CN105462996A - 基于基因沉默技术的舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体是一种基于基因沉默技术的舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因及其基因片段以及该基因片段的dsRNA与dsRNA在影响害虫发育过程中的应用。本发明根据舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因<i>Ld</i>Cda1获得了基因片段<i>Ld</i>Cda2，以及该基因片段<i>Ld</i>Cda2的dsRNA，利用dsRNA能够使昆虫因变态过程中受阻而发育迟缓，有望减少农药的大量使用，保护环境，降低生产成本，提高经济收益，具有市场应用前景，为安全无公害的害虫防治方法的研制提供了新途径。

Description

基于基因沉默技术的舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体是一种基于基因沉默技术的舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因及其基因片段以及该基因片段的dsRNA与dsRNA在影响害虫发育过程中的应用。
背景技术
在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致昆虫对多种农药产生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。另外舞毒蛾还会影响人类健康，当人们直接接触舞毒蛾时，常会发生红肿发痒现象，严重者甚至产生皮疹。因此，在农业生产实践中，急需化学农药之外的替代防治手段。
RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA介导的基因沉默现象，双链RNA最终被加工大小约为22nt的小RNA(siRNA)，通过序列配对的方式与蛋白编码基因结合，根据序列配对的程度降解靶标基因mRNA或抑制基因的蛋白翻译过程。RNAi广泛地存在于真菌、植物和动物中。2006年AndreFire和CraigMello因发现RNAi现象被授予诺贝尔医学与生理奖。
在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。因此，从理论上而言，如果利用RNA干扰技术将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从而达到控制害虫的目的。
几丁质降解和代谢是昆虫等节肢动物体内特有的生物学现象，由于人类和其他高等动物体内不含几丁质，因此昆虫几丁质降解系统已被公认为新型杀虫剂作用的靶标。几丁质脱乙酰基酶在昆虫几丁质的降解过程中起着关键作用，采用RNA干扰技术，开展几丁质脱乙酰基酶dsRNA在害虫防治中的应用具有重要意义。
发明内容
本发明旨在提供一种基于基因沉默技术的舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因及其基因片段以及该基因片段的dsRNA与dsRNA在影响害虫发育过程中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因LdCda1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述LdCda1基因是从舞毒蛾转录组数据库中筛选出的，其长度为1134bp，编码378个氨基酸。
另外，本发明提供了一种舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
进一步，本发明提供了上述舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2的合成方法，其步骤为：根据所述LdCda1的核苷酸序列，以序列SEQIDNO.3为上游引物、序列SEQIDNO.4为下游引物，将LdCda1的重组pEASY-T1质粒做为模板，PCR扩增获得LdCda2。
然后，本发明进一步利用相关试剂盒合成dsRNA，并且提供了该dsRNA影响害虫发育过程中的应用：注射dsRNA到舞毒蛾体腔。结果表明：dsRNA可以特异性的沉默几丁质脱乙酰基酶基因的mRNA表达，舞毒蛾生长发育延缓。
本发明根据舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因LdCda1获得了基因片段LdCda2，以及该基因片段LdCda2的dsRNA，利用dsRNA能够能够使昆虫因变态过程中受阻而发育迟缓，有望减少农药的大量使用，保护环境，降低生产成本，提高经济收益，具有市场应用前景，为安全无公害的害虫防治方法的研制提供了新途径。
附图说明
图1为采用实时荧光定量PCR方法研究蛹期舞毒蛾幼虫注射dsRNA后LdCda1的相对表达量。图中：1表示对照组的蛹；2表示注射LdCda1的dsRNA的蛹。
具体实施方式
实施例1：舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2的获得
根据从舞毒蛾转录组数据库中获得的舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因LdCda1的核苷酸序列，采用primerpremier5.0软件设计特异性的引物，上游引物序列为SEQIDNO.3，下游引物序列为SEQIDNO.4，所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。将成功获得的舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因LdCda1的重组pEASY-T1质粒做为模板，PCR扩增获得舞毒蛾几丁质酶基因片段LdCda2，使用MicroEluteCyclePureKit（OMEGA）试剂盒进行纯化。
实施例2：舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2的dsRNA的获得
用实施例1获得的几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2，按照T7RiboMAX?ExpressRNAiSystem（Promega）试剂盒说明书，体外转录合成dsRNA。得到的dsRNA用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测其单一性，用酶标仪（ThermoScientificMultiskanGO，ThermoFisherScientific，USA）检测其浓度，并浓缩至终浓度1μg/μl保存至-80℃备用。
实施例3：舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2的dsRNA的舞毒蛾实验
1）舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2的dsRNA注射
选取蛹期幼虫用于注射上述合成的dsRNA。5ul规格的微量注射器用于注射，注射时不可用力过大，侧腹部作为注射点，注意避开气门。注射dsRNA的量为5μg，并设置注射等量的DEPC处理的水的对照组，实验组和对照组各20头。注射完毕后，将幼虫放置于生化培养箱中用购自中国林科院森林生态环境与保护研究所业进行饲养（光照：黑暗时间=16h：8h，温度26±1℃，湿度70%）。
2）注入dsRNA后舞毒蛾表型的观察
幼虫注射完毕后继续饲养，并及时地观察。
3）注入dsRNA后舞毒蛾发育过程的观察
注射dsRNA的舞毒蛾实验组蛹期幼虫蜕变为舞毒蛾成虫的过程被延缓，通过使用实时荧光定量PCR方法研究表明注射dsRNA的舞毒蛾实验组蛹期幼虫体内几丁质脱乙酰基酶基因的相对表达量明显降低。
<110>太原理工大学
<120>基于基因沉默技术的舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>1134
<212>DNA
<213>舞毒蛾
<222>（1）…（1134）
<400>1
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<210>2
<211>205
<212>DNA
<213>舞毒蛾
<222>（1）…（205）
<400>2
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<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
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<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
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Claims (5)

1.舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因LdCda1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.权利要求2所述舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2的合成方法，其特征在于，其步骤为：根据权利要求1所述LdCda1的核苷酸序列，以序列SEQIDNO.3为上游引物、序列SEQIDNO.4为下游引物，将LdCda1的重组pEASY-T1质粒做为模板，PCR扩增获得LdCda2。
4.权利要求2所述舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2的dsRNA。
5.权利要求4所述舞毒蛾几丁质脱乙酰基酶基因片段LdCda2的dsRNA在影响害虫发育过程中的应用。
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