CN105463112A

CN105463112A - 用于检测人类pdgfra基因d842v突变的引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN105463112A
Application number: CN201610022659.6A
Authority: CN
Inventors: 朱峰; 杨惠娟; 段卫涛; 赵平锋
Original assignee: WUHAN HYGIEA BIOSCIENCE CO Ltd
Current assignee: WUHAN HYGIEA BIOSCIENCE CO Ltd
Priority date: 2016-01-13
Filing date: 2016-01-13
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2036-01-13
Also published as: CN105463112B

Abstract

本发明公开了用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物、探针及试剂盒，其中引物及探针包括突变上游ARMS引物PM1-F，与D842V(2525A>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列，突变下游引物PW1-R，与PDGFRA基因保守序列结合；5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针PW1-P，能与扩增片段结合；以及5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针PW1-B，能与D842V位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。本发明的引物及探针特异性高、灵敏度好，检测能力高达1％。由其制备的试剂盒检测结果准确易读，操作简单快速，适用范围广。

Description

用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物、探针及试剂盒。

背景技术

胃肠间质瘤(gastrointestinalstromltumor，GIST)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，其发病率有逐年增高的趋势。主要发生于胃肠道、大网膜和肠系膜，占所有胃肠道肿瘤的0.2％，占胃肠道肉瘤的80％，C-kit受体(又称CD117)基因通常呈阳性表达。对绝大多数患者来说，基因突变是肿瘤形成的关键，其中CKIT基因突变占80-85％，PDGFRα突变占7％，野生型(未检测到突变)占10-15％。GIST患者手术切除后容易复发，中位复发时间约为2年，仅有10％的患者长期随访未见复发。

血小板衍生生长因子受体(Platelet-derivedGrowthFactorReceptors,PDGFR)是一种调节细胞生长的跨膜蛋白，属于III型酪氨酸激酶家族，主要分布于平滑肌细胞，内皮组织细胞、成纤维细胞和胶质细胞。PDGFR在调节细胞增殖、分化和新血管形成等方面发挥重要调节作用。PDGFR通过与信号分子结合后形成受体配体复合物并活化PDGFR，进而激活磷脂酰肌醇及下游的RAS-MAPK和PIK3CA信号通路，通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核，诱导相应基因表达，进而调节肿瘤细胞的分裂和增殖。

甲磺酸伊马替尼(格列卫)是一种分子靶向药物，用于治疗不能切除或发生转移的恶性胃肠道间质肿瘤，在GIST的治疗中取得了非常好的疗效。目前，对于术后复发或转移的GIST患者，如果存在高危因素或不能进行手术治疗，甲磺酸伊马替尼(格列卫)是标准的一线药物，当格列卫用药过程中不能耐受，或出现疾病广泛进展(generalizedprogression)时，二线药物应用苹果酸舒尼替尼(索坦)。

有研究表明，携带有PDGFRA基因D842V突变的GIST患者对伊马替尼耐药。在一项对携带PDGFRA突变的GIST患者的生存结局进行报道的国际调查中，在D842V突变的31例可评估患者中无一例获得疾病应答(imatinib)，21例(68％)发生疾病进展。

目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的方法灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。

发明内容

为了解决现有检测技术出现的灵敏度低、检测时间长、检测效率低、样本易污染、假阳性率高等问题，本发明提供了用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，灵敏度高，特异性强，有效避免假阳性。本发明还提供了包括上述引物和探针的试剂盒，检测方便快速，操作简单，结果易读，适用范围广。

本发明提供的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，核苷酸序列如下：

突变上游ARMS引物PM1-F：SEQIDNO:1，

突变下游引物PW1-R：SEQIDNO:2，

检测探针PW1-P：SEQIDNO:3，

阻断探针PW1-B：SEQIDNO:4；

其中，检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。

表1：PDGFRA基因D842V热点突变

突变名称	氨基酸变化	碱基变化	Cosmic ID
				PM1	D842V	2525A>T	736

上述引物和探针是针对表1中位点突变设计的特异性检测引物，其中，PM1-F为突变上游ARMS引物，与D842V(2525A>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；PW1-R为突变下游引物，与PDGFRA基因保守序列结合；PW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；PW1-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与D842V位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。

优选地，上述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。MGB(MinorGrooveBinder)基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。

本发明提供的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，包括以上任一所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针。

优选地，所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：

外控上游引物PR-F：SEQIDNO:5，

外控下游引物PR-R：SEQIDNO:6，

外控检测探针PR-P：SEQIDNO:7，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。

其中，PR-F和PR-R为外控上下游引物，扩增PDGFRA基因保守序列；PR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。

优选地，所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：

内控上游引物IC-F：SEQIDNO:8，

内控下游引物IC-R：SEQIDNO:9，

内控检测探针IC-P：SEQIDNO:10，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。

其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。

优选地，所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有发生2525A>T碱基变化的PDGFRA基因片段>gi|568815594:54285801-54286200的阳性质粒，含有PDGFRA基因保守序列>gi|568815594:54288901-54289300段碱基的外控质粒，含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。

优选地，所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，试剂盒中的反应体系分为两种：

检测反应体系：包括用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH₂O；

质控反应体系：包括外控引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH₂O；

所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品FastAdvancedMasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg²⁺。

本发明还提供上述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒的使用方法，是首先提取待检样品的基因组DNA，分别加入到检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果：

首先需要满足JOE信号Ct值≤25，非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM信号Ct值≤20；9<Ct_质控≤18；然后按照△Ct＝Ct_检测-Ct_质控判定，△Ct≤11.1为阳性，△Ct>11.1为阴性；

所述Ct_检测为待检样品的基因组DNA在检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值，所述Ct_质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。

优选地，上述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒的使用方法中，荧光定量PCR反应的条件为：

95℃10min；

92℃15sec，58℃1min，共15个循环；

92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术，可以特异性的检测人类PDGFRA基因D842V突变。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。

(2)在本发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。在本发明试剂盒的内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。检测快速，且操作简单，结果易读。

(3)本方法灵敏度高，可实现50拷贝突变基因的稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。

附图说明

图1为实施例1中IC实验结果；

图2为实施例1中非模板对照(NTC)实验结果；

图3为实施例1中阳性对照(STD)实验结果；

图4为实施例1中灵敏度实验结果；

图5为实施例1中精密度实验结果；

图6为实施例2阴性样本实验结果；

图7为实施例2中阳性样本实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1、突变检测引物及探针，质控引物及探针序列设计：

根据NCBI数据库公布的PDGFRA基因(NCBIReferenceSequence:NM_006206.4)野生型序列，以18号外显子D842V突变位点(见表1)为参考，用PrimerPremier5和PrimerExpress3.0生物信息学软件设计特异性突变引物和探针(见表2)。以基因工程构建的突变质粒(即PM1质粒，插入基因片段>gi|568815594:54285801-54286200，且发生D842V碱基变化)和野生型质粒(插入基因片段>gi|568815594:54285801-54286200)为模板，建立了实时荧光PCR突变(Mutation)检测体系，实现对PDGFRA基因D842V突变位点的高灵敏度和高特异性检测。

表2：用于人类PDGFRA基因D842V突变检测的特异性引物和探针组合

SEQ ID NO:	名称	序列(5’→3’)	末端修饰
				1	PM1-F	CTGTGACTTTGTCCTGTCCAGAAT	无
2	PW1-R	AGCCTGACCAGTGAGGGAAGT	无
				3	PW1-P	CTATGTGTCGAAAGGC	5’端FAM，3’端MGB
4	PW1-B	GGCCAGAGACATC	5’端双脱氧修饰，3’端MGB

根据NCBI数据库公布的PDGFRA基因(NCBIReferenceSequence:NC_000004.12)21号外显子保守序列，设计外控引物和探针(见表3)。以基因工程构建的外控质粒(即PR质粒，插入基因片段>gi|568815594:54288901-54289300)为模板，建立了实时荧光PCR外控(ExternalControl)检测体系，对待测样本基因组DNA的质量和上样量进行质控。

表3：用于PDGFRA基因突变检测样本质控的外控引物和探针组合

SEQ ID NO:	名称	序列(5’→3’)	末端修饰
				5	PR-F	GTGGGTGGAAAGGTCTGGATAA	无
6	PR-R	GTGGAGCACCGCCATGAA	无
				7	PR-P	CTGTGCTGTTCCGCA	5’端FAM，3’端MGB

根据NCBI数据库公布的matK基因(NCBIReferenceSequence:NC_001666.2)保守序列(non-humanDNA)，设计内控引物和探针(见表4)。以基因工程构建的内控质粒(即IC质粒，插入基因片段>gi|11994090:c2400-2001)为模板，建立了实时荧光PCR内控(InternalControl)检测体系，对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控。

表4：用于PCR扩增反应内部质控的内控引物和探针组合

SEQ ID NO:	名称	序列(5’→3’)	末端修饰
				8	IC-F	TCGTAAGGAATCAAATGCTGGAG	无
9	IC-R	CAACGGGTTTACTAATAGGATGCC	无
				10	IC-P	TCGATACCACAGTCCTTGCAACTCCCC	5’端JOE，3’端BHQ1

2、检测人类PDGFRA基因D842V突变的检测试剂盒组成

表5：试剂盒组成成分

名称	成份
		PDGFRA-8联PCR反应条	反应体系1～2(每个反应体系独立一管)
PDGFRA-阳性对照	含PM1和PR质粒各8.3×10²拷贝/μL；含IC质粒5×10²拷贝/μL
		IC-内控模板	含IC质粒3×10³拷贝/μL

各反应体系组成如下：

表6：实时荧光PCR扩增反应体系组成

注：ABpremix全称FastAdvancedMasterMix，购自美国应用生物系统公司；10×buffer(Mg²⁺Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司。

PCR反应总体积25μL，含19μL的反应体系，1μL的IC模板和5μL的检测模板(阳性对照、非模板对照、质粒模板或待测样本基因组DNA)，IC模板和检测模板可预混。

其中，反应体系1用于人类PDGFRA基因D842V突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表2)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表4)。

反应体系2用于待测样本的质控。体系包含用于外控基因扩增的外控引物和探针组合(见表3)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表4)。

3、本发明试剂盒同样适用于石蜡包埋的组织样本

石蜡包埋样本的提取使用QIAampDNAFFPETissueKit(CatNo.56404)。按照说明书提取胃肠道间质瘤患者组织标本基因组DNA，操作步骤简述如下：

取临床采集的石蜡包埋组织切片(10μm，5～7片)放入1.5mL的离心管中，加入1000μL的二甲苯，涡旋10sec，12000rpm室温离心5min,弃上清(注意不要倒掉沉淀)；加入1000μL无水乙醇，以除去残留的二甲苯，涡旋混匀，12000rpm室温离心5min，弃上清；打开离心管盖，在37℃孵育10～15min，直至乙醇完全蒸发；分别加入180μLbufferATL和20μL蛋白酶K，涡旋混匀，56℃孵育2h左右，直到该组织完全溶解(在孵育过程中可以轻弹重悬，有利与提高提取量)；加入200μLbufferAL，涡旋混匀后加入200μL无水乙醇，再次涡旋震荡；将最后的混合物加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃废液；加入500μLbufferAW1，8000rpm离心1min，弃废液；加入500μLbufferAW2，12000rpm离心3min，弃废液；12000rpm离心1min；将离心柱放置在新的1.5ml离心管中，加入50～100μLbufferAE，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集滤液，-20℃保存。

将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。定量后，母液-20℃保存。荧光定量PCR检测方法和结果判断同上所述。

其他形式的样本可以根据需要采用现有常规的提取手段获得DNA。

4、实时荧光PCR扩增反应体系设置：用2孔实时荧光PCR扩增反应进行PDGFRA基因D842V突变的检测。其中，反应体系1(见表6)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系，反应体系2(见表4)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。

实时荧光PCR扩增反应基本原理：上述检测探针序列5’端连接荧光基团(FAM、JOE)，3’端连接淬灭基团(MGB、BHQ1)。未进行PCR扩增反应前，检测探针5’端荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近，由于荧光共振能量转移的作用，荧光基团不能发出荧光。随着PCR扩增反应的进行，检测探针在DNA聚合酶的作用下发生水解，5’端荧光基团脱落而与淬灭基团相互分离，进而能发出荧光。通过仪器检测荧光信号的积累可反映待测模板目的片段的起始浓度。在突变检测探针、外控检测探针和阻断探针的3’端连接有MGB(MinorGrooveBinder)基团。MGB基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。

该试剂盒的优势：(1)在本发明实时荧光PCR突变检测体系中，对目的基因突变区域进行PCR扩增。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。(2)在本发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。(3)在本发明实时荧光PCR内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。

5、实时荧光PCR扩增反应：

将样本的基因组DNA用TE(10mmol/L，pH8.0)稀释到2～10ng/μL作为模板，加入到实时荧光PCR扩增反应体系中(见表6)进行扩增。

实时荧光PCR扩增反应条件设置：

表7：实时荧光PCR扩增反应条件

最优的，在Stage2阶段(15个循环)，58℃的退火延伸温度，有利于突变模板的富集。在Stage3阶段(30个循环)，60℃的退火延伸温度可以保证更好的扩增特异性。

6、检测结果分析

根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值≤20，体系性能良好，结果有效)；以质控检测孔FAM信号Ct值作为上样量质控标准(9<Ct_质控≤18，Ct_质控≤9，说明加入的基因组DNA浓度过高，应稀释后重新检测该样本；Ct_质控>18或无扩增曲线，说明加入的基因组DNA浓度过低或存在降解，建议重新提取该样本基因组DNA后进行检测)；以待测样本突变检测孔与质控检测孔FAM信号的△Ct值(△Ct＝Ct_检测-Ct_质控)作为阴阳性判定标准(△Ct≤11.1为阳性，△Ct>11.1为阴性)。

7、用本发明的人类PDGFRA基因D842V突变检测试剂盒进行性能分析实验。

每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。图1为IC检测结果，Ct_质控≤25，符合要求；图2为NTC检测结果，反应体系1～2FAM均不起线，符合要求；图3为STD检测结果，反应体系1～2FAM信号均起线且Ct≤20，符合要求。

(1)灵敏度实验

将以现有基因工程技术合成的含有PDGFRA基因D842V突变序列的质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。取1×10³拷贝/μL突变质粒DNA分别进行10倍稀释，稀释2个梯度，然后以3种浓度梯度(1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL)的突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图4)。由图4可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高，10拷贝/μL突变基因即可检出。

(2)精密度实验

将以现有基因工程技术合成的含有PDGFRA基因D842V突变序列的质粒DNA干粉用TE(10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。以5×10¹拷贝/μL突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图5)。由图5可见本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(20次重复实验结果稳定，CV<5％)。

实施例2

用本发明中人类PDGFRA基因D842V突变检测试剂盒来检测临床采集的组织样本。

本实施例中收集临床病理诊断为胃肠道间质瘤(GIST)的患者石蜡包埋组织样本，并从中提取基因组DNA。用人类PDGFRA基因D842V突变检测试剂盒检测待测样本中是否存在PDGFRA基因D842V突变。具体步骤如下：

(1)样本基因组DNA提取

石蜡包埋组织样本的提取使用QIAampDNAFFPETissueKit(CatNo.56404)，按说明书提取待测样本基因组DNA，将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。将符合要求的基因组DNA用TE(10mmol/L，PH8.0)稀释到2～10ng/μL作为PCR模板，进行实时荧光PCR扩增反应。

(2)实时荧光PCR扩增反应

实时荧光PCR扩增反应条件见表7，按照人类PDGFRA基因D842V突变检测试剂盒说明书进行样本检测。

(3)结果判定

根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值Ct≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值Ct≤20，体系性能良好，结果有效)；以待测样本突变检测孔和外控检测孔FAM信号△Ct值(△Ct＝Ct_检测-Ct_质控)作为阴阳性判定标准(△Ct≤1.1为阳性，△Ct>11.1为阴性)。

图6中，Ct_质控＝12.3，符合要求；突变检测孔FAM信号均未起线，显示样本检测结果为阴性。

图7中，Ct_质控＝12.0，符合要求；PM1突变检测孔FAM信号起线，且Ct_质控(PM1)＝17.9，△Ct＝5.9，显示样本检测结果为PM1(D842V)阳性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

SEQUENCELISTING

<110>武汉海吉力生物科技有限公司

<120>用于检测人类pdgfra基因d842v突变的引物、探针及试剂盒

<130>

<160>10

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ctgtgactttgtcctgtccagaat24

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

agcctgaccagtgagggaagt21

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctatgtgtcgaaaggc16

<210>4

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggccagagacatc13

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtgggtggaaaggtctggataa22

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gtggagcaccgccatgaa18

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctgtgctgttccgca15

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tcgtaaggaatcaaatgctggag23

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

caacgggtttactaataggatgcc24

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tcgataccacagtccttgcaactcccc27

Claims

1.用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，其特征在于，核苷酸序列如下：

突变上游ARMS引物PM1-F：SEQIDNO:1，

突变下游引物PW1-R：SEQIDNO:2，

检测探针PW1-P：SEQIDNO:3，

阻断探针PW1-B：SEQIDNO:4；

2.根据权利要求1所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。

3.用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针。

4.根据权利要求3所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：

外控上游引物PR-F：SEQIDNO:5，

外控下游引物PR-R：SEQIDNO:6，

5.根据权利要求4所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：

内控上游引物IC-F：SEQIDNO:8，

内控下游引物IC-R：SEQIDNO:9，

6.根据权利要求5所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有发生2525A>T碱基变化的PDGFRA基因片段>gi|568815594:54285801-54286200的阳性质粒，含有PDGFRA基因保守序列>gi|568815594:54288901-54289300段碱基的外控质粒，含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒；内控品为含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。

7.根据权利要求5所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的反应体系分为两种：

8.权利要求7所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，提取待检样品的基因组DNA，分别加入到检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果：

9.根据权利要求8所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，荧光定量PCR反应的条件为：

95℃10min；

92℃15sec，58℃1min，共15个循环；

92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。