可得自很多种微生物。

术语“支链α-酮酸脱羧酶”或“α-酮酸脱羧酶”或“α-酮异戊酸脱羧酶”或“2-酮异戊酸脱羧酶”(本文也称为酮异戊酸脱羧酶，或者有时称为KIVD)是指催化α-酮异戊酸(“α-Kiv”)至异丁醛和CO₂的转化的酶。酮异戊酸脱羧酶序列可得自许多微生物来源，包括本文所公开的那些。

术语“支链醇脱氢酶”是指催化异丁醛至异丁醇的转化的酶。支链醇脱氢酶可被分类为EC编号1.1.1.265，但也可被分类在其他醇脱氢酶(具体地，EC1.1.1.1或1.1.1.2)之下。

术语“KIVD簇序型HMM”是指如本文所公开地准备的序型隐蔽马尔科夫模型。所述KIVD簇序型HMM被提供为表Z。

术语“分离的核酸分子”、“分离的核酸片段”和“遗传构建体”将可互换地使用，并将指单链或双链RNA或DNA的聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体的氨基酸：

表1：氨基酸

术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5′非编码序列)和编码序列后的调节序列(3′非编码序列)。“天然基因”指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。“嵌合基因”指为非天然基因的任何基因，包含天然状态下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指在微生物基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来基因”是指正常情况下不存在于宿主微生物中的基因，它通过基因转移导入宿主微生物内。例如，外来基因能够包括插入至非天然的微生物中的天然基因、或嵌合基因。外来基因还能够包括，例如，具有改变了所编码的多肽的氨基酸残基的突变的天然基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所用，术语“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

术语“内源性的”当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指在生物体基因组中处于其天然位置的天然多核苷酸或基因，或者对于天然多肽，从基因组中的该位置被转录和翻译。

术语“异源性的”当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指通常不存在于宿主生物中的多核苷酸、基因、或多肽。“异源性的”还包括以不同于对应的天然基因的形式(例如，不处于其在该生物基因组中的天然位置)被重新引入来源生物的天然编码区或其部分。异源性多核苷酸或基因可通过，例如，基因转移被引入宿主生物。异源性基因可包括具有被重新引入天然宿主的非天然调控区域的天然编码区。“转基因”是已通过转化方法被引入基因组内的基因。

术语“重组基因表达元件”是指表达一种或多种特异性蛋白质的核酸片段，包括在针对所述蛋白质的编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′终止序列)的调控序列。嵌合基因是重组基因表达元件。操纵子的编码区可以与可操作地连接的启动子和终止区一起来自重组基因表达元件。

“调控序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、操作子、抑制子、转录终止信号、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个来源于天然基因、或者可由来源于天然存在的不同启动子的不同元件组成、或者甚至包含合成的核酸片段。本领域的技术人员知道，不同的启动子可指导基因在不同的组织或细胞类型中、在不同的发育阶段、或响应于不同的环境或生理条件的表达。导致基因在大多数细胞类型中在大多数时候表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。在另一方面，“诱导型启动子”导致基因在该启动子被诱导或被启动子特异性的信号或分子开启时被表达。此外还认识到，由于大多数情况下调控序列的确切界限还未被彻底地界定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。例如，应当理解，“FBA1启动子”能够被用于指来源于FBA1基因的启动子区域的片段。

如本文所用，术语“终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括聚腺苷酸化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。聚腺苷酸化信号的特征通常在于影响多腺苷酸片段向mRNA前体的3’端的添加。所述3’区能够影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。已经认识到，由于大多数情况下调控序列的确切界限还未被彻底地界定，不同长度的DNA片段可具有相同的终止子活性。例如，应当理解，“CYC1终止子”能够被用于指来源于CYC1基因的终止子区域的片段。

术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

如本文所用，术语“表达”指源于本发明的核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

如本文所用，术语“转化”是指将核酸片段转移至宿主微生物的基因组内，导致基因稳定遗传。包含转化的核酸片段的宿主微生物被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”微生物。

术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带不是细胞的中央代谢的部分的基因、并且通常处于环状双链DNA片段形式的染色体外元件。此类元件可以是线性或环状的、单链或双链DNA或RNA的、来源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，在其中许多核苷酸序列已被接合或组合为能够将针对所选择的基因产物的启动子片段和DNA序列与适当的3′非翻译序列一起引入细胞中的独特构造。“转化盒”是指包含外来基因，并且在该外来基因之外还具有有利于特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。“表达盒”是指包含外来基因，并且在该外来基因之外还具有允许或增强该基因在外来宿主中的表达的元件的特定载体。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，就DNA而言，腺嘌呤是与胸腺嘧啶互补的而胞嘧啶是与鸟嘌呤互补的，而就RNA而言，腺嘌呤是与尿嘧啶互补的，而胞嘧啶是与鸟嘌呤互补的。

包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而组成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸(其余三种密码子编码结束翻译的信号)。本文将显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”重制为表2。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。

表2：标准遗传密码

对于使用特定密码子来编码特定氨基酸向延伸中的肽链中的插入，许多生物表现出偏倚性。密码子偏好、或密码子偏倚性、生物体间密码子使用的差异是遗传密码子的简并性造成的，在很多生物体中有很详细的记录。密码子偏倚性常与信使RNA(mRNA)的翻译效率有关，这继而据信取决于特别是被翻译的密码子的特性和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。选定的tRNA在细胞中的优势一般而言反映了在肽的合成中最经常使用的密码子。因此，能够基于密码子优化对基因进行加工，以使基因在给定生物中的表达最优化。

如它是指用于转化各种宿主的基因或编码区的核酸分子，术语“密码子优化的”是指在基因或编码区的核酸分子中的密码子改变，反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一个、或多于一个、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。

考虑到对于多种多样的动物、植物和微生物物种存在大量的基因序列，计算密码子使用的相对频率是可能的。密码子使用表是本领域中易得的，例如在http：//www.kazusa.or.jp/codon/(2008年3月20日访问)提供的“密码子使用数据库”，并且这些表格可以在许多方面进行调整。参见Nakamura，Y.等人，Nucl.AcidsRes.28：292(2000)。从GenBankRelease128.0[2002年2月15日]计算的酵母的密码子使用表被重制为下文的表3。该表使用mRNA命名，因此，该表使用存在于RNA中的尿嘧啶(U)，而不是存在于DNA中的胸腺嘧啶(T)。表1B经过了调整，因此计算了每个氨基酸的频率，而非全部64个密码子。

表3：啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的密码子使用表

通过利用该表或类似的表，本领域的普通技术人员能够将这些频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码所述多肽的编码区的核酸片段，但其使用针对给定的物种优化的密码子。

以优化的频率随机分配密码子来编码给定的多肽序列，能够通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后随机地为给多肽序列分配密码子而人工地实现。此外，多种算法和计算机软件程序是本领域的普通技术人员容易获得的。例如，可得自DNAstar，Inc.，Madison，WI的Lasergene软件包中的“EditSeq”功能，可得自InforMax，Inc.，Bethesda，MD的VectorNTI套件中的backtranslation功能，和可得自Accelrys，Inc.，SanDiego，CA的GCG-Wisconsin软件包中的“backtranslate”功能。构建基本的算法来基于给定的频率分配密码子也能够由本领域的普通技术人员用基本的数学函数实现。密码子优化的编码区也可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计，包括软件包如“syntheticgenedesigner”(userpages.umbc.edu/～wugl/codon/sgd/，于2012年3月19日访问)。

如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于替换或与这些术语中任一项互换使用。多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。

以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。在宿主细胞中重组产生的多种多肽和蛋白质考虑以所述发明目的进行分离，即为原生的或重组的多肽，其已通过任何适宜的技术分离、分馏、或部分或大幅纯化。

氨基酸或核苷酸序列的基本部分指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool；Altschul，S.F.，等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(例如，Southern杂交)和分离(例如，细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定蛋白质的完整氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的基本部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括如所附的序列表中报道的完整序列，以及如上文所定义的这些序列的基本部分。

术语“百分比同一性”如本领域已知是指通过比较多个序列测定的、两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。本领域中“同一性”也意为多肽或多核苷酸序列之间的序列关联度，视情况而定，如由此类序列字符串的匹配来测定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于下列文献中所描述的那些：1.)ComputationalMolecularBiology(Lesk，A.M.，编辑)OxfordUniversity：NY(1988)；2.)Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects(Smith，D.W.，编辑)Academic：NY(1993)；3.)ComputerAnalysisofSequenceData，部分I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑)Humania：NJ(1994)；4.)SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje，G.编辑)Academic(1987)；以及5.)SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。

设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENEbioinformaticscomputingsuite(DNASTARInc.，Madison，WI))中的MegAlign^TM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为ClustalV的比对方法的“ClustalV比对方法”(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.)中的MegAlign^TM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAPPENALTY＝10、以及GAPLENGTHPENALTY＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAPPENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALSSAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、GAPPENALTY＝5、WINDOW＝4、以及DIAGONALSSAVED＝4。在使用ClustalV程序进行序列比对后，通过查看同一程序中的“序列距离”表有可能获得“百分比同一性”。另外所述“ClustalW比对方法”是可用的并对应于标记为ClustalW的比对方法(描述见Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992))中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.)中的MegAlign^TMv6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(GAPPENALTY＝10、GAPLENGTHPENALTY＝0.2、DelayDivergenSeqs(％)＝30、DNATransitionWeight＝0.5、ProteinWeightMatrix＝Gonnet系列、DNAWeightMatrix＝IUB)。在使用ClustalW程序进行序列比对后，通过查看在同一程序中的“序列距离”表有可能获得“百分比同一性”。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于鉴定多肽，例如从其它物种，其中此类多肽具有相同或相似的功能或活性，或者可用于描述对应的多核苷酸。有用的一致性百分比例子包括但不限于：55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或55％至100％的任何正数百分比在描述本发明时可以是有用的，如55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。适合的多核苷酸片段不仅具有上述同源性，而且通常包含具有至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、或至少250个核苷酸的多核苷酸。此外，具有上述同源性的适合的多核苷酸片段编码具有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸的多肽。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序套件(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(GeneCodesCorporation，AnnArbor，MI)；以及5.)所述FASTA程序结合了Smith-Waterman算法(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994)，MeetingDate1992，111-20。编辑：Suhai，Sandor，Plenum：NewYork，NY)。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域中为人们所熟知的，并且描述于下列文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratotyPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)(下文“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，由GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版(1987)。本文所用的附加的方法参见MethodsinEnzymology，第194卷，GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiology(部分A，2004，ChristineGuthrie和GeraldR.Fink(编辑)，ElsevierAcademicPress，SanDiego，CA)。其他分子工具和技术是本领域中已知的，并且包括通过重叠延伸聚合酶链反应(PCR)进行的拼接(Yu，等人(2004)FungalGenet.Biol.41：973-981)、针对位于啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)URA3基因座的突变的正向选择(Boeke，J.D.等人(1984)Mol.Gen.Genet.197，345-346；MARomanos等人NucleicAcidsRes.1991年1月11日；19(1)：187)、cre-lox位点特异性重组系统以及突变型lox位点和FLP底物突变(Sauer，B.(1987)MolCellBiol7：2087-2096；Senecoff等人(1988)JournalofMolecularBiology，第201卷，第2期，第405-421页；Albert等人(1995)ThePlantJournal。第7卷，第4期，第649-659页)、“无缝”基因缺失(Akada，等人(2006)Yeast；23(5)：399-405)、和缺口修复技术(Ma等人，Genetics58：201-216；1981)。

如本文所公开的，申请人已发现了此前未被注释为α-酮异戊酸脱羧酶多肽的多肽，所述多肽能够催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物转化。编码推定的脱羧酶的多核苷酸被合成、在大肠杆菌(E.coli)中表达、并针对α-酮异戊酸脱羧酶活性被测试。如例子中所显示的，某些多肽被用于包含异丁醇生物合成途径的重组宿主细胞中。

KIVD多肽

通过对NCBI非冗余(nr)蛋白质数据库的美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，visitedJuly27，2012)BLAST检索，鉴定了酮异戊酸脱羧酶(KIVD)蛋白质家族的成员，检索使用乳酸乳球菌(L.lactis)KivD(α-酮异戊酸脱羧酶)(SEQIDNO：68)、乳酸乳球菌(L.lactis)KDCA(支链酮酸脱羧酶)(SEQIDNO：66)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)IPDC(吲哚-丙酮酸脱羧酶)(SEQIDNO：257)用下列检索参数进行：E值＝10，字长＝3，矩阵＝Blosum62，并且空位开放＝11，空位延伸＝1，E值截止值为10^-3。合并了三组blast结果，并去除了相同的或长度大于712或小于583的那些。然后利用程序CD-Hit(2007年1月下载；可得自weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/，2012年7月25日访问)，将上述合并的序列组减少为其中序列之间最高的同一性是65％的组(“nr65set”)。得到了1184个KIVD序列的组。

采用全部的默认参数，用ClustalW比对了这1184个序列。然后，使用ClustalW，用邻接(neighbor-joining)程序从多重序列比对构建了系统发育树。使用程序iTOL(itol.embl.de/，2012年7月27日访问)使上述系统发育树可视化。选择了180个序列的子树，其跨越了乳酸乳球菌(L.Lactis)KivD、阴沟肠球菌(E.cloacae)IPDC、啤酒糖酵母(S.cerevisiae)PDC(丙酮酸脱羧酶)和发酵单孢菌属(Zymomonas)PDC以及它们的密切同源物。然后，将上述子树扩展为包括这180个序列的nr65组中的全部簇成员。最终的组包括601个序列，并被用于构建如下文所述的序列相似性网络。

序列相似性网络由对应于比规定的阈值更好的成对关系的边界的集合组成(AtkinsonHJ等人PLoSOne.2009，4：e4345)。就这里的分析而言，成对关系对应于与E值相关联的BLAST比对。601个序列的组被用于使用‘formatdb’(NCBI；www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/docs/formatdb.html；2012年7月26日访问)构建自定义BLAST数据库。然后，使用BLAST针对该数据库检索了上述组中的每一序列。由于BLASTE值不是对称的，保留了最佳的E值并与每一成对比较相关联。

比E-130的E值阈值更佳的全部成对比对被载入至程序Cytoscape(www.cytoscape.org；2012年7月27日访问)，并使用Organic布局算法生成了图。在可视化时，这601个序列形成了可分辨的簇。包含170个序列的一个簇被鉴定为包含乳酸乳球菌(L.lactis)KivD、乳酸乳球菌(L.lactis)KDCA、和阴沟肠球菌(E.cloacae)IPDC。由于乳酸乳球菌(L.lactis)KivD和乳酸乳球菌(L.lactis)KDCA是已知的α-酮异戊酸脱羧酶，来自该簇的多个候选序列被选择用于多样性选择。来自该簇的某些序列如本文所示以实验方式被验证为具有α-酮异戊酸脱羧酶活性(参见实例3和5)。

由于该簇被证实包含具有α-酮异戊酸脱羧酶活性的多肽，从上文所述的170个序列的组生成了针对该KIVD簇的序型HMM并提供于表4中。表4中提供了该簇序列与以实验方式被验证为具有α-酮异戊酸脱羧酶活性的序列的％同一性，如从通过ClustalW的多重序列比对所确定的。本领域的技术人员将会知道，表4中提供的多肽是用于本文提供的实施例的候选多肽，并且能够容易地制备并针对α-酮酸脱羧酶活性测试所述多肽。因此，表4中提供的来源生物可以是适用于本文提供的实施例的多肽的来源生物。因此，本文提供了将α-酮异戊酸转化成异丁醛的方法，所述方法包括提供包含SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61、63、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、或416的多肽(或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或98％同一性的多肽或它们的活性片段)，以及在其中产生异丁醛的条件下使所述多肽与α-酮异戊酸接触。在一些实施例中，所述接触在重组宿主细胞内发生。在一些实施例中，所述宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，重组宿主细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸编码表4的多肽、或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性的多肽、或它们的活性片段。本文提供了生产异丁醇的方法，所述方法包括提供包含多肽的重组宿主细胞，所述多肽包含SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61、63、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、或416(或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或98％同一性的多肽或它们的活性片段)，以及在其中产生异丁醛的条件下使所述多肽与α-酮异戊酸接触。

序型HMM的准备

使用HMMER软件包分析了上文所描述并提供于表Z中的170个序列的氨基酸序列(序型HMM背后的理论描述于R.Durbin，S.Eddy，A.Krogh和G.Mitchison，Biological sequenceanalysis：probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids，CambridgeUniversityPress，1998；Krogh等人，1994；J.Mol.Biol.235：1501-1531中)，分析按照可得自HMMER(JaneliaFarmResearchCampus，Ashburn，VA)的用户指南进行。HMMER软件程序的输出是表征输入序列的序型隐蔽马尔科夫模型(序型HMM)。如上述用户指南中所述，序型HMM是多重序列比对的一致性的统计描述。它们使用对氨基酸(或核苷酸)的位置特异性评分和对插入或缺失的开放或延伸的位置特异性评分。与其他基于序型的方法相比，HMM具有正式的概率基础。大量蛋白质家族的序型HMM是可从PFAM数据库(JaneliaFarmResearchCampus，Ashburn，VA)公开获得的。

序型HMM的构建如下：

步骤1构建序列比对

使用ClustalW(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和GibsonT.J.(1994)Nuc.AcidRes.22：46734680)以默认参数比对了如上文所述的簇中的170个序列。

步骤2构建序型HMM

使用默认参数对比对的序列的组运行了hmmbuild程序。hmmbuild读取多重序列比对文件、构建新的序型HMM、并将序型HMM保存为文件。使用该程序，从如步骤1中所述的170个序列的多重序列比对生成了未校准的序型。

基于HMMER软件用户指南的下列信息给出了对hmmbuild程序准备序型HMM的方式的一些描述。序型HMM是由一系列节点组成的线性状态机，每一节点大致对应于该序型HMM从其中被构建的多重序列比对中的位点(列)。如果缺口被忽略，则对应性是确切的，即，该序型HMM具有针对比对中的每一列的节点，而每一节点能够以一种状态——匹配状态——存在。术语“匹配”在这里表示在该模型中有针对被比对至该模型中的序列中的每一位点的位点。使用插入(I)和缺失(D)状态对缺口建模。包含超过缺口特征的一定部分x的全部列将被指定为插入列。默认将x设置为0.5。每一匹配状态具有与其相关联的I和D状态。HMMER将在比对中的相同的一致性位点的三种状态(M/D/I)的组称为“节点”。

序型HMM具有与其相关联的多种类型的概率。一种类型是转移概率——从一种状态转移至另一种的概率。还有与每一匹配状态相关联的发射概率，其基于给定残基在比对中的该位点存在的概率。例如，对于一个比对中一个相当保守的列，就最常见的氨基酸而言的发射概率可以是0.81，而对于其他19种氨基酸中的每一种，它可以是0.01。

在HMMER2序型保存文件中对序型HMM有完整的描述，其包含了被用于参数化HMM的全部概率。匹配状态或插入状态的发射概率被存储为相对于零模型的对数-比值比：log₂(p_x)/(null_x)。其中p_x是根据该序型HMM，一种氨基酸残基在该比对中的特定位点的概率，而null_x是根据零模型的概率。零模型是简单的一种状态概率模型，其具有来源于SWISSPROT发布24中氨基酸分布的针对20种氨基酸中每一种的发射概率的预先计算的组。状态转移评分也被存储为对数比值参数，并且与log₂(t_x)成比例。其中t_x是从一种状态转移至另一种状态的转移概率。

步骤3校准序型HMM

使用hmmcalibrate读取了序型HMM，其用该序型对大量的合成的随机序列进行评分(所使用的合成序列的默认数量为5,000)，将极值分布(EVD)拟合至这些评分的直方图，并重新保存已包括了EVD参数的HMM文件。当对蛋白质序列数据库检索该序型时，这些EVD参数(μ和λ)被用于计算比特分数的E值。hmmcalibrate在标记为“EVD”的行向HMM文件中写入两个参数。这些参数是极值分布(EVD)的μ(位置)和λ(范围)参数，所述极值分布最佳地拟合了在与SWISS-PROT大约相同的长度和残基组成的随机生成的序列上计算的分数的直方图。对序型HMM进行上述校准一次。

针对KIVD序列的组的经校准的序型HMM提供于表Z中，并且在本文中被称为KIVD簇序型HMM。在从HMM标志行开始的主模型部分，对于M节点(其中M是匹配状态的数量，如由LENG行给出的)，所述模型每节点具有三行。第一行报道匹配发射对数-比值评分：从该状态和从零模型发射每一氨基酸的对数-比值比。第一个数字是节点数(1..M)。第二个是用于匹配发射评分的K数，每一氨基酸一个。最高评分的氨基酸在节点数之后在括号中表示。这些对数-比值分数能够使用零模型概率被转化回HMM概率。该行的最后一个数表示针对该匹配状态的比对列索引。第二行报道插入发射评分，而第三行报道状态转移评分：M→M、M→I、M→D；I→M、I→I；D→M、D→D；B→M；M→E。

步骤4测试所构建的序型HMM的特异性和敏感度

使用hmmsearch评估了序型HMM，其从hmmfile读取序型HMM并针对显著地相似的序列匹配检索序列文件。所检索的序列文件包括601个序列(参见上文)。在检索中，数据库的大小(Z参数)被设置为10亿。这样的大小设置确保了对于现在的数据库显著的E值在可预见的将来将依然是显著的。E值截止值被设置为10。

用从上述170个KIVD同源物的比对产生的KIVD簇序型HMM(表Z，以引用方式并入本文)进行的hmmer检索，以E值＜1E-223匹配了全部601个序列。该结果表明，上述KIVD簇的成员共有显著的序列相似性。以E-223的E值截止值进行的hmmer检索被用于区分KIVD与其他蛋白质。因此，据信使用hmmer检索具有KIVD簇序型HMME值＜1E-223的多肽是就本文提供的实施例而言适合的候选，例如用于包括α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化的方法和重组宿主细胞。

应当理解，利用本公开并使用本领域中可用的结构和序列信息的组合，包含酮异戊酸脱羧酶活性和与表4、5和6中的示例性序列小于100％同一性的多肽可被构建用于本文提供的宿主细胞和方法中。例如，由于申请人已证明了本文提供的多肽具有酮异戊酸脱羧酶活性，本领域的技术人员可通过序列信息和序型HMM以及本领域中可用的关于酮异戊酸脱羧酶的信息利用本文提供的生物化学、分子、和结构信息。例如，Berthold等人提供了来自乳酸乳球菌(L.lactis)的holo-KdcA的结构(ActaCrys.(2007)D63：1217-1224)；Yep等人(BioorganicChemistry，34(2006)325-336)开发了针对来自乳酸乳球菌(L.lactis)的KdcA的结构的同源性模型，将残基Ser286、Phe381、Va1461、和Met358鉴定为似乎塑造了底物结合篮的残基；Smit等人(Appl.Environ.Microbiol.(2005)71：303-311)比对了KdcA和两种脱羧基酶(阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)的吲哚丙酮酸脱羧酶和酵母丙酮酸脱羧酶，它们已经过X射线晶体学研究)的氨基酸序列。

利用本公开，本领域的普通技术人员还能够生成本文提供的多肽的活性片段，例如，通过基于在N-末端和C-末端的序列比对截短本文提供的多肽并确认α-酮异戊酸脱羧酶活性。

因此，本文所公开的多肽(所述多肽能够催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物转化)包括但不限于与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63中的任何一种或它们的活性片段包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性的多肽。在实施例中，所述多肽具有使用hmmsearch程序小于1E-223的KIVD簇序型HMME值。类似地，申请人在本文中提供了编码此类多肽的多核苷酸，其包括但不限于与SEQIDNO：30、31、32、34、35、37、38、40、或42中的任何一种或它们针对在特定宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)或啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中的表达经密码子优化的序列包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性的多核苷酸。

二磷酸硫胺素(也被称为焦磷酸硫胺素或“TPP”或“TDP”)是作为辅因子被KIVD利用的辅酶。硫胺素是其维生素形式，其可被补充至反应介质如发酵液体培养基中。一旦被转运进细胞，硫胺素将被转化成二磷酸硫胺素。此外，与具有SEQIDNO：68的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)多肽相比，本文所公开的某些具有酮异戊酸脱羧酶活性的多肽具有提高的对TPP的亲和力，并且，如此可提供优点。例如，本文提供的多肽可被用于在低的或减少的硫胺素的条件下催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化，潜在地降低了成本和规程复杂度。在实施例中，此类多肽与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63中的任何一种或它们的活性片段包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性。在一些实施例中，此类多肽包含分别来自格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、解酪蛋白巨大球菌(Macrococcuscaseolyticus)、或乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的kivD81、Mca、或kdcA、或它们的活性片段的序列。在一些实施例中，此类多肽包含与SEQIDNO：52、61、或66或它们的活性片段至少约80％同一性。在一些实施例中，此类多肽包含与SEQIDNO：52或61或它们的活性片段至少约80％同一性。

本文提供的多肽和编码它们的多核苷酸对于在重组宿主细胞中的表达也是有用的，例如包含包括了α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物转化的异丁醇生物合成途径的重组宿主细胞。此外，申请人已显示，本文提供多肽至少与具有SEQIDNO：68的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)多肽序列一样地能够在重组宿主细胞中将α-酮异戊酸转化成异丁醛，如通过在发酵过程中α-酮异戊酸的积聚所测量的(参见实例12)。类似地，与利用具有SEQIDNO：68的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)多肽序列的细胞中观察到的异丁醇收率相比，本文提供的多肽能够在重组宿主细胞中提供提高的异丁醇收率(参见实例12)。因此，本文提供了包含与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61、或63中的任何一种或它们的活性片段包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同一性的多肽、或编码此类多肽的多核苷酸的重组宿主细胞。

重组宿主细胞的构建

对本文所述的宿主细胞的遗传操纵能够利用标准遗传技术和筛选进行，并且能够在任何适合遗传操纵的宿主细胞中完成(MethodsinYeastGenetics，2005，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，第201-202页)。在实施例中，本文所公开的重组宿主细胞能够是可用于遗传修饰和重组基因表达的任何细菌、酵母或真菌宿主。在其他实施例中，重组宿主细胞能够是下列的属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或糖酵母属(Saccharomyces)。在其他实施例中，所述宿主细胞能够是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、树干毕赤酵母(Pichiasttpttts)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、大肠杆菌(E.coli)、或植物乳杆菌(L.plantarum)。在另外的实施例中，所述宿主细胞是酵母宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是糖酵母属(Saccharomyces)的成员。在一些实施例中，所述宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。在一些实施例中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)酵母为本领域所已知并可购自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)、CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)真菌生物多样性中心、LeSaffre、GertStrandAB、FermSolutions、NorthAmericanBioproducts、Martrex和Lallemand。啤酒糖酵母(S.cerevisiae)包括但不限于BY4741、CEN.PK113-7D、Ethanol酵母、FermPro^TM酵母、酵母、GertStrandPrestigeBatchTurboalcohol酵母、GertStrandPotDistillers酵母、GertStrandDistillersTurbo酵母、FerMax^TMGreen酵母、FerMax^TMGold酵母、酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。

用于在包括但不限于酵母细胞的重组宿主细胞中表达基因的方法是本领域已知的(参见，例如，MethodsinEnzymology，Volume194，GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiology(部分A，2004，ChristineGuthrieandGeraldR.Fink(编辑)，ElsevierAcademicPress，SanDiego，CA)。在实施例中，将被表达的α-酮异戊酸脱羧酶的编码区能够针对靶宿主细胞经过密码子优化，如本领域的技术人员所熟知的。基因在包括但不限于酵母细胞的重组宿主细胞中的表达能够需要可操作地连接至所关注的编码区的启动子、和转录终止子。能够被用于构建基因的表达盒的多种启动子包括但不限于下列适合在酵母中使用的组成型启动子：FBA1、TDH3(GPD)、ADH1、和GPM1；和下列适合在酵母中使用的诱导型启动子：GAL1、GAL10和CUP1。其他酵母启动子包括杂合启动子UAS(PGK1)-FBA1p(SEQIDNO：228)、UAS(PGK1)-ENO2p(SEQIDNO：229)、UAS(FBA1)-PDC1p(SEQIDNO：230)、UAS(PGK1)-PDC1p(SEQIDNO：231)、和UAS(PGK)-OLE1p(SEQIDNO：232)。能够被在用于表达的嵌合基因构建体中使用的适合的转录终止子包括但不限于FBA1t、TDH3t、GPM1t、ERG10t、GAL1t、CYC1t、和ADH1t。

对于多种宿主细胞的转化有用的载体是常规的并被描述于文献中。通常，载体包含选择性标记和在所期望的宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。此外，适合的载体能够包含负责转录起始控制的启动子区域和转录终止控制区域，在它们之间是可被插入以提供所插入的编码区的表达的编码区DNA片段。两种控制区域能够都来源于对所转化的宿主细胞而言同源的基因，尽管应当理解，此类控制区域还能够来源于对被选择作为生产宿主的具体物种而言非天然的基因。

在实施例中，适合的启动子、转录终止子、和α-酮异戊酸脱羧酶编码区能够被克隆进大肠杆菌(E.coli)-酵母穿梭载体，并被转入酵母细胞。此类载体允许在大肠杆菌(E.coli)和酵母菌株中的菌株繁殖，并且能够包含选择性标记和在所期望的宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。通常在酵母中使用的质粒包括但不限于穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425、和pRS426(美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，Rockville，MD)，其包含大肠杆菌(E.coli)复制起点(例如，pMB1)、酵母2μ复制起点、和用于营养选择的标记。用于这四种载体的选择性标记是HIS3(载体pRS423)、TRP1(载体pRS424)、LEU2(载体pRS425)和URA3(载体pRS426)。

在实施例中，具有编码所描述的酶的嵌合基因的表达载体的构建能够通过酵母中的缺口修复重组方法进行。在实施例中，酵母载体DNA被消化(例如，在其多克隆位点中)以在其序列中产生“缺口”。构建了所关注的多种插入DNA，它们在5′和3′端包含循序地彼此重叠和与载体DNA的5′和3′端重叠的大约21bp的序列。例如，为了构建用于“基因X”的酵母表达载体，选择了酵母启动子和酵母终止子用于表达盒。从酵母基因组DNA扩增了上述启动子和终止子，从基因X的来源生物PCR扩增了基因X或从包含基因X序列的克隆载体获得了基因X。在线性化载体的5′端和启动子序列之间、启动子和基因X之间、基因X和终止子序列之间、以及终止子和线性化载体的3′端之间，有至少21bp的重叠序列。然后，带“缺口”的载体和插入DNA被共转化入酵母菌株，并在包含适当化合物混合物的培养基上铺板，所述混合物允许质粒上营养选择标记的互补作用。正确的插入组合的存在能够使用从经选择的细胞制备的质粒DNA通过PCR作图确认。然后，从酵母分离的质粒DNA(通常浓度较低)能够被转入大肠杆菌(E.coli)菌株，例如，TOP10，然后是小量质粒抽提和限制性作图，以进一步验证质粒构建体。最后，能够通过序列分析验证构建体。

与缺口修复技术一样，向酵母基因组中的整合同样利用了酵母中的同源重组系统。在实施例中，用高保真DNA聚合酶PCR扩增了包含编码区加上控制元件(启动子和终止子)和营养缺陷型标记的盒，扩增使用与所述盒杂交并包含与期望插入在其处发生的基因组区域的5′和3′区同源的40-70个碱基对序列的引物进行。然后，PCR产物被转入酵母，并在包含适当化合物混合物的培养基上铺板，所述混合物允许对整合的营养缺陷型标记的选择。例如，为了将“基因X”整合进染色体位置“Y”，从质粒DNA构建体PCR扩增了启动子-编码区X-终止子构建体，并通过重叠延伸PCR(SOEPCR)或常规的限制性酶切和克隆与营养缺陷型标记(例如URA3)连接。使用包含与酵母染色体上位置“Y”的5′和3′区同源的40-70bp的引物序列，PCR扩增了包含启动子-编码区X-终止子-URA3区域的完整的盒。PCR产物被转入酵母，并在缺少尿嘧啶的生长培养基上进行选择。通过菌落PCR或通过对染色体DNA的直接测序能够验证转化子。

KIVD活性

α-酮异戊酸脱羧酶活性在本文所公开的重组宿主细胞中的存在能够使用本领域已知的常规方法确认。在非限制性的例子中，并且如本文的实例中所述，使用针对α-酮异戊酸脱羧酶基因的引物，能够通过PCR筛选转化子。在另一个非限制性的例子中，并且如本文的例子中所述，通过在本文所公开的缺少内源性α-酮异戊酸脱羧酶活性的重组宿主细胞中表达本文所公开的α-酮异戊酸脱羧酶，能够测定α-酮异戊酸脱羧酶活性。在另一个非限制性例子中，通过更加间接的方法，例如通过测量生物合成途径中异丁醛下游的产物，能够确认α-酮异戊酸脱羧酶活性。在另一个非限制性例子中，通过测量辅因子的消失，或通过测量生物合成途径中异丁醛下游步骤的辅因子的消失，例如，如本文所述的和/或本领域中的(参见，例如，Zhang等人，PNAS(2008)105(52)：20653-20658)偶联测定，能够确认α-酮异戊酸脱羧酶活性。在另一个非限制性例子中，通过用本文所述的醛特异性的比色法酶测定确定α-酮异戊酸至异丁醛的转化速率，能够确认α-酮异戊酸脱羧酶活性。在另一个非限制性例子中，通过使用本领域已知的方法(参见，例如，delaPlaza等人，FEMSMicrobiolLetters(2004)238：367-374)测量α-酮异戊酸的消失，能够确认α-酮异戊酸脱羧酶活性。

TPP辅因子活化常数(其提供了对TPP的酶亲和力的测量)描述于Chang等人(Biochem.J.(1999)339：255-260)中。本文提供的多肽的TPP辅因子活化常数能够通过以所观察到的比活性作为TPP浓度的函数作图确定。α-酮异戊酸至异丁醛的转化的速率可在马肝脏ADH(hADH)偶联的酶测定中被测量，所述测定描述于Gocke，D.等人(Adv.Synth.Catal.2007，349，1425-1435)，并在不同的TPP浓度下进行。然后，将比活性对TPP浓度作图。然后，所得到的曲线能够被拟合至饱和度公式SA＝(SA_max*[TPP])/(K_c+[TPP])+C，其中SA是比活性，SA_max是最大比活性，K_c是辅因子活化常数，[TPP]是TPP的浓度，而C是在没有添加TPP情况下的活性，使用诸如Kaleidagraph(Synergy)的软件来确定辅因子活化常数(K_c)。多肽的TPP亲和力还能够通过荧光淬灭被测定，如Chang等人(Biochem.J.(1999)339：255-260)所述。

在实施例中，本文提供的多肽具有小于约5μM、小于约10μM、小于约20μM、小于约30μM、小于约40μM、小于约50μM、小于约70μM、或小于约90μM的TPP辅因子活化常数(K_c)。

底物特异性比率提供了对酶区别竞争性底物的反应的能力的量度，其被描述于Fersht，A.(EnzymeStructureandMechanism，1977，1985W.H.FreemanandCompany，NewYork)中。通过测量α-酮异戊酸至异丁醛的转化的V_max和K_M值和丙酮酸至乙醛的转化的V_max和K_M值，能够确定给定多肽的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率。α-酮异戊酸至异丁醛和丙酮酸至乙醛的转化的速率可在马肝脏ADH(hADH)偶联的酶测定中被测量，所述测定描述于Gocke，D.等人(Adv.Synth.Catal.2007，349，1425-1435)，并以不同的底物浓度进行。然后，将比活性对底物浓度作图。然后，使用诸如Kaleidagraph(Synergy)的软件，将所得到的曲线拟合至米氏方程(Michaelis-Menton)，以确定就每一底物而言的V_max和K_M值。如本文所用，“特异性比率”是针对α-酮异戊酸测定的V_max/K_M除以针对丙酮酸测定的V_max/K_M的系数。

在实施例中，本文所公开的多肽的特异性比率大于约1、大于约10、大于约20、大于约50、大于约100、大于约150、大于约200、大于约250、或大于约300。

本文提供了利用本发明所公开的多肽将α-酮异戊酸转化成异丁醛的方法。在实施例中，所述方法包括：(a)提供多肽，其中所述多肽包含下列中的至少一种：(i)与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性和α-酮酸脱羧酶活性；或(ii)α-酮酸脱羧酶活性，大于约1、大于约10、大于约100、大于约150、或大于约200的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约100μM、约50μM、或约20μM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及(b)在其中产生异丁醛的条件下使所述多肽与α-酮异戊酸接触。在实施例中，所述方法包括：(a)提供多肽，其中所述多肽包含与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性和α-酮酸脱羧酶活性；以及(b)在其中产生异丁醛的条件下使所述多肽与α-酮异戊酸接触。在实施例中，所述多肽包含与SEQIDNO：52或61或它们的活性片段至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性。在实施例中，所述方法包括：(a)提供多肽，其中所述多肽包含α-酮酸脱羧酶活性，大于约1、大于约10、大于约100、大于约150、或大于约200的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约100μM、约50μM、或约20μM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及(b)在其中产生异丁醛的条件下使所述多肽与α-酮异戊酸接触。在实施例中，所述接触在小于约10mg/L硫胺素的存在下发生。在实施例中，所述接触在小于约30mg/L硫胺素、小于约20mg/L硫胺素、或小于约5mg/L硫胺素的存在下发生。在实施例中，所述接触在约1至约10mg/L硫胺素、约5至约20mg/L硫胺素、约10至约15mg/L硫胺素、约5至约15mg/L硫胺素、约5至约10mg/L硫胺素、或约1至约5mg/L硫胺素的存在下发生。在实施例中，所述接触在重组宿主细胞内发生，并且其中所述多肽对于重组宿主细胞是异源性的。在实施例中，所述重组宿主细胞是下列属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或糖酵母属(Saccharomyces)。在实施例中，所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；以及(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸。在实施例中，所述宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。在实施例中，所述重组宿主细胞还在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中包含至少一个缺失、突变、和/或替换。在实施例中，所述重组宿主细胞包含fra2的缺失。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的甘油-3-磷酸脱氢酶活性。

异丁醇的生产

本文提供了生产异丁醇的方法。在实施例中，所述方法包括：(a)提供包含异丁醇生物合成途径和多肽的宿主细胞，其中所述多肽包含下列中的至少一种：i)与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性和α-酮酸脱羧酶活性，或(ii)α-酮酸脱羧酶活性，大于约1、大于约10、大于约100、大于约150、或大于约200的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约100μM、约50μM、或约20μM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及(b)在其中产生异丁醇的条件下使所述宿主细胞与可发酵的碳底物接触。在实施例中，所述接触在小于约10mg/L硫胺素或小于约1mg/L硫胺素的存在下发生。在实施例中，所述重组宿主细胞是下列属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或糖酵母属(Saccharomyces)。在实施例中，所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；以及(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸。在实施例中，所述宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变、和/或替换。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含fra2的缺失。在实施例中，所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的甘油-3-磷酸脱氢酶活性。在实施例中，异丁醇以有效收率生产，该有效收率大于包含编码包含SEQIDNO：68且不包含(i)或(ii)的多肽的异源性多核苷酸的类似宿主细胞生产的有效收率。

因此，本文还提供了包含(i)异源性多肽，所述异源性多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物转化，其中所述多肽包含与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少约80％同一性；或编码(i)的异源性多肽的异源性多核苷酸的重组宿主细胞。在实施例中，所述多肽包含与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少约95％同一性。在实施例中，宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸。在实施例中，宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化。在实施例中，催化上述底物至产物转化的每一多肽对于所述宿主细胞而言是非天然的。在实施例中，所述重组宿主细胞包含降低的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。在实施例中，所述重组宿主细胞包含在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变、和/或替换。在实施例中，所述重组宿主细胞是下列属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或糖酵母属(Saccharomyces)。在实施例中，所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。

异丁醇生物合成途径

可使用的用于生产异丁醇的生物合成途径包括在美国专利7,851,188、7,889,993、和8,178,328中所描述的那些，上述专利全部以引用的方式并入本文。一种异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：

-丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸还原异构酶催化；

-2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如乙酰羟酸脱水酶催化；

-α-酮异戊酸至异丁醛，其可被例如支链酮酸脱羧酶催化；以及

-异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。

在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含对所述宿主细胞而言是异源性的至少一种多核苷酸、至少两种多核苷酸、至少三种多核苷酸、或至少四种多核苷酸。在实施例中，重组宿主细胞中的异丁醇生物合成途径的每一底物至产物转化被异源性多肽催化。在实施例中，催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物转化的多肽和/或催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化的多肽能够利用NADH作为辅因子。

能够被用于本文所述的底物至产物转化的基因和多肽以及鉴定此类基因和多肽的方法描述于本文中和/或本领域中，例如，对于异丁醇，在实例中和美国专利美国专利7,851,188、7,889,993、和8,178,328中。酮醇酸还原异构酶(KARI)例子描述于美国专利8,129,162和8,222,017以及美国专利申请公布20080261230A1、20100197519A1、和PCT申请公布WO/2011/041415中，全部这些文献以引用方式并入本文。在其中公开的KARI的例子是来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugmosa)PAO1、和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)PF5变体的那些。KARI包括粪厌氧棒状菌(Anaerostipescaccae)KARI变体“K9G9”和“K9D3”(分别为SEQIDNO：235和234)。美国申请公布20100081154A1和美国专利7,851,188描述了二羟酸脱水酶(DHAD)，包括来自变异链球菌(Streptococcusmutans)的DHAD(蛋白质SEQIDNO：417)。美国专利8,188,250(以引用方式并入本文)描述了SadB，来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)的醇脱氢酶(ADH)。醇脱氢酶还包括马肝脏ADH(“HADH”)和印度拜叶林克氏菌(Beijerinkiaindica)ADH(蛋白质SEQIDNO：247)，描述于美国申请公布20110269199(以引用方式并入本文)中。

应当理解，如本文所提供的包含异丁醇生物合成途径的宿主细胞还可包含一种或多种附加的修改。美国申请公布20090305363(以引用方式并入)公开了通过工程化酵母以表达胞质溶胶定位的乙酰乳酸合酶和基本上除去丙酮酸脱羧酶活性，提高的丙酮酸至乙酰乳酸的转化。降低甘油-3-磷酸脱氢酶活性的修改和/或编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的至少一种基因中的破坏或编码控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调控元件的至少一种基因中的破坏如美国专利申请公布20090305363(以引用方式并入本文)中所述，提供提高的通过Entner-Doudoroff途径的碳通量或还原当量平衡的宿主细胞的修改如美国专利申请公布20100120105(以引用方式并入本文)中所述。其他修改包括编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤的多肽的至少一种多核苷酸的整合。其他修改包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的至少一个缺失、突变、和/或替换。在实施例中，具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisae)的YMR226C(SEQIDNO：236)或其同源物。附加的修改包括编码具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换。在实施例中，具有醛脱氢酶活性的多肽是来自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisae)的ALD6(SEQIDNO：233)或其同源物。具有降低葡萄糖抑制的效应的遗传修改(其中酵母生产宿主细胞是pdc-)描述于美国申请公布20110124060(以引用方式并入本文)中。

重组宿主细胞还可包含(a)编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；和(b)(i)在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变、和/或替换；和/或(ii)编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在实施例中，影响Fe-S簇生物合成的多肽是由AFT1(核酸SEQIDNO：237，氨基酸SEQIDNO：238)、AFT2(SEQIDNO：239和240)、FRA2(SEQIDNO：241和242)、GRX3(SEQIDNO：243和244)、或CCC1(SEQIDNO：245和246)编码的。在实施例中，影响Fe-S簇生物合成的多肽是组成型突变体AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、或AFT1C293F。

用于生产的生长

本文所公开的重组宿主细胞生长在包含适合的碳底物的发酵培养基中。附加的碳底物可包括但不限于单糖如果糖、低聚糖如乳糖、麦芽糖、半乳糖、或蔗糖、多糖如淀粉或纤维素或它们的混合物和来自可再生的原料如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜、和大麦芽的未纯化的混合物。其他碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、或甘油。

此外，碳底物还可以是其向关键生物化学中间体的转化已被证明的一碳底物如二氧化碳、或甲醇。除一和二碳底物之外，甲基营养生物还已知利用多种其他包含碳的化合物如甲胺、葡糖胺和多种氨基酸用于代谢活动。例如，甲基营养酵母已知利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.GrowthC1Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32，编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，DonP.Publisher：Intercept，Andover，UK)。类似地，假丝酵母属(Candida)的多种物种将代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153：485-489(1990))。因此，预期本发明中利用的碳的来源可涵盖广阔范围的包含碳的底物，并将仅受生物体的选择的限制。

尽管预期全部上文提及的碳底物以及它们的混合物均适合本发明，在一些实施例中，所述碳底物是葡萄糖、果糖、和蔗糖，或对于经修改以利用C5糖类的酵母细胞是这些与C5糖类如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。蔗糖可来源于可再生的糖源如甘蔗、糖用甜菜、木薯、甜高粱、或它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过淀粉基原料包括谷物如玉米、小麦、黑麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物的糖化来源于可再生的谷物来源。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维素或木质纤维素生物质，如在例如美国专利申请公布20070031918A1中所描述的。生物质是指任何纤维质或木质纤维素材料，并包括包含纤维素的材料，以及任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质还可包含附加的组分，例如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、油菜籽、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花(例如向日葵和红花)、动物粪肥、以及它们的混合物。

除适合的碳源之外，发酵液体培养基还必须包含本领域的技术人员已知的适合培养物的生长和促进本文所述的酶途径的适合的矿物、盐、辅因子、缓冲液和其他组分。

培养条件

通常，细胞在约20℃至约40℃范围的温度在适当的培养基中生长。本发明中适合的生长培养基包括常规的商品化制备的培养基，例如LuriaBertani(LB)液体培养基、沙氏葡糖(SD)液体培养基、酵母培养基(YM)液体培养基、或包括酵母氮源、硫酸铵和右旋糖(作为碳/能源)的液体培养基，或针对大多数啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株的生长优化比例的蛋白胨、酵母提取物、和右旋糖混合物YPD培养基。其他限定或合成生长培养基也可被使用，并且适合特定微生物的生长的培养基将是微生物学或发酵科学领域的技术人员已知的。已知直接或间接地调节分解代谢物阻抑的剂的使用，例如，环腺苷酸2′：3′-单磷酸，也可被结合到发酵液体培养基中。

适合发酵的pH范围是约pH5.0至约pH9.0之间。在一个实施例中，约pH6.0至约pH8.0被用于初始条件。酵母的发酵适合的pH范围通常是约pH3.0至约pH9.0之间。在一个实施例中，约pH5.0至约pH8.0被用于初始条件。其他微生物的发酵适合的pH范围是约pH3.0至约pH7.5之间。在一个实施例中，约pH4.5至约pH6.5被用于初始条件。

发酵可以在有氧或厌氧条件下进行。在一个实施例中，厌氧或微氧条件被用于发酵。

工业分批和连续发酵

异丁醇或其他产物可使用分批发酵方法被生产。经典的分批发酵是封闭体系，在其中培养基的组成在发酵开始时被设定，并且在发酵过程中不受人工改变。标准的分批体系的变型是补料-分批体系。补料-分批发酵方法也适用于本发明，并且包括典型的分批体系，不同之处在于底物随着发酵过程递增地被添加。当分解代谢物阻抑倾向于抑制细胞的代谢时以及当期望在培养基中具有有限量的底物时，补料-分批体系是有用的。分批和补料-分批发酵方法在本领域内是常用的且众所周知，并且例子可见于如下文献：ThomasD.Brock，Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989)SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA.、或Deshpande，MukundV.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227，(1992)。

异丁醇或其他产物还可以使用连续发酵方法被生产。连续发酵是开放体系，在其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般而言使培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵考虑到影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或任何数量的因素的调节。调节用于连续发酵的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成的速率最大化的技术是工业微生物学领域为人们所熟知的，Brock详述了多种方法，参见上文。

预期异丁醇或其他产物的生产可使用分批、补料-分批或连续的方法实施，并且任何已知的发酵模式将是适合的。此外，预期细胞可作为全细胞催化剂被固定在基质上，并经受发酵条件以生产异丁醇。

从发酵液体培养基分离异丁醇的方法

生物生产的异丁醇可使用ABE发酵领域已知的方法从发酵液体培养基分离(参见，例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及其中的参考文献)。例如，可通过离心、过滤、滗析等从发酵液体培养基移除固体。然后，可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液-液提取、吸附、气提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵液体培养基分离异丁醇。

由于异丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏能够被用于分离混合物至其共沸组成。蒸馏可结合其他分离方法被使用，以获得共沸物附近的分离。可结合蒸馏被用于分离和纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液提取、吸附、和基于膜的技术。此外，丁醇可利用使用夹带剂的共沸蒸馏被分离(参见，例如，Doherty和Malone，ConceptualDesignofDistillationSystems，McGrawHill，NewYork，2001)。

丁醇-水混合物形成非均相共沸物，使得蒸馏可结合滗析被用于分离和纯化异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵培养基被蒸馏至接近共沸组成。然后，浓缩共沸混合物，通过滗析从发酵液体培养基分离异丁醇。滗出的水相可作为回流返回至第一蒸馏塔。富含异丁醇的滗出有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏被进一步纯化。

异丁醇还能够利用液-液提取结合蒸馏被从发酵液体培养基分离。在该方法中，利用使用适当溶剂的液-液提取从发酵液体培养基提取异丁醇。然后，包含异丁醇的有机相被蒸馏，以从溶剂分离丁醇。

蒸馏结合吸附也能够被用于从发酵液体培养基分离异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵液体培养基被蒸馏至接近共沸组成，然后通过使用吸附剂如分子筛除去剩余的水(Aden等人，LignocellulosicBiomasstoEthanolProcessDesignandEconomicsUtilizingCo-CurrentDiluteAcidPrehydrolysisandEnzymaticHydrolysisforCornStover，ReportNREL/TP-510-32438，NationalRenewableEnergyLaboratory，2002年6月)。

此外，蒸馏结合全蒸发可被用于从发酵液体培养基分离和纯化异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵液体培养基被蒸馏至接近共沸组成，然后由通过亲水性膜的全蒸发除去剩余的水(Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210(2004))。

原位产物移除(ISPR)(也被称为提取发酵)可用于从生产其的发酵容器中移除丁醇(或其它发酵性醇)，从而使微生物以高收率生产丁醇。本领域已经描述过的一种用于移除发酵性醇的ISPR方法是液-液提取。概括地讲，就丁醇发酵而言，例如，使包括微生物的发酵液体培养基在丁醇浓度达到毒性水平之前的时间与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。所述丁醇分配至有机提取剂相，降低了在包含微生物的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。

液-液提取能够，例如，根据美国专利申请公布2009/0305370(其公开内容全文以引用方式并入本文)中描述的方法进行。美国专利申请公布2009/0305370描述了生产丁醇和采用液-液提取从发酵液体培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：使发酵液体培养基与水不混溶的提取剂接触，以形成包含水相和有机相的两相混合物。通常，提取剂能够是有机提取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物。用于ISPR的提取剂能够是非醇提取剂。ISPR提取剂能够是外源的有机提取剂如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、1-十一烷醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一烷醛、月桂醛、20-甲基十一烷醛、以及它们的混合物。

在一些实施例中，通过使发酵液体培养基中的醇与有机酸(例如，脂肪酸)和能够使所述醇与所述有机酸酯化的催化剂接触能够形成酯。在此类实施例中，所述有机酸能够作为所述醇酯被分配至其中的ISPR提取剂。有机酸能够被补充至发酵容器和/或来源于被提供至发酵容器的补充碳的生物质。原料中存在的脂质能够被催化水解为有机酸，并且相同的催化剂(例如，酶)能够使有机酸与醇酯化。催化剂能够在发酵之前被提供至原料，或者能够在原料的提供之前或与其同时地被提供至发酵容器。当催化剂被提供至发酵容器时，通过脂质向有机酸的水解和有机酸与发酵容器中存在的丁醇基本上同时的酯化作用，能够获得醇酯。并非来源于原料的有机酸和/或天然油也能够被进料至发酵容器，而天然油被水解为有机酸。任何不与所述醇酯化的有机酸能够作为ISPR提取剂的部分。包含醇酯的提取剂能够被从发酵液体培养基分离，并且能够从提取剂回收醇。提取剂能够被再循环至发酵容器。如此，就丁醇生产的情况而言，例如，丁醇至酯的转化降低了发酵液体培养基中的游离丁醇浓度，保护了微生物免受提高的丁醇浓度的毒性影响。此外，未分级的谷物能够被用作原料而没有分离其中的脂质，因为脂质能够被催化水解为有机酸，从而降低了脂质在ISPR提取剂中积累的速率。

原位产物移除能够在分批模式或连续模式中进行。在连续模式的原位产物移除中，产物被连续地从反应器中移出。在分批模式的原位产物移除中，一定体积的有机提取剂被添加至发酵容器，并且提取剂在过程中不被移出。对于原位产物移除，有机提取剂能够在发酵开始时与发酵液体培养基接触，形成两相的发酵液体培养基。作为另外一种选择，有机提取剂能够在微生物已达到所期望的生长的量(这能够通过测量培养物的光密度确定)之后与发酵液体培养基接触。另外，有机提取剂能够在发酵液体培养基中的产物醇水平达到预先选定的水平时与发酵液体培养基接触。就根据本发明的一些实施例的丁醇生产的情况而言，有机酸提取剂能够在丁醇浓度达到毒性水平之前的时间与发酵液体培养基接触，使得丁醇与有机酸酯化以产生丁醇酯，并从而降低发酵容器中的丁醇浓度。然后，包含酯的有机相能够在达到所期望的丁醇酯有效滴度之后被从发酵容器移出(并从组成水相的发酵液体培养基分离)。在一些实施例中，包含酯的有机相在发酵容器中可用的可发酵糖的发酵基本上完成之后被从水相分离。

任何相中的异丁醇滴度能够通过本领域中已知的方法被测定，例如通过高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法，如在例如US20090305370(以引用方式并入本文)中所描述的。

实例

质粒：

pYZ090(SEQIDNO：69)被构建为包含用于表达ALS的具有从酵母CUP1启动子(nt2-449)表达的来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的alsS基因编码区(核苷酸位点457-2172)和随后的CYC1终止子(nt2181-2430)的嵌合基因、和用于表达KARI的从酵母ILV5启动子(2433-3626)表达的来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的ilvC基因编码区(nt3634-4656)和随后的ILV5终止子(nt4682-5304)的嵌合基因。

用SpeI和NotI消化了pYZ090，以移除大部分的CUP1启动子和全部的alsS编码序列和CYC终止子。然后，在用Klenow片段处理之后使载体自连，并转入大肠杆菌(E.coli)Stbl3细胞，针对氨苄青霉素抗性选择。通过用PCR跨越连接结合处的DNA测序，对两个独立的克隆确认了上述DNA区域的移除。所得到的质粒被命名为pYZ090ΔalsS(SEQIDNO：182)。

质粒pLH702(SEQIDNO：218)在一系列的步骤中被构建自pYZ090，如下列段落中所述。该质粒从酵母ILV5启动子表达KARI变体K9D3(SEQIDNO：234)。

pYZ058(pHR81-PCUP1-AlsS-PILV5-酵母KARI)来源于pYZ090(pHR81-PCUP1-AlsS-PILV5-lactisKARI)。用PmeI和SfiI酶切割了pYZ090，并将其与酵母KARI的PCR产物连接。所述PCR产物是用上游引物5’-catcatcacagtttaaacagtatgttgaagcaaatcaacttcggtgg-3’(SEQIDNO：248)和下游引物5’-ggacgggccctgcaggccttattggttttctggtctcaactttctgac-3’(SEQIDNO：249)从啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4741(ResearchGeneticsInc.)的基因组扩增的，并用PmeI和SfiI酶消化。通过测序验证了pYZ058。pLH550(pHR81-PCUP1-AlsS-PILV5-Pf5.KARI)来源于pYZ058。用OT1349(5’-catcatcacagtttaaacagtatgaaagttttctacgataaagactgcgacc-3’(SEQIDNO：250))和OT1318(5’-gcacttgataggcctgcagggccttagttcttggctttgtcgacgattttg-3’(SEQIDNO：251))PCR扩增了野生型Pf5.KARI基因，用PmeI和SfiI酶消化并与用PmeI和SfiI切割的pYZ058载体连接。通过测序验证了所得到的载体pLH550。pLH556通过用SpeI和NotI酶消化pLH550，并与从OT1383(5’-ctagtcaccggtggc-3’(SEQIDNO：252))和OT1384(5’-ggccgccaccggtga-3’(SEQIDNO：253))退火的包含针对SpeI和NotI位点的悬挂序列的接头连接，而来源于pLH550。该克隆步骤从质粒除去了alsS基因和PCUP1启动子的大片段，160bp残余的上游序列是非功能性的。通过测序验证了pLH556。pLH702来源于pLH556。用PmeI和SfiI酶从另外的载体切下了K9D3突变型KARI基因，并在PmeI和SfiI位点与pLH556连接，用K9D3基因替换了Pf5.KARI基因。通过测序验证了所构建的载体pLH702。

构建了pLH468质粒用于在酵母中表达DHAD、KivD和HADH。通过删除kivD基因和kivD上游的957碱基对的TDH3启动子，从pLH468构建了pBP915。用Swal消化了pLH468，在琼脂糖凝胶上纯化了大片段(12896bp)。然后用GelExtractionkit(Qiagen；Valencia，CA)提取。用T4DNA连接酶使分离的DNA片段自连，并用于转化电感受态TOP10大肠杆菌(Escherichiacoli)(Invitrogen；Carlsbad，CA)。分离了来自转化子的质粒，并通过使用Swal限制性酶的限制性分析验证了正确的缺失。还对分离株进行了跨越缺失位点的测序。具有正确的缺失的一个克隆被命名为pBP915(pLH468ΔkivD；SEQIDNO：166)。

pYZ067(SEQIDNO：254)被构建为包含下列嵌合基因：1)从酵母FBA1启动子表达的带有Lumio标签的来自变异链球菌(S.mutans)UA159的ilvD基因编码区，接着是FBA1终止子，用于表达二羟酸脱水酶，2)从酵母GPM1启动子表达的马肝脏ADH的编码区，接着是ADH1终止子，用于表达醇脱氢酶，和3)从酵母TDH3启动子表达的来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的KivD基因编码区，接着是TDH3终止子，用于表达酮异戊酸脱羧酶。

通过删除针对kivD和adh的启动子-基因-终止子盒，从pYZ067构建了质粒pYZ067ΔkivDΔhADH。用BamHI和SacI(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)消化了pYZ067，在琼脂糖凝胶上纯化了7934bp片段，然后用GelExtractionkit(Qiagen；Valencia，CA)提取。用DNA聚合酶I，大(Klenow)片段(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)处理了所分离的DNA片段，然后用T4DNA连接酶自连，并用于转化感受态TOP10大肠杆菌(Escherichiacoli)(Invitrogen；Carlsbad，CA)。分离了来自转化子的质粒，并通过序列分析验证了正确的缺失。正确的质粒分离株被命名为pYZ067ΔkivDΔhADH(SEQIDNO：255)。

实例1：大肠杆菌(E.coli)中候选酶的表达

基于生物多样性检索(描述于上文中)，使用针对在大肠杆菌(E.coli)中的表达优化的密码子合成了编码9种酶(表5)的基因(DNA2.0，MenloPark，Calif)。每种基因被克隆至载体pJexpress404(DNA2.0，MenloPark，Calif)中，处于T5启动子的控制下，并在大肠杆菌(E.coli)Top10(Invitrogen，SanDiego，Calif)中表达。在于补充了100ug氨苄青霉素/mL、有或没有补充30mg/L硫胺素的LB培养基中于37C在摇瓶中生长至OD600nm＝0.5之后，添加1mMIPTG并使培养物生长附加的14-16小时。通过离心收集了细胞，并通过SDS-PAGE验证了异源性蛋白质的表达。

表5：候选KIVD酶

实例2：大肠杆菌(E.coli)中候选酶的表达

基于来自第一轮生物多样性检索的酶测定结果，使用针对在大肠杆菌(E.coli)中的表达优化的密码子合成了编码13种附加的酶(表6)的基因(DNA2.0，MenloPark，Calif)。此外，还制备了编码乳酸乳球菌(L.lactis)kivD(对照；SEQIDNO：1)的经密码子优化的基因。每种基因被克隆至载体pJexpress404(DNA2.0，MenloPark，Calif)中，处于T5启动子的控制下，并在大肠杆菌(E.coli)Top10(Invitrogen，SanDiego，Calif)中表达。在于补充了100ug氨苄青霉素/mL、有或没有补充30mg/L硫胺素的LB培养基中于37C在摇瓶中生长至OD600nm＝0.5之后，添加1mMIPTG并使培养物生长附加的14-16小时。通过离心收集了细胞，并通过SDS-PAGE验证了异源性蛋白质的表达。

表6：候选KIVD酶的第二轮选择。

实例3：当在大肠杆菌(E.coli)中表达时表现出KIVD活性的酶的鉴定

通过对大肠杆菌(E.coli)无细胞提取物的酶分析，推定的KIVD酶被鉴定为具有所期望的α-酮异戊酸(αKIV)脱羧酶活性，详见下文。推定的酶在大肠杆菌(E.coli)中的表达详述于实例1和2中。

无细胞提取物的制备

大肠杆菌(E.coli)被悬浮于3mL的100mMHEPES、pH6.8、10mMMgCl₂中，并于0℃通过超声处理被破碎。使用尖探头超声处理细胞10秒，暂停25秒。重复上述循环12次，总计超声处理时间为2分钟。离心来自破裂细胞的粗提物，以使细胞碎片沉淀。移出上清液并在冰上保存，直到进行测定。

蛋白质定量

使用CoomassiePlus(ThermoScientific#23238，Rockford，Ill.)，通过布拉德福德测定法测量了无细胞提取物中的蛋白质浓度。BSA被用作标准品。通过使用Cary300分光光度计(AgilentTechnologies，WilmingtonDel.)在595nm跟踪吸光度，测量了蛋白质的浓度。

KIVD酶测定规程-偶联的

α-酮异戊酸至异丁醛的转化的速率在马肝脏ADH(hADH)偶联的酶测定中被测量，所述测定描述于Gocke，D.等人(Adv.Synth.Catal.2007，349，1425-1435)。于30℃在包含100mMHEPESpH6.8、10mMMgCl₂、200μMNADH、500μMTPP、30mMα-KIV(Sigma)、和0.45UhADH(1mg＝1.5U)(Sigma)的缓冲液中进行了无细胞提取物的测定。在Cary300分光光度计(AgilentTechnologies，WilmingtonDel.)上在1cm路径长度比色杯中，于340nm监测了NADH的氧化。对于NADH，使用6220M^-1cm^-1的摩尔消光系数计算了酶的速率。在多种浓度的hADH和无细胞提取物的对照确保了所测量的速率是由KIVD酶活性决定的。

从所测量的酶活性和总蛋白质浓度计算了大肠杆菌(E.coli)中表达的推定的KIVD酶的比活性。来自第1和2轮的结果分别显示在表7和8中。

表7：第1轮推定物的KIVD活性

ID	比活性(U/mg)
		kivD75	0.1
kivD76	＜0.1
		kivD77	＜0.1
kivD78	0.14
		kivD79	＜0.1
kivD80	4.0
		kivD81	16.5
kivD82	1.6
		kivD83	0.07

表8：第2轮推定物的KIVD活性

ID	比活性(U/mg)
		Mav	1.2
Par	2.7
		Cst	＜0.1
Bme	＜0.1
		Hmu	＜0.1
Cac	0.4
		Mca	13.9
Npu	＜0.1
		Sve	0.23
Bth	1.9
		Bce	＜0.1
kdcA	11.8
		kivD	59.5
载体对照	＜0.1

KIVD酶测定规程-比色的

对于具有高KIVD活性的三种酶，还使用醛特异性的(Sigma)比色酶测定法测量了α-酮异戊酸至异丁醛的转化速率，所述测定法已被DuPont-Durst和Gokel(J.ChemEdu.1978，55，206)描述。于30℃在包含100mMHEPESpH6.8、10mMMgCl₂、500μMTPP和30mMα-KIV的缓冲液中进行了无细胞提取物的测定。总的反应体积是1mL。通过在五个时间点(0、10、20和30分钟)移出200μL等分试样并在1mL的储液(5mg/mL的Purpald溶于2MNaOH中)使反应淬灭，监测了异丁醛的生成。然后，在室温孵育混合物20分钟，以允许颜色的显影。在孵育过程中，每5分钟混合混合物一次。0至10mM异丁醛的标准曲线被用于测定由所述酶产生的异丁醛的浓度。制备了每种标准品200mL并在零时间点添加至1mL储液。在室温孵育标准品20分钟，并且每5分钟混合一次。用Cary300分光光度计(AgilentTechnologies，WilmingtonDel.)测量了在535nm的吸光度。从所测量的酶活性和总蛋白质浓度计算了大肠杆菌(E.coli)中表达的推定的KIVD酶的比活性。

采用比色的和连续偶联的测定法发现了等效比活性，如表9中所示。

表9：比色的和偶联的测定法的比较

实例4：KIVD酶的TPP辅因子活化常数的测量

在大肠杆菌(E.coli)细胞的粗制裂解物中，就TPP辅因子活化常数对来自第1和2轮的具有最高活性的三种推定的KIVD酶(KivD80、KivD81、和Mca)、乳酸乳球菌(L.lactis)KivD和KdcA进行了评估。这些酶在大肠杆菌(E.coli)中的表达描述于实例1和2中。粗制裂解物的制备和蛋白质的定量如实例3中所述进行。

无细胞提取物的脱盐

ZebaDesaltSpinColumns(VWRPI89889)被用于对蛋白质进行脱盐，以移除松散地相关联的TPP。柱的准备按照制造商的说明书进行。全部的离心步骤均以1000xg进行2分钟。第一个离心步骤除去了制造商的储存缓冲液。通过由2mL100mMHEPES、pH6.8向柱的添加和随后的离心组成的四个洗涤步骤，准备了用于对细胞裂解物脱盐的柱。在洗涤步骤完成之后，将柱置于新鲜的15mLCorning管(VWR，21008-670)中，将600μL的细胞裂解物添加至该脱盐柱并离心。收集流出物并针对TPP依赖的KivD活性进行分析。

KIVD酶测定规程-偶联的

α-酮异戊酸至异丁醛的转化的速率在马肝脏ADH(hADH)偶联的酶测定中被测量，所述测定描述于Gocke，D.等人(Adv.Synth.Catal.2007，349，1425-1435)。于30℃在包含100mMHEPESpH6.8、10mMMgCl₂、200μMNADH、30mMα-KIV(Sigma)、和0.45UhADH(1mg＝1.5U)(Sigma)的缓冲液中进行了无细胞提取物的测定。TPP浓度发生了变化。在Cary300分光光度计(AgilentTechnologies，WilmingtonDel.)上在1cm路径长度比色杯中，于340nm监测了NADH的氧化。对于NADH，使用6220M^-1cm^-1的摩尔消光系数计算了酶的速率。在多种浓度的hADH和无细胞提取物的对照确保了所测量的速率是由KIVD酶活性决定的。

从所测量的酶活性和总蛋白质浓度计算了大肠杆菌(E.coli)中表达的推定的KIVD酶的比活性。然后，将这些比活性对TPP浓度作图。使用Kaleidagraph(Synergy)，将所得到的曲线拟合至饱和度公式(SA＝(SA_max*[TPP])/(K_c+[TPP]))+C)。测定了TPP辅因子活化常数(K_c)，并列于表10中。

表10：KivD推定物的TPP辅因子活化常数

ID	活化常数Kc，μM
		KivD80	50
kivD81	0.79
		Mca	0.53
KdcA	0.81
		KivD	73.4

实例5：在采用补充了硫胺素的培养基的大肠杆菌(E.coli)中表达后，所选择的第 2轮酶的KIVD活性

基于与具有KIVD活性的酶的序列同源性，进一步分析了五种第2轮的候选物。不含插入的载体和Mca被分别用作阴性和阳性对照。在大肠杆菌(E.coli)中的表达如实例2中所述进行，所作的修改是30mg/L盐酸硫胺素(Sigma)被补充至生长培养基中。如实例3中所述制备并测定了粗提物。SDS-PAGE分析表明，Npu作为不溶性蛋白质在大肠杆菌(E.coli)中表达。

表11：培养基中有补充硫胺素情况下酶的KIVD活性

ID	比活性(U/mg)
		Npu	＜0.1
Bme	2.17
		Sve	0.50
Hmu	1.25
		Cac	0.81
Mca	73.7
		载体对照	＜0.1

实例6：底物特异性比率的测量

针对底物偏好性评估了两种推定的KIVD酶(KivD81，Mca)、KdcA和LactisKivD。分离了编码每种上述酶的质粒(质粒的描述参见实例1和2)并转入大肠杆菌(E.coli)的电感受态KEIOΔldh菌株(OpenBiosystems，Huntsville，AL)。在于补充了100ug氨苄青霉素/mL的LB培养基中于30℃在摇瓶中生长至OD600nm＝0.5之后，添加1mMIPTG并使培养物生长附加的14-16小时。如下文所述制备了粗制细胞裂解物，并就使用aKiv和丙酮酸的活性分析了推定的KivD酶。

无细胞提取物的制备

大肠杆菌(E.coli)被悬浮于3mL的100mMHEPES、pH6.8、10mMMgCl₂中，并于0℃通过超声处理被破碎。使用探头超声处理细胞10秒，暂停25秒。重复上述循环12次，总计超声处理时间为2分钟。离心来自破裂细胞的粗提物，以使细胞碎片沉淀。移出上清液并在冰上保存，直到进行测定。

蛋白质定量

使用CoomassiePlus(ThermoScientific#23238，Rockford，III.)，通过布拉德福德测定法测量了无细胞提取物中的蛋白质浓度。BSA被用作标准品。通过使用Cary50分光光度计(AgilentTechnologies，WilmingtonDel.)在595nm跟踪吸光度，测量了蛋白质的浓度。

KIVD酶测定规程-偶联的

酮异戊酸至异丁醛的转化的速率在马肝脏ADH(hADH)偶联的酶测定中被测量，所述测定描述于Gocke，D.等人(Adv.Synth.Catal.2007，349，1425-1435)。于30℃在包含100mMHEPESpH6.8、10mMMgCl₂、200μMNADH、500μMTPP、和0.45UhADH(1mg＝1.5U)(Sigma)的缓冲液中进行了无细胞提取物的测定。底物、丙酮酸(Sigma)或αKIV(Sigma)以多种浓度被添加。在Cary300分光光度计(AgilentTechnologies，WilmingtonDel.)上在1cm路径长度比色杯中，于340nm监测了NADH的氧化。对于NADH，使用6220M^-1cm^-1的摩尔消光系数计算了酶的速率。在多种浓度的hADH和无细胞提取物的对照确保了所测量的速率是由KIVD酶活性决定的。

从所测量的酶活性和总蛋白质浓度计算了大肠杆菌(E.coli)中表达的推定的KIVD酶的比活性。以这些比活性对适当的底物作图。使用Kaleidagraph(Synergy)，将所得到的曲线拟合至米氏方程(Michaelis-Menton)，以确定K_m和V_max值。动力学值和特异性比率([(V_max/K_m)αKiv]/[(V_max/K_m)丙酮酸])列于表12中。

表12：KivD推定物的动力学值

实例7：PNY1503(BP1064)的构建

啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株BP1064(PNY1503)的构建

菌株BP1064来源于CEN.PK113-7D(CBS8340；CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)FungalBiodiversityCentre，Netherlands)并包含下列基因的缺失：URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6、和GPD2。

通过与包含与靶基因上游和下游同源的区域的PCR片段和G418抗性标记或用于选择转化子的URA3基因的同源重组，构建了彻底移除了整个编码序列的缺失。使用Cre重组酶移除了侧翼为loxP位点的G418抗性标记(pRS423：：PGAL1-cre；SEQIDNO：71)。通过同源重组移除了URA3基因，以构建无痕缺失，或者如果其侧翼为loxP位点，则使用Cre重组酶来移除。

无痕缺失流程采用自Akada等人，Yeast，23：399，2006。概括地讲，通过用重叠PCR组合A-B-U-C四种片段，制备了用于每一无痕缺失的PCR盒。所述PCR盒包含选择性/反向选择性标记，URA3(片段U)，其由天然的CEN.PK113-7DURA3基因与启动子(URA3基因的250bp上游)和终止子(URA3基因的150bp下游)组成。片段A和C对应于紧接靶基因的500bp上游(片段A)和靶基因3′端的500bp(片段C)。片段A和C被用于通过同源重组将所述盒整合进染色体。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因的500bp下游，并被用于通过同源重组从染色体切除URA3标记和片段C，因为当所述盒被整合进染色体中时，产生了对应于片段B的序列的直接重复。使用PCR产物ABUC盒，URA3标记首先被整合进染色体，然后通过同源重组被从染色体切除。初始的整合删除了所述基因，除3′500bp之外。在被切除时，所述基因的3′500bp区域也被删除。对于使用该方法的基因整合，将被整合的基因在PCR盒中被包括在片段A和B之间。

URA3缺失

为了删除内源性URA3编码区，从pLA54模板DNA(SEQIDNO：72)PCR扩增了aura3：：loxP-kanMX-loxP盒。pLA54包含乳酸克鲁维酵母(K.lactis)TEF1启动子和kanMX标记，并且侧翼是loxP位点，以允许利用Cre重组酶的重组并移除该标记。使用PhusionDNA聚合酶和引物BK505和BK506(SEQIDNO：73和74)进行了PCR。所述每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5′区，和编码区下游3′区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的替换。使用标准的遗传学技术(MethodsinYeastGenetics，2005，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，第201-202页)将所述PCR产物转化到CEN.PK113-7D中，并且于30℃在包含G418(100μg/ml)的YPD上对转化子进行选择。筛选的转化子的正确整合通过PCR来验证，使用引物LA468和LA492(SEQIDNO：75和76)，并命名为CEN.PK113-7DΔura3：：kanMX。

HIS3缺失

使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen；Valencia，CA)制备的CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，扩增了用于无痕HIS3缺失的PCR盒的四个片段。HIS3片段A的扩增使用引物oBP452(SEQIDNO：77)和引物oBP453(SEQIDNO：78)，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B的扩增使用引物oBP454(SEQIDNO：79)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQIDNO：80)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U的扩增使用引物oBP456(SEQIDNO：81)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQIDNO：82)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C的扩增使用引物oBP458(SEQIDNO：83)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQIDNO：84)。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。HIS3片段AB通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQIDNO：77)和oBP455(SEQIDNO：80)扩增。HIS3片段UC是通过重叠PCR生成的，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQIDNO：81)和oBP459(SEQIDNO：84)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtractionkit(Qiagen)纯化。HIS3ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQIDNO：77)和oBP459(SEQIDNO：84)扩增。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。

制备CEN.PK113-7DΔura3：：kanMX的感受态细胞，并用HIS3ABUCPCR盒转化，使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch；Orange，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶并补充了2％的乙醇的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP460(SEQIDNO：85)和oBP461(SEQIDNO：86)，使用由GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA。正确的转化子选择为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：kanMXΔhis3：：URA3。

从Δura3位点移除KanMX标记以及从Δhis3位点移除URA3标记

所述KanMX标记通过使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch)，用pRS423：：PGAL1-cre(SEQIDNO：71)转化CEN.PK113-7DΔura3：：kanMXΔhis3：：URA3，并于30℃接种到缺少组氨酸和尿嘧啶并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上而除去。转化子于30℃在补充了1％半乳糖的YP中生长～6小时，以诱导Cre重组酶和KanMX标记的切除，并于30℃接种到YPD(2％葡萄糖)进行恢复。分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长和接种到YPD中以去除pRS423：：PGAL1-cre质粒。通过在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基平板、和缺乏组氨酸的合成完全培养基平板的生长测定，检测分离物中KanMX标记、URA3标记、和pRS423：：PGAL1-cre质粒的丢失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3并命名为BP857。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP450(SEQIDNO：87)和oBP451(SEQIDNO：88)用于Δura3，以及引物oBP460(SEQIDNO：85)和oBP461(SEQIDNO：86)用于Δhis3，所用的基因组DNA用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备。

PDC6缺失

用于无痕PDC6缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs)并以用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板。PDC6片段A的扩增使用引物oBP440(SEQIDNO：89)和引物oBP441(SEQIDNO：90)，其包含与PDC6片段B的5′端同源的5′尾。PDC6片段B的扩增使用引物oBP442(SEQIDNO：91)，其包含与PDC6片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP443(SEQIDNO：92)，其包含与PDC6片段U的5′端同源的5′尾。PDC6片段U的扩增使用引物oBP444(SEQIDNO：93)，其包含与PDC6片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP445(SEQIDNO：94)，其包含与PDC6片段C的5′端同源的5′尾。PDC6片段C的扩增使用引物oBP446(SEQIDNO：95)，其包含与PDC6片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP447(SEQIDNO：96)。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。PDC6片段AB通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440(SEQIDNO：89)和oBP443(SEQIDNO：92)进行扩增。PDC6片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444(SEQIDNO：93)和oBP447(SEQIDNO：96)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtractionkit(Qiagen)纯化。PDC6ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440(SEQIDNO：89)和oBP447(SEQIDNO：96)进行扩增。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。

制备了CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3的感受态细胞，并使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch)，用PDC6ABUCPCR盒转化。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶并补充了％的乙醇的合成完全培养基上。具有pdc6敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP448(SEQIDNO：97)和oBP449(SEQIDNO：98)，使用由GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6：：URA3。

CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6：：URA3分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP448(SEQIDNO：97)和oBP449(SEQIDNO：98)，使用由GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA。来自分离物的PDC6基因的不存在通过PCR阴性结果来证明，所用的PDC6编码区的特异性引物为oBP554(SEQIDNO：99)和oBP555(SEQIDNO：100)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6并被命名为BP891。

PDC1缺失ilvDSm整合

所述PDC1基因被删除并被来自变异链球菌(Streptococcusmutans)ATCC#700610的ilvD编码区替代。对于用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒，用使用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的NYLA83(描述于美国申请公布20110124060，该文献全文以引用方式并入本文)基因组DNA作为模板，使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs)扩增了接着来自变异链球菌(Streptococcusmutans)的ilvD编码区的所述片段A。(NYLA83是携带PDC1缺失ilvDSm整合的菌株，描述于美国专利申请公布2009/0305363中，该文献全文以引用方式并入本文。)扩增了PDC1片段A-ilvDSm(SEQIDNO：101)，所使用的引物是oBP513(SEQIDNO：102)和引物oBP515(SEQIDNO：103)，其包含与PDC1片段B的5′端同源的5′尾。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs)，并使用用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，扩增了所述用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒的B、U和C片段。PDC1片段B的扩增使用引物oBP516(SEQIDNO：104)，其包含与PDC1片段A-ilvDSm的3′端同源的5′尾，和引物oBP517(SEQIDNO：105)，其包含与PDC1片段U的5′端同源的5′尾。PDC1片段U的扩增使用引物oBP518(SEQIDNO：106)，其包含与PDC1片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP519(SEQIDNO：107)，其包含与PDC1片段C的5′端同源的5′尾。PDC1片段C的扩增使用引物oBP520(SEQIDNO：108)，其包含与PDC1片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP521(SEQIDNO：109)。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。PDC1片段A-ilvDSm-B通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm和PDC1片段B并使用引物oBP513(SEQIDNO：102)和oBP517(SEQIDNO：105)进行扩增。PDC1片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518(SEQIDNO：106)和oBP521(SEQIDNO：109)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtractionkit(Qiagen)纯化。PDC1A-ilvDSm-BUC盒通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm-B和PDC1片段UC并使用引物oBP513(SEQIDNO：102)和oBP521(SEQIDNO：109)进行扩增。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。

制备了CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6的感受态细胞，并用PDC1A-ilvDSm-BUCPCR盒转化，使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶并补充了2％的乙醇的合成完全培养基上。具有PDC1敲除ilvDSm整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP511(SEQIDNO：110)和oBP512(SEQIDNO：111)，使用由GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA。来自分离物的PDC1基因的不存在通过PCR阴性结果来证明，所用的PDC1编码区的特异性引物为oBP550(SEQIDNO：112)和oBP551(SEQIDNO：113)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm-URA3。

CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm-URA3过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。使用用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA，用引物oBP511(SEQIDNO：110)和oBP512(SEQIDNO：111)，通过PCR和测序确认了PDC1的缺失、ilvDSm的整合、和标记的移除。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm并命名为BP907。

PDC5缺失sadB整合

所述PDC5基因被删除并被来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)的sadB编码区替换(sadB基因描述于美国专利申请专利申请公布2009/0269823中，该文献全文以引用方式并入本文)。用于PDC5缺失-sadB整合的PCR盒的一个片段首先被克隆到质粒pUC19-URA3MCS中。

pUC19-URA3MCS是基于pUC19的，并且包含位于多克隆位点(MCS)内的来自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)URA3基因的序列。pUC19包含pMB1复制子和编码用于在大肠杆菌(Escherichiacoli)中复制和选择的β-内酰胺酶的基因。除了URA3的编码序列之外，还包括了来自该基因上游和下游的序列，用于在酵母中表达URA3基因。所述载体能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合载体。

所述DNA涵盖了URA3编码区，连同URA3编码区上游250bp和下游150bp，所述序列来自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)，CEN.PK113-7D基因组DNA的扩增使用引物oBP438(SEQIDNO：114)，其包含BamHI、AscI、PmeI、和FseI限制性位点，以及oBP439(SEQIDNO：115)，其包含XbaI、PacI、和NotI限制性位点，使用PhusionHigh-FidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs)进行。基因组DNA使用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)来制备。在用BamHI和XbaI消化后，用T4连接酶将所述PCR产物和pUC19(SEQIDNO：116)连接，生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过PCR和测序确认，所用引物为oBP264(SEQIDNO：117)和oBP265(SEQIDNO：118)。

所述sadB编码序列和PDC5片段B被克隆进pUC19-URA3MCS，以生成PDC5A-sadB-BUCPCR盒的sadB-BU部分。所述sadB编码序列扩增以pLH468-sadB(SEQIDNO：119)作为模板，使用引物oBP530(SEQIDNO：120)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP531(SEQIDNO：121)，其包含与PDC5片段B的5′端同源的5′尾。PDC5片段B的扩增使用引物oBP532(SEQIDNO：122)，其包含与sadB的3′端同源的5′尾，和引物oBP533(SEQIDNO：123)，其包含Pmel限制性位点。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。sadB-PDC5片段B通过重叠PCR生成，通过混合sadB和PDC5片段BPCR产物并用引物oBP530(SEQIDNO：120)和oBP533(SEQIDNO：123)进行扩增。在用合适的酶消化后，用AscI和PmeI消化所得到的PCR产物并用T4DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。所得质粒用作模板以扩增sadB-片段B-片段U，所用引物为oBP536(SEQIDNO：124)和oBP546(SEQIDNO：125)，其包含与PDC5片段C的5′端同源的5′尾。PDC5片段C的扩增使用引物oBP547(SEQIDNO：126)，其包含与PDC5sadB-片段B-片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP539(SEQIDNO：127)。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。PDC5sadB-片段B-片段U-片段C通过重叠PCR生成，通过混合PDC5sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536(SEQIDNO：124)和oBP539(SEQIDNO：127)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化接着使用GelExtractionkit(Qiagen)。PDC5A-sadB-BUC盒(SEQIDNO：128)通过扩增PDC5sadB-片段B-片段U-片段C生成，所用引物为oBP542(SEQIDNO：129)，其包含与天然的PDC5编码序列上游紧接的50个核苷酸同源的5′尾，和oBP539(SEQIDNO：127)。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。

制备了CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm的感受态细胞，并用PDC5A-sadB-BUCPCR盒转化，使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶并补充了1％的乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有pdc5敲除sadB整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP540(SEQIDNO：130)和oBP541(SEQIDNO：131)，使用由GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA。来自分离物的PDC5基因的不存在通过PCR阴性结果来证明，所用的PDC5编码区的特异性引物为oBP552(SEQIDNO：132)和oBP553(SEQIDNO：133)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdcl：：ilvDSmΔpdc5：：sadB-URA3。

CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdcl：：ilvDSmΔpdc5：：sadB-URA3过夜生长在YPE(0.1％乙醇)中并在30℃接种到补充了乙醇(无葡萄糖)并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离株。所述PDC5的缺失、sadB的整合以及标记的移除是通过PCR确认的，所用引物为oBP540(SEQIDNO：130)和oBP541(SEQIDNO：131)，使用由GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB并命名为BP913。

GPD2缺失

为删除内源的GPD2编码区，使用loxP-URA3-loxPPCR(SEQIDNO：135)作为模板DNA，PCR扩增了gpd2：：loxP-URA3-loxP盒(SEQIDNO：134)。loxP-URA3-loxP包含来自(ATCC#77107)的URA3标记，侧翼为loxP重组酶位点。使用PhusionDNA聚合酶和引物LA512和LA513(SEQIDNO136和137)进行了PCR。每种引物的GPD2部分来源于GPD2编码区上游5′区和编码区下游3′区，使得loxP-URA3-loxP标记的整合导致GPD2编码区的替换。所述PCR产物转化到BP913并且转化子在缺乏尿嘧啶并补充了1％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上筛选。使用引物oBP582和AA270(SEQIDNO：138和139)，通过PCR筛选转化子以验证正确的整合。

通过用pRS423：：PGAL1-cre(SEQIDNO：71)转化并于30C接种到缺少组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，循环利用了URA3标记。将转化子划线接种到补充了1％乙醇并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，并且在30C孵育以选择失去了URA3标记的分离株。抗5-氟-乳清酸的分离物生长在YPE(1％乙醇)上以移除pRS423：：PGAL1-cre质粒。所述缺失和标记移除通过PCR确认，所用引物为oBP582(SEQIDNO：138)和oBP591(SEQIDNO：140)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadBΔgpd2：：loxP并命名为PNY1503(BP1064)。

实例8：PNY1507的构建

啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株BP1135(PNY1505)和PNY1507以及 生产异丁醇的衍生物的构建

本实例的目的是构建啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株BP1135和PNY1507。这些菌株来源于PNY1503(BP1064)。PNY1503(BP1064)的构建描述于上文中。BP1135包含FRA2基因的附加的缺失。PNY1507来源于BP1135，具有ADH1基因的附加的缺失，具有针对在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达经密码子优化的来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的kivD基因向ADH1基因座的整合。

FRA2缺失

FRA2缺失被设计为从编码序列3′端删除250个核苷酸，保留FRA2编码序列的最初113个核苷酸不动。一个阅读框终止密码子出现在去除下游7个核苷酸的位置。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen；Valencia，CA)制备的CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，扩增了用于无痕FRA2缺失的PCR盒的四个片段。FRA2片段A的扩增使用引物oBP594(SEQIDNO：141)和引物oBP595(SEQIDNO：142)，其包含与FRA2片段B的5′端同源的5′尾。FRA2片段B的扩增使用引物oBP596(SEQIDNO：143)，其包含与FRA2片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP597(SEQIDNO：144)，其包含与FRA2片段U的5′端同源的5′尾。FRA2片段U的扩增使用引物oBP598(SEQIDNO：145)，其包含与FRA2片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP599(SEQIDNO：146)，其包含与FRA2片段C的5′端同源的5′尾。FRA2片段C的扩增使用引物oBP600(SEQIDNO：147)，其包含与FRA2片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP601(SEQIDNO：148)。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。FRA2片段AB通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段A和FRA2片段B并用引物oBP594(SEQIDNO：141)和oBP597(SEQIDNO：144)进行扩增。FRA2片段UC通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段U和FRA2片段C并用引物oBP598(SEQIDNO：145)和oBP601(SEQIDNO：148)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtractionkit(Qiagen)纯化。FRA2ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段AB和FRA2片段UC并用引物oBP594(SEQIDNO：141)和oBP601(SEQIDNO：148)进行扩增。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。

制备了PNY1503的感受态细胞并用FRA2ABUC聚合酶链反应盒转化，使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch；Orange，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶并补充了1％的乙醇的合成完全培养基上。具有fra2敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP602(SEQIDNO：149)和oBP603(SEQIDNO：150)，使用由GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA。正确的转化子生长于YPE(酵母提取物、蛋白质胨、1％乙醇)中，并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的分离株。通过PCR确认缺失和标记移除，所述PCR具有引物oBP602(SEQIDNO：149)和oBP603(SEQIDNO：150)，使用由GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA。来自分离物的FRA2基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，使用FRA2编码区特异性的引物，oBP605(SEQIDNO：151)和oBP606(SEQIDNO：152)。所述正确的分离物被选择为菌株CEN.PK113-7DMATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ：：loxPfra2Δ并命名为PNY1505(BP1135)。用异丁醇途径质粒(pYZ090，SEQIDNO：69)和pLH468(SEQIDNO：70)转化了该菌株，一个克隆被命名为BP1168(PNY1506)。

ADH1缺失和kivDLl(y)整合

ADH1基因被删除，并被来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的kivD编码区替换，所述kivD编码区是针对在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达经过密码子优化的。将ADH1缺失-kivD_Ll(y)整合无痕盒首先克隆进质粒pUC19-URA3MCS中。

使用pLH468(SEQIDNO：70)作为模板，使用引物oBP562(SEQIDNO：153)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP563(SEQIDNO：154)，其包含与ADH1片段B的5′端同源的5′尾，扩增了来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的经密码子优化以在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达的kivD编码区。ADH1片段B扩增自如上所述制备的基因组DNA，所用引物为oBP564(SEQIDNO：155)，其包含与kivD_L1(y)的3′端同源的5′尾，和引物oBP565(SEQIDNO：156)，其包含FseI限制性位点。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。kivD_L1(y)-ADH1片段B通过重叠PCR生成，通过混合kivD_Ll(y)和ADH1片段BPCR产物并用引物oBP562(SEQIDNO：153)和oBP565(SEQIDNO：156)进行扩增。所得到的PCR产物用PmeI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。ADH1片段A扩增自基因组DNA，所用引物为oBP505(SEQIDNO：157)，其包含SacI限制性位点，和引物oBP506(SEQIDNO：158)，其包含AscI限制性位点。用SacI和AscI消化ADH1片段APCR产物，并用T4DNA连接酶连接进包含kivD_L1(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点。ADH1片段C扩增自基因组DNA，所用引物为oBP507(SEQIDNO：159)，其包含PacI限制性位点，和引物oBP508(SEQIDNO：160)，其包含SalI限制性位点。用PacI和SalI消化ADH1片段CPCR产物，并用T4DNA连接酶连接进包含ADH1片段A-kivD_L1(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点。从载体pRS316-UAS(PGK1)-P_FBA1-GUS(SEQIDNO：161)扩增了混合启动子UAS(PGK1)-P_FBA1，扩增使用引物oBP674(SEQIDNO：162)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP675(SEQIDNO：163)，其包含Pmel限制性位点。用AscI和PmeI消化了UAS(PGK1)-P_FBA1PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含kivD_L1(y)-ADH1片段ABC的质粒的相应位点。从所得到的质粒扩增了整个整合盒并用PCRPurificationkit(Qiagen)进行了纯化，扩增使用引物oBP505(SEQIDNO：157)和oBP508(SEQIDNO：160)。

制备了PNY1505的感受态细胞，并使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch)，用以上构建的ADH1-kivD_L1(y)PCR盒转化了感受态细胞。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶并补充了％的乙醇的合成完全培养基上。转化子在YPE(1％乙醇)中生长并且被接种到合成完全培养基上，所述培养基包含5-氟-乳清酸(0.1％)，在30℃选择丢失了URA3标记的分离株。ADH1的缺失和kivD_Ll(y)的整合通过PCR来确认，所用外部引物为oBP495(SEQIDNO：164)和oBP496(SEQIDNO：165)，和使用了kivD_Ll(y)特异性引物oBP562(SEQIDNO：153)和外部引物oBP496(SEQIDNO：165)，使用由GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen)制备的基因组DNA。正确的分离物被选择为菌株CEN.PK113-7DMATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ：：loxPfra2Δadh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1t，并被命名为PNY1507(BP1201)。

实例9：PNY2211的构建

啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株PNY2211和PNY2209的构建

以多步骤从啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株PNY1507中构建PNY2211，如下列段落所述。首先修饰了所述菌株经修饰以包含磷酸酮(醇)酶基因。接下来，使用靶向邻近磷酸酮(醇)酶基因的整合载体将乙酰乳酸合酶基因(alsS)加到菌株中。最后，使用同源重组除去磷酸酮(醇)酶基因和整合载体序列，导致alsS无痕插入到在pdc1Δ：：ilvD和染色体XII的天然TRX1基因之间的基因间区域。所得基因型PNY2211是MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ：：loxPfra2Δadh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1t。

通过同源重组将磷酸酮(醇)酶基因盒导入PNY1507中。如下生成整合构建体。质粒pRS423：：CUP1-alsS+FBA-budA(之前在US2009/0305363中有所描述，该文献全文以引用方式并入本文)用NotI和XmaI消化以去除1.8kb的FBA-budA序列，并且在用Klenow片段处理后再连接载体。接下来，用TEF1启动子变体替换CUP1启动子(之前由Nevoigt等人，Appl.Environ.Microbiol.72：5266-5273(2006)所述的M4变体，该文献全文以引用方式并入本文)，该替换经由来自DNA2.0(MenloPark，CA)的DNA合成和载体构建服务完成。所得到的质粒pRS423：：TEF(M4)-alsS用StuI和MluI酶切(除去包含部分alsS基因和CYC1终止子的1.6kb的部分)，然后与4kb的PCR产物混合，所述PCR产物从pRS426：：GPD-xpk1+ADH-eutD(SEQIDNO：167)中用引物N1176(SEQIDNO：168)和N1177(SEQIDNO：169)生成，以及与0.8kb的PCR产物DNA混合，所述PCR产物从酵母基因组DNA(ENO1启动子区域)中使用引物N822(SEQIDNO：170)和N1178(SEQIDNO：171)生成，并转入啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株BY4741(ATCC#201388)；缺口修复克隆技术，参见Ma等人.，Gene58：201-216(1987)。通过将细胞接种到无组氨酸的合成完全培养基上获得转化子。通过PCR(引物N821(SEQIDNO：173)和N1115(SEQIDNO：174))和通过限制性消化(BglI)，确认了正确装配的所期望的质粒(pRS423：：TEF(M4)-xpk1+ENO1-eutD，SEQIDNO：172)。随后对两个克隆测序。通过用SacI和NotI消化分离3.1kb的TEF(M4)-xpk1基因并将其克隆到pUC19-URA3：：ilvD-TRX1载体中(CloneA，用AflII切除)。克隆片段用Klenow片段处理以生成平末端用于连接。将连接反应产物转化到大肠杆菌Stbl3细胞中，选择氨苄青霉素抗性。通过PCR(引物N1110(SEQIDNO：175)和N1114(SEQIDNO：176))确认了TEF(M4)-xpk1的插入。所述载体用线性化AflII并用Klenow片段处理。通过在用Klenow片段处理后进行连接克隆了1.8kbKpnI-HincII遗传霉素抗性盒。将连接反应产物转化到大肠杆菌Stbl3细胞中，选择氨苄青霉素抗性。遗传霉素盒的插入通过PCR(引物N160SeqF5(SEQIDNO：183)和BK468(SEQIDNO：178))确认。质粒序列被提供为SEQIDNO：179(pUC19-URA3：：pdc1：：TEF(M4)-xpk1：：kan)。

分离了所得到的整合盒(pdc1：：TEF(M4)-xpk1：：KanMX：：TRX1)(凝胶纯化了AscI和NaeI消化产生的5.3kb条带)并将其转化到PNY1507中，所述转化使用ZymoResearchFrozen-EZYeastTransformationKit(目录号T2001)。通过接种到YPE加50μg/mlG418上选择转化子。在期望基因座上的整合通过PCR(引物N886(SEQIDNO：180)和N1214(SEQIDNO：181))确认。接下来，编码Cre重组酶的质粒pRS423：：GAL1p-Cre(SEQIDNO：71)被用于除去loxP-侧翼的KanMX盒。所述盒的正确移除通过PCR(引物oBP512(SEQIDNO：111)和N160SeqF5(SEQIDNO：177))确认。最后，使用包括的遗传霉素选择标记将所述alsS整合质粒(SEQIDNO：225，pUC19-kan：：pdc1：：FBA-alsS：：TRX1，cloneA)转化到这个菌株中。测试两个整合体的乙酰乳酸合酶活性，该测试通过用质粒pYZ090ΔalsS(SEQIDNO：182)和pBP915(SEQIDNO：166)转化进行，使用Amberg、Burke和Strathern“MethodsinYeastGenetics”(2005)中的Protocol#2，并且评估包含葡萄糖的培养基中的生长和异丁醇生产(生长和异丁醇测量方法如下：所有菌株在缺乏组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基上，其包含0.3％的葡萄糖和0.3％的乙醇作为碳源(在125mL通气Erlenmeye烧瓶中的10mL培养基(VWR目录号89095-260)。在过夜培养后(30℃，在250rpm的40NewBrunswickScientificShaker中)，在包含2％葡萄糖和0.05％乙醇的合成完全培养基中(在125mL紧密封口的Erlenmeyer烧瓶中的20mL培养基(VWR目录号89095-260))，将培养物稀释回0.2OD(EppendorfBioPhotometer测量)。在培养48小时后(30℃，在250rpm的40NewBrunswickScientificShaker中)，培养物上清液(使用Spin-X离心管过滤单位收集，Costar目录号8169)通过按照美国申请公布20070092957中所述的方法的HPLC被分析)。)。两个克隆中的一个是阳性的并且称为PNY2218。

PNY2218用Cre重组酶处理，并且通过PCR(引物N886(SEQIDNO：180)和N160SeqR5(SEQIDNO：183))针对xpk1基因和pUC19整合载体序列的丢失筛选了所得到的克隆。在xpk1的上游DNA和整合载体插入过程中引入的同源DNA的重组之后，这仅留下整合到pdc1-TRX1基因间区域的alsS基因(为“无痕”插入，因为载体、标记基因和loxP序列丢失)。虽然这种重组可在任何点上发生，载体整合似乎在无遗传霉素选择的情况下是稳定的，并且仅在导入Cre重组酶后观察到所述重组事件。一个克隆称为PNY2211。

实例10：PNY1528的构建

PNY1528(hADH整合进PNY2211)

通过与包含与靶区域的上游和下游同源的区域和用于选择转化子的URA3基因的PCR产物的同源重组，构建了缺失/整合。通过同源重组移除了URA3基因，以构建无痕缺失/整合。

无痕缺失/整合流程采用自Akada等人，Yeast，23：399(2006)。通过在用PCR扩增整个盒用于缺失/整合流程之前，将单独的片段克隆进质粒，组合A-B-U-C四种片段和待整合的基因，制备了用于每一缺失/整合的PCR盒。待整合的基因在所述盒中被包括在片段A和B之间。所述PCR盒包含选择性/反向选择性标记，URA3(片段U)，其由天然的CEN.PK113-7DURA3基因与启动子(URA3基因的250bp上游)和终止子(URA3基因的150bp下游)组成。片段A和C(各自为大约100至500bp长)对应于紧接靶区域上游的序列(片段A)和靶区域3′序列(片段C)。片段A和C被用于通过同源重组将所述盒整合进染色体。片段B(500bp长)对应于紧接靶区域的500bp下游，并被用于通过同源重组从染色体切除URA3标记和片段C，因为当所述盒被整合进染色体中时，产生了对应于片段B的序列的直接重复。

YPRCΔ15缺失和马肝脏adh整合

删除了YPRCΔ15基因座并替换为针对在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达经密码子优化的马肝脏adh基因，其连接有来自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的PDC5启动子区域(538bp)和来自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的ADH1终止子区域(316bp)。用于YPRCΔ15缺失-P[PDC5]-adh_HL(y)-ADH1t整合的无痕盒被首先克隆进质粒pUC19-URA3MCS。

使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen；Valencia，CA)制备的CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，扩增了片段A-B-U-C。YPRCΔ15片段A扩增自基因组DNA，所用引物为oBP622(SEQIDNO：184)，其包含KpnI限制性位点，和引物oBP623(SEQIDNO：185)，其包含与YPRCΔ15片段B的5′端同源的5′尾。YPRCΔ15片段B扩增自基因组DNA，所用引物为oBP624(SEQIDNO：186)，其包含与YPRCΔ15片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP625(SEQIDNO：187)，其包含FseI限制性位点。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。YPRCΔ15片段A-YPRCΔ15片段B通过重叠PCR生成，通过混合YPRCΔ15片段A和YPRCΔ15片段BPCR产物并用引物oBP622(SEQIDNO：184)和oBP625(SEQIDNO：187)进行扩增。所得到的PCR产物用KpnI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。YPRCΔ15片段C扩增自基因组DNA，所用引物为oBP626(SEQIDNO：188)，其包含NotI限制性位点，和引物oBP627(SEQIDNO：189)，其包含PacI限制性位点。用NotI和PacI消化了YPRCΔ15片段CPCR产物，并用T4DNA连接酶连接到包含YPRCΔ15片段AB的质粒的对应位点。使用引物HY21(SEQIDNO：190)，其包含AscI限制性位点，和引物HY24(SEQIDNO：191)，其包含与adh_Hl(y)的5’端同源的5’尾，从CEN.PK113-7D基因组DNA扩增了PDC5启动子区域。adh_Hl(y)-ADH1t扩增自pBP915(SEQIDNO：166)，使用了引物HY25(SEQIDNO：192)，其包含与P[PDC5]的3′端同源的5′尾，和引物HY4(SEQIDNO：193)，其包含Pmel限制性位点。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。P[PDC5]-adh_HL(y)-ADH1t通过重叠PCR生成，通过混合P[PDC5]和adh_HL(y)-ADH1tPCR产物并用引物HY21(SEQIDNO：190)和HY4(SEQIDNO：193)进行扩增。用AscI和PmeI消化了所得到的PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含YPRCΔ15片段ABC的质粒的相应位点。从所得到的质粒扩增了整个整合盒，扩增使用引物oBP622(SEQIDNO：184)和oBP627(SEQIDNO：189)。

制备了PNY2211的感受态细胞，并使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch；Orange，CA)，用YPRCΔ15缺失-P[PDC5]-adh_HL(y)-ADH1t整合盒PCR产物进行了转化。转化混合物在30C接种到缺乏尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。使用引物URA3-endF(SEQIDNO：194)和oBP637(SEQIDNO：195)，通过PCR筛选了转化子。正确的转化子生长于YPE(1％乙醇)中，并在30C接种到补充了1％EtOH并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的分离株。使用外部引物oBP636(SEQIDNO：124)和oBP637(SEQIDNO：195)和用YeaStarGenomicDNAkit(ZymoResearch)制备的基因组DNA，通过PCR确认了YPRCΔ15的缺失和P[PDC5]-adh_HL(y)-ADH1t的整合。选择了下列基因型的正确的分离株用于进一步修饰：CEN.PK113-7DMATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ：：loxPfra2Δadh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1typrcΔ15Δ：：P[PDC5]-ADH|adh_Hl-ADH1t。

马肝脏adh在fra2Δ的整合

针对在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达经密码子优化的马肝脏adh基因，与来自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的PDC1启动子区域(870bp)和来自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的ADH1终止子区域(316bp)一起被整合进fra2缺失的位点。用于fra2Δ-P[PDC1]-adh_HL(y)-ADH1t整合的无痕盒被首先克隆进质粒pUC19-URA3MCS。

使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen；Valencia，CA)制备的CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，扩增了片段A-B-U-C。使用引物oBP695(SEQIDNO：197)，其包含NotI限制性位点，和引物oBP696(SEQIDNO：198)，其包含PacI限制性位点，从基因组DNA扩增了fra2Δ片段C。用NotI和PacI消化了fra2Δ片段CPCR产物，并用T4DNA连接酶连接至pUC19-URA3MCS的对应位点。使用引物oBP693(SEQIDNO：199)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP694(SEQIDNO：200)，其包含FseI限制性位点，从基因组DNA扩增了fra2Δ片段B。用PmeI和FseI消化了所得到的PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至用适当的酶消化后的包含fra2Δ片段C的质粒的相应位点。用引物oBP691(SEQIDNO：201)，其包含BamHI和AsiSI限制性位点，和引物oBP692(SEQIDNO：202)，其包含AscI和SwaI限制性位点，从基因组DNA扩增了fra2Δ片段A。用BamHI和AscI消化了fra2Δ片段APCR产物，并用T4DNA连接酶连接至用适当的酶消化后的包含fra2Δ片段BC的质粒的相应位点。使用引物HY16(SEQIDNO：203)，其包含AscI限制性位点，和引物HY19(SEQIDNO：204)，其包含与adh_Hl(y)的5’端同源的5’尾，从CEN.PK113-7D基因组DNA扩增了PDC1启动子区域。adh_Hl(y)-ADH1t扩增自pBP915，使用了引物HY20(SEQIDNO：205)，其包含与P[PDC1]的3′端同源的5′尾，和引物HY4(SEQIDNO：193)，其包含Pmel限制性位点。用PCRPurificationkit(Qiagen)纯化PCR产物。P[PDC1]-adh_HL(y)-ADH1t通过重叠PCR生成，通过混合P[PDC1]和adh_HL(y)-ADH1tPCR产物并用引物HY16(SEQIDNO：203)和HY4(SEQIDNO：193)进行扩增。用AscI和PmeI消化了所得到的PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含fra2Δ片段ABC的质粒的相应位点。使用引物oBP691(SEQIDNO：201)和oBP696(SEQIDNO：198)从所得到的质粒扩增了整个整合盒。

制备了具有整合在YPRCΔ15的adh_Hl(y)的PNY2211变体的感受态细胞，并使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch)，用fra2Δ-P[PDC1]-adh_HL(y)-ADH1t整合盒PCR产物进行了转化。转化混合物在30C接种到缺乏尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。使用引物URA3-endF(SEQIDNO：194)和oBP731(SEQIDNO：206)通过PCR筛选了转化子。正确的转化子生长于YPE(1％乙醇)中，并在30C接种到补充了1％EtOH并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的分离株。通过使用内部引物HY31(SEQIDNO：207)和外部引物oBP731(SEQIDNO：155)的菌落PCR和使用外部引物oBP730(SEQIDNO：208)和oBP731(SEQIDNO：206)的PCR，用YeaStarGenomicDNAkit(ZymoResearch)制备的基因组DNA，确认了P[PDC1]-adh_HL(y)-ADH1t的整合。具有下列基因型的正确的分离株被命名为PNY1528：CEN.PK113-7DMATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ：：loxPfra2Δ：：P[PDC1]-ADH|adh_Hl-ADH1tadh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_L1(y)-ADH1typrcΔ15Δ：：P[PDC5]-ADH|adh_Hl-ADH1t。

实例11：菌株PNY1549、PNY1550、和PNY1551的构建。

本实例的目的是描述用于用kivD_Lg(y)或kivD_Mc(y)替换在adh1Δ基因座的kivD_L1(y)inPNY1528染色体拷贝的构建体的组装和表达kivD基因的产异丁醇菌株NY1549、PNY1550、和PNY1551的构建。

通过与包含与靶区域的上游和下游同源的区域和用于选择转化子的URA3基因的PCR产物的同源重组，构建了缺失/整合。通过同源重组移除了URA3基因，以构建无痕缺失/整合。无痕缺失/整合流程采用自Akada等人，Yeast，23：399，2006。通过在用PCR扩增整个盒用于缺失/整合流程之前，将单独的片段克隆进质粒，组合A-B-U-C四种片段和待整合的基因，制备了用于每一缺失/整合的PCR盒。待整合的基因在所述盒中被包括在片段A和B之间。所述PCR盒包含选择性/反向选择性标记，URA3(片段U)，其由天然的CEN.PK113-7DURA3基因与启动子(URA3基因的250bp上游)和终止子(URA3基因的150bp下游)区域组成。片段A和C(500bp长)对应于紧接靶区域上游的序列(片段A)和靶区域3′序列(片段C)。片段A和C被用于通过同源重组将所述盒整合进染色体。片段B(500bp长)对应于紧接靶区域的500bp下游，并被用于通过同源重组从染色体切除URA3标记和片段C，因为当所述盒被整合进染色体中时，产生了对应于片段B的序列的直接重复。

用以整合kivD_Lg(y)和kivD_Mc(y)的质粒来源于被构建用于将UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_L1(y)整合进啤酒糖酵母(Saccaromycescerevisiae)的ADH1基因座的质粒。用于将UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_L1(y)整合进ADH1基因座的质粒的构建描述于下文中。质粒被构建在pUC19-URA3MCS中。

ADH1缺失/UAS(PGK1)P[FBA1]-kivDL1(y)整合质粒的构建

使用pLH468(SEQIDNO：70)作为模板，使用引物oBP562(SEQIDNO：153)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP563(SEQIDNO：154)，其包含与ADH1片段B的5′端同源的5′尾，扩增了来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的经密码子优化以在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达的kivD编码区kivD_L1(y)。ADH1片段B扩增自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)CEN.PK113-7D基因组DNA，使用了引物oBP564(SEQIDNO：155)，其包含与kivD_Ll(y)的3′端同源的5′尾，和引物oBP565(SEQIDNO：156)，其包含FseI限制性位点。用PCRPurificationkit(Qiagen；Valencia，CA)纯化PCR产物。kivD_L1(y)-ADH1片段B通过重叠PCR生成，通过混合kivD_L1(y)和ADH1片段BPCR产物并用引物oBP562(SEQIDNO：153)和oBP565(SEQIDNO156)进行扩增。所得到的PCR产物用PmeI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。ADH1片段A扩增自基因组DNA，所用引物为oBP505(SEQIDNO：157)，其包含SacI限制性位点，和引物oBP506(SEQIDNO：158)，其包含AscI限制性位点。用SacI和AscI消化ADH1片段APCR产物，并用T4DNA连接酶连接进包含kivD_L1(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点。ADH1片段C扩增自基因组DNA，所用引物为oBP507(SEQIDNO：159)，其包含PacI限制性位点，和引物oBP508(SEQIDNO：160)，其包含SalI限制性位点。用PacI和SalI消化ADH1片段CPCR产物，并用T4DNA连接酶连接进包含ADH1片段A-kivD_L1(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点。杂合启动子UAS(PGK1)-P_FBA1(SEQIDNO：161)扩增自载体pRS316-UAS(PGK1)-P_FBA1-GUS，所用引物为oBP674(SEQIDNO：162)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP675(SEQIDNO：163)，其包含Pmel限制性位点。用AscI和PmeI消化了UAS(PGK1)-P_FBA1PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含kivD_L1(y)-ADH1片段ABC的质粒的相应位点以产生pBP1181。

pBP1716、pBP1719、和pBP2019的构建

从ADH1缺失/UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_L1(y)整合质粒pBP1181移除了kivD_L1(y)。用PmeI和FseI消化了质粒，在琼脂糖凝胶上纯化了大的DNA片段，然后用凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取。ADH1片段B扩增自pBP1181，所用引物为oBP821(SEQIDNO：210)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP484(SEQIDNO：211)，其包含FseI限制性位点。用PmeI和FseI消化了ADH1片段BPCR产物，并用T4DNA连接酶连接至上述凝胶纯化的DNA大片段的相应位点。对应于kivD_L1(y)的3’500bp的PCR片段被克隆进所得到的载体，用于PNY1528中kivD_L1(y)的定向删除。用引物oBP822(SEQIDNO：212)，其包含NotI限制性位点，和引物oBP823(SEQIDNO：213)，其包含PacI限制性位点，从pBP1181扩增了片段。用NotI和PacI消化了所述片段，并用T4DNA连接酶连接至用适当限制性酶消化后的具有kivD_L1(y)缺失的上述质粒中URA3下游的相应位点。所得到的质粒被命名为pBP1716。

由DNA2.0(MenloPark，CA)合成了针对在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达经密码子优化的来自格氏李斯特菌(Listeriagrayi)的kivD编码区(SEQIDNO：214)kivD_Lg(y)。使用引物oBP828(SEQIDNO：215)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP829(SEQIDNO：216)，其包含Pmel限制性位点，扩增了kivD_Lg(y)。所得到的PCR产物用PmeI消化，并用T4DNA连接酶连接到用适合的酶消化过的pBP1716中的相应位点。用引物FBAp-F(SEQIDNO：217)和oBP829(SEQIDNO：216)，通过PCR验证了所克隆基因的取向。具有正确取向的kivD_Lg(y)的分离株被命名为pBP1719。

由DNA2.0(MenloPark，CA)合成了针对在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达经密码子优化的来自解酪蛋白巨大球菌(Macrococcuscaseolyticus)的kivD编码区(SEQIDNO：224)。使用引物oBP900(SEQIDNO：226)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP901(SEQIDNO：227)，其包含Pmel限制性位点，扩增了kivD_Mc(y)。所得到的PCR产物用PmeI消化，并用T4DNA连接酶连接到用适合的酶消化过的pBP1716中的相应位点。用引物FBAp-F(SEQIDNO：217)和oBP901(SEQIDNO：227)，通过PCR验证了所克隆基因的取向。具有正确取向的kivD_Mc(y)的分离株被命名为pBP2019。

菌株PNY1549、PNY1550、和PNY1551的构建

用质粒pLH702和pYZ067DkivDDhADH转化了菌株PNY1528。转化子被命名为PNY1549。

从pBP1719扩增了kivD_L1(y)缺失/kivD_Lg(y)整合盒，所用引物为oBP505(SEQIDNO：73)和oBP823(SEQIDNO：213)。制备了PNY1528的感受态细胞并使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch；Orange，CA)，用上述PCR产物转化。转化混合物在30C接种到缺乏尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。转化子生长于YPE(1％乙醇)中，并在30C接种到补充了1％EtOH并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的分离株。使用引物oBP674(SEQIDNO：162)和oBP830(SEQIDNO：220)和用YeaStarGenomicDNAkit(ZymoResearch)制备的基因组DNA，通过PCR确认了kivD_L1(y)的缺失和kivD_Lg(y)的整合。正确的分离株在与PNY1528中的kivD_L1(y)相同的基因座包含kivD_Lg(y)并从相同的启动子表达。用质粒pLH702和pYZ067DkivDDhADH转化了分离株。转化子被命名为PNY1550。

从pBP2019扩增了kivD_L1(y)缺失/kivD_Mc(y)整合盒，所用引物为oBP505(SEQIDNO：157)和oBP823(SEQIDNO：213)。制备了PNY1528的感受态细胞并使用Frozen-EZYeastTransformationIIkit(ZymoResearch)，用上述PCR产物转化。转化混合物在30C接种到缺乏尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。使用引物HY51(SEQIDNO：221)和oBP906(SEQIDNO：222)，通过PCR筛选了转化子。正确的转化子生长于YPE(1％乙醇)中，并在30C接种到补充了1％EtOH并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的分离株。使用引物HY50(SEQIDNO：223)和HY51(SEQIDNO：221)和用YeaStarGenomicDNAkit(ZymoResearch)制备的基因组DNA，通过PCR确认了kivD_L1(y)的缺失和kivD_Mc(y)的整合。正确的分离株在与PNY1528中的kivD_L1(y)相同的基因座包含kivD_Mc(y)并从相同的启动子表达。用质粒pLH702和pYZ067DkivDDhADH转化了分离株。转化子被命名为PNY1551。

实例12：KIVD发酵

方法：

种菌的制备

对于每一菌株，解冻了一个冷冻的小瓶，转入125mL通风摇瓶中的10mL种菌培养基中，并于30℃以300rpm摇动孵育，进行过夜生长。然后，将五mL的上述过夜培养物转移至含有75mL种菌培养基的250mL通风摇瓶，于30℃以300rpm摇动生长过夜。当培养物达到OD6001-2时，将上述摇瓶培养物用于接种1L发酵器。种菌培养基的组成如下：不含氨基酸的酵母氮源(Difco)，6.7g/L；不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的YeastSyntheticDrop-outMediumSupplements(Sigma)，2.8g/L；L-亮氨酸，20mg/L；L-色氨酸，4mg/L；硫胺素-HCl，20mg/L；烟酸，20mg/L；乙醇，3g/L；葡萄糖10g/L。用20％氢氧化钾将pH调节至5.2，并通过0.22μ过滤器对上述培养基过滤消毒。

发酵器的准备和运行：

发酵在1LBiostatBDCU3发酵器(Sartorius，USA)中进行。通过PrimaDB质谱仪(ThermoElectronCorp.，USA)监控了废气组成。为了测量废气中的异丁醇和乙醇，首先使气体通过了置于冰水浴中的具有0.5L水的1升Shott瓶，然后再送至质谱仪。在整个发酵过程中，发酵器的温度被维持在30℃，并用20％KOH将pH控制在5.2。透气被控制在0.2标准升每分钟，搅拌控制在100rpm。没有控制溶解氧，并且其对于大部分的发酵是不能被检测到的。取出样品并在600nm分析了光密度，并用YSISelectBiochemistyAnalyzer(YSI，Inc.，YellowSprings，Ohio)分析了葡萄糖浓度。利用上述分析，通过人工添加50％(w/w)的溶液，将葡萄糖维持在过量(5-20g/L)。

制备了用于发酵的培养基如下：在消毒之前，含有4.0g硫酸铵、2.2g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、和0.2mLSigmaAntifoam204的520mL水被转移至发酵器。发酵器在121℃消毒30分钟。在冷却至设定的30℃后，通过泵无菌地添加了消毒后的成分。消毒后的成分在200mL总体积中制备：4.8mL微量矿物质溶液(在1L水中制备：15gEDTA、4.5g七水硫酸锌、0.8g无水氯化锰、0.3g六水氯化钴、0.3g五水硫酸铜、0.4g无水钼酸二钠、4.5g二水氯化钙、3g七水硫酸亚铁、1g硼酸、0.1g碘化钾)、0.8mL维生素混合物(在1L的水中：50mg生物素、1g泛酸钙、1g烟酸、25g肌醇、1g盐酸吡哆醇、0.2g对-氨基苯酸)、16g葡萄糖、3mL乙醇、12.8mgL-亮氨酸、3.2mgL-色氨酸、2.2g不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的YeastSyntheticDrop-outMediumSupplements(Sigma)、硫胺素-HCl以表1中所列的量被添加用于具体的发酵，并用去离子水将体积补足至200mL；在添加至发酵器之前，对上述溶液进行过滤消毒。接种后发酵器的终体积是800mL。

培养物上清液中葡萄糖、异丁醇、和其他发酵副产物的测量通过HPLC进行，使用了Bio-RadAminexHPX-87H柱(Bio-Rad，USA)、折射率(RI)和二极管阵列(210nm)检测器、Agilent1100系列HPLC(Agilent，USA)。色谱分离使用0.01NH₂SO₄作为流动相，以0.6mL/min流速和40℃的柱温进行。在发酵结束时对脱水器取样，并通过相同的HPLC方法加以分析。还测量了脱水器中的水的重量，以确定从发酵器提取的异丁醇和遗传的总量。用MettlerToledoRE40Refractometer(MettlerToledo，USA)在20℃测定了种菌瓶中的葡萄糖浓度。所报道的收率是基于所消耗的葡萄糖。异丁醇的收率包括了发酵液体培养基中的异丁醇和最后取样的脱水器中的。图2显示了对于每一菌株在每一硫胺素浓度，异丁醇和α-酮异戊酸的摩尔收率。图3显示了对于每一菌株在每一硫胺素浓度，α-酮异戊酸经历发酵时间的浓度。

表13：实验设计。如上文所述准备了所有的发酵器，使用了下列的硫胺素添加以及菌株。给出了发酵结束时样品的结果，经过了70-72小时的发酵时间。

Claims (18)

1.将α-酮异戊酸转化成异丁醛的方法，包括：

a.提供多肽，其中所述多肽包含下列中的至少一种：

(i)与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％同一性；或

(ii)α-酮异戊酸脱羧酶活性，大于1的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约20μM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及

b.在其中产生异丁醛的条件下使所述多肽与α-酮异戊酸接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽具有使用hmmsearch程序小于1E-223的KIVD簇序型HMME值。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述接触在重组宿主细胞内发生，并且其中所述多肽对于重组宿主细胞是异源性的。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述重组宿主细胞是下列属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或糖酵母属(Saccharomyces)。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；以及(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的异源性多核苷酸，所述多肽催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞还包含降低的或消除的丙酮酸脱羧酶活性。

9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞还包含在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变、和/或替换。

10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含fra2的缺失。

11.根据权利要求3-10中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含降低的或消除的甘油-3-磷酸脱氢酶活性。

12.生产异丁醇的方法，包括：

a.提供包含异丁醇生产途径的重组宿主细胞，所述生产途径包含多肽，其中所述多肽包含下列中的至少一种：

(i)与SEQIDNO：51、52、53、55、56、58、59、61或63或它们的活性片段至少80％同一性；或

(ii)α-酮异戊酸脱羧酶活性，大于1的α-酮异戊酸与丙酮酸的特异性比率，以及约20μM或更小的二磷酸硫胺素辅因子活化常数(K_c)；以及

b.在其中产生异丁醇的条件下使所述重组宿主细胞与碳底物接触。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多肽具有使用hmmsearch程序小于1E-223的KIVD簇序型HMME值。

14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，还包括使用液-液提取来分离异丁醇。

15.根据权利要求14所述的方法，其中提取剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母。

17.生产异丁醇的方法，包括：

a.提供包含异丁醇生物合成的重组宿主细胞，所述异丁醇生物合成包含与SEQIDNO：52或61具有至少80％同一性的多肽；以及

b.在其中产生异丁醇的条件下使所述重组宿主细胞与碳底物接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述接触在小于约30g/L硫胺素的存在下发生。