CN105461716B - Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用 - Google Patents

Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105461716B
CN105461716B CN201510930297.6A CN201510930297A CN105461716B CN 105461716 B CN105461716 B CN 105461716B CN 201510930297 A CN201510930297 A CN 201510930297A CN 105461716 B CN105461716 B CN 105461716B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
synthesis
compounds
isomers
optical isomer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510930297.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105461716A (zh
Inventor
汪清民
尹芝南
王兹稳
洪章勇
刘玉秀
温倜
宋红健
郑彦龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nankai University
Original Assignee
Nankai University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nankai University filed Critical Nankai University
Priority to CN201510930297.6A priority Critical patent/CN105461716B/zh
Publication of CN105461716A publication Critical patent/CN105461716A/zh
Priority to PCT/CN2016/109174 priority patent/WO2017097251A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105461716B publication Critical patent/CN105461716B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/41—Preparation of salts of carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/235—Saturated compounds containing more than one carboxyl group
    • C07C59/245—Saturated compounds containing more than one carboxyl group containing hydroxy or O-metal groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及简称为NK007的两个光学纯异构体及其合成以及它们在抗植物病毒和调节免疫活性方面的应用。本发明中化合物NK007‑1和NK007‑2具有很好的抗烟草花叶病毒活性，能够用于治疗植物病毒病害。本发明中化合物NK007‑1和NK007‑2具有很好的调节免疫活性，能够用于制备治疗风湿性关节炎的药物。本发明测试化合物调节免疫活性的方法，能够用于新型关节炎药物的筛选。

Description

NK007的两个光学纯异构体及其合成和应用
技术领域
本发明涉及简称为NK007的两个光学纯异构体及其合成以及它们在抗植物病毒和调节免疫活性方面的应用。
背景技术
简称为NK007的化合物结构式为：
手性是生命过程的基本特征，作为生命活动重要基础的大分子.如核酸、蛋白质、多糖等均具有手性：当一个手性药物进入生命体时，它的两个对映异构体通常会表现出不同的生物活性。以前由于对此缺乏认识，人类曾经有过惨痛的教训。例如德国一家制药公司在上世纪五十年代开发的一种治疗孕妇早期不适的药物—反应停，药效很好，但很快发现服用了反应停的孕妇生出的婴儿很多是四肢残缺。后来发现反应停中一种构型有致畸作用，另一种构型无致畸作用，因此研究手性药物的对映体进入生物体内的手性环境及其药效学，药动学和毒理学方面均存在对映体选择性作用，对临床合理使用手性药物和开发研制单一异构体的新药具有深远的重要意义。手性药物的生物活性选择性大致分为以下几种情况：1、一种异构体有显著的治疗作用，另一种异构体无或有很弱的作用：萘普生是临床上常用的一种抗炎和解热镇痛药，目前主要以S(+)异构体上市，其S(+)异构体的抗炎和解热镇痛活性约为R(-)异构体的10倍～20倍，因此其R(-)异构体可认为是非活性体，需要先进行拆分；2、一种异构体有治疗作用，另一种异构体有副作用：L-肉毒碱是从肉中发现的一种氨基酸，它在人体能量的产生，储藏等方面具有重要的作用，是一种效果不错的心血管病人的保健药，由于该成分在肉中含量极低，最早是用外消旋体作为代用品，后来发现D-肉毒碱不但没有作用反而有副作用；3、两种异构体都有治疗作用，但其中一种有副作用：D(-)青酶胺是代谢性疾病和铅，汞等金属中毒的良好治疗剂，其L(+)对映体虽也具有治疗作用，但由于有骨髓损伤，嗅觉和视觉衰退以及过敏反应等严重副作用，故临床只能用D(-)青酶胺；4、一种异构体无治疗作用，但能抵消具有治疗作用的另一种异构体的副作用：茚达立酮是一种具有促尿酸排泄的利尿药，它的右旋体具有利尿作用也有引起尿潴留的副作用，左旋体能抵消右旋体所产生的副作用；5、两种异构体有相反的作用：哌西那朵(Picenadol)是一种阿片受体的激动剂和拮抗剂的独特的麻醉镇痛药，它的右旋体是阿片受体的激动剂，活性与吗啡相当，而左旋体却是阿片受体的拮抗剂，右旋体的激动作用比左旋体的拮抗作用要强，外消旋体为激动剂。
在农药领域，当今世界使用的商品化农药，大约有25％含有手性中心(PesticideScience,1996,46:3–9；董慧芬.[硕士研究生学位论文].浙江大学.2013)。在中国，由于拟除虫菊酯、有机磷等具有手性结构农药的大量使用，这一比例估计超过40％(Chirality,2009,21:421–427)。在20世纪90年代以前，手性农药被当做单一化合物来研究。现在大量研究表明，手性农药的生物活性显现出显著的立体特异性，而且活性物质往往存在于一个或几个异构体中。同时，由于参与代谢的糖类、蛋白质等大分子均具有高度的立体专一性，所以说手性化合物进入生物体后，其利用度、代谢等均有较大的差异(ToxicologicalSciences,2009,110:4–30)。
农药是国家农业和国民经济的重要支柱，中国的农药化学行业不断开发出新型的具有各种生物活性的化合物，旨在开发出具备高利用率、高选择性和高活性的新型农药。进入新世纪以来，国家越来越重视环境保护，更加提倡绿色化学和绿色农药，这就给农药化学家提出来一个问题。研究和开发手性农药是绿色农药发展的一条新路径(周珊珊.[博士研究生学位论文].浙江大学.2009),因为每个对映体都有系统的熔点、沸点和溶解度等相似的特征，但是在生物学行为上却有不同的效应(刘一平.[硕士研究生学位论文].湖南农业大学.2011)。单一手性的农药立体选择性主要体现在对靶标生物的活性和对非靶标生物所造成的不利影响。同时，使用单一对映体的农药将会降低农药在环境中的残留浓度，以及改变异构体的残留组成等，进而减轻对环境的压力(生态环境,2008,17:1268–1275)。
前期工作中，我们课题组从娃儿藤碱的衍生物中优化出了高效的植物病毒病防治药剂NK007(CN101875657A)。其具有新颖的骨架结构，很好的治疗效果，光稳定性好，水溶性好和化学合成简单等优点。后续研究我们还发现NK007还具有良好的抗癌活性(CN102002041A)和抗炎活性(CN101948470A)。但是，NK007为外消旋体，有四个光学异构体，NK007的这四个光学异构体作为新化合物有关它们的抗植物病毒及调节免疫活性还没有报道。
前期工作中我们报道了NK007的制备(王开亮，菲并吲哚里西啶生物碱及其衍生物的合成与生物活性研究，博士研究生学位论文，南开大学化学学院，2009)，如图1所示。
但由菲甲酸5到菲苄醇6的合成以及由10到11的合成过程中都用到了四氢铝锂，成本高，且在工业化大量生产中有爆炸隐患。由8到9的过程中用到了草酰氯挥发性强，操作时气味很大，污染环境，而且增加了运输和储存成本。
发明内容
本发明的NK007的两个光学纯异构体是具有如下所示两个结构的NK007-1和NK007-2：
如图2所示为光学异构体的制备方法路线，其中，使用L-苹果酸时得到的产物为NK007-1，使用D-苹果酸时，得到的产物为NK007-2。
所述的化合物5与硼氢化钠的摩尔比为1:1～1:2，化合物5与氯化锆的摩尔比为1:1～1:2。
所述的化合物8a与固体光气的物质的量比例为1:1～3:1。
所述的化合物10a与硼氢化钠的物质的量比例为1:1～1:3，化合物10a与氯化锆的物质的量比例为1:1～1:2。
所述的光学异构体在防治烟草花叶病毒(TMV)病害中的应用。
所述的光学异构体在制备调节免疫活性药物中的应用。
上述药物制备成丸剂、胶囊剂、片剂或注射剂。
所述的光学异构体调节免疫活性的测试方法，该方法用于调节免疫活性药物的筛选。
本发明对图1所示路线进行改进。如图2所示通过条件筛选发现廉价的硼氢化钠--四氯化锆体系室温条件下就能实现由菲甲酸5到菲苄醇6以及由10a到11a的转化，大大降低了生产成本。我们以固体光气代替草酰氯实现了由8a到9a的转化降低了运输成本。同时，经条件尝试我们发现，在室温条件下以甲醇和二氯甲烷做溶剂就能很好的实现由光学纯的生物碱11a到NK007两种异构体化合物NK007-1和NK007-2的转化。
本发明中化合物NK007-1和NK007-2具有很好的抗烟草花叶病毒活性，能够用于治疗植物病毒病害。本发明中化合物NK007-1和NK007-2具有很好的调节免疫活性，能够用于制备治疗风湿性关节炎的药物。本发明测试化合物调节免疫活性的方法，能够用于新型关节炎药物的筛选。
附图说明
图1是NK007的合成；
图2是NK007-1和NK007-2的合成；
图3是菲苄醇6的合成；
图4是化合物9a的合成；
图5是化合物11a的合成；
图6是由化合物11a合成NK007-1和NK007-2
图7是脾细胞与空白对照、NK007及其光学异构体在1000ng/mL的LPS溶液中保持24小时；TNF-α通过ELISA法测定；
图8是1000ng/mL的LPS引发的脾细胞与100nM的空白对照、NK007及其光学异构体溶液保持24小时；TNF-α通过ELISA法测定；
图9是在脾细胞测定条件下，NK007及其光学异构体抑制活性对比；
图10是BALB/c小鼠脾细胞用不同剂量的LPS处理并保持24小时；TNF-α通过ELISA法测定；
图11是LPS滴定.RAW264.7与不同剂量的LPS共同孵育2h，然后再与Golgiplug一块孵育4h.测定TNF-α；
图12是RAW264.7与空白对照和100nM的NK007及其光学异构体、CN0004、CN0005共同孵育2h，然后再与Golgiplug和10ng/mL的LPS一块孵育4h.测定TNF-α；
图13是RAW264.7与空白对照和100nM的NK007及其光学异构体、CN0004、CN0005共同孵育2h，然后再与Golgiplug一块孵育6h.测定TNF-α；
图14是RAW264.7细胞的TNF-α荧光表达。
具体实施方式
下述实施例用于进一步说明本专利但不意味着限制本专利
实施例1：化合物6,9a,11a及化合物NK007-1、化合物NK007-2的合成
化合物6(如图3所示)
N2保护下，在250mL反应瓶中加入150mL新蒸无水THF，室温下分批加入1.14克(0.03mol)NaBH4，电磁搅拌下分批加入6.84克(0.02mol)原料5，搅拌10分钟，缓慢加入四氯化锆6.99克(0.03mol)，室温搅拌10小时，TLC检测原料反应完全。冰水浴冷却下滴加10mL水和10mL稀盐酸充分分解过量NaBH4，脱溶后用250mL CH2Cl2和50mL水稀释，搅拌分液，有机相经水洗，饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，脱溶得白色固体产品6.46克，收率95％。熔点181-183℃；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.81(s,1H),7.75(s,1H),7.56(s,1H),7.54(s,1H),7.18(s,1H),5.11(s,2H),4.13(s,3H),4.12(s,3H),4.06(s,3H),4.02(s,3H).
化合物9a(如图4所示)
在250mL反应瓶中，N2氛围中加入0.27克(0.9mmol)固体光气,20mL无水CH2Cl2，缓慢滴加1.1克(2.5mmol)上述所得酸8a和三乙胺0.28克(2.8mmol)的100mL无水CH2Cl2，溶液，混合物室温搅拌2小时，升温至回流8h，并在回流条件下缓慢滴加1.25mL(5.2mmol)无水SnCl4的20mL CH2Cl2溶液，滴毕，继续回流反应6h。冷却，慢慢加入15mL 1N盐酸，搅拌，分液，有机相经水，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，脱溶后经快速减压柱层析得亮黄色固体，收率96％，熔点224-227℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.09(s,1H),7.77(s,1H),7.75(s,1H),7.27(s,1H),5.71(d,J＝18.0Hz,1H),4.68(d,J＝18.0Hz,1H),4.44–4.40(m,1H),4.16(s,3H),4.12(s,3H),4.09(s,3H),4.08(s,3H),2.64–2.56(m,4H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ195.6,174.0,151.8,149.8,149.2,149.0,137.2,127.9,124.5,123.2,121.8,121.5,107.6,104.1,102.9,102.4,61.0,56.1,56.0,55.9,55.8,40.7,30.1,20.8.
化合物11a(如图5所示)
在100mL反应瓶中加入50mL无水THF，室温N2保护下一次加入0.08克(2mmol)NaBH4，0.41克(1mmol)原料10a，混合物搅拌10min，缓慢加入四氯化锆0.23克(1mmol)，室温搅拌反应24h，TLC检测原料反应完全。冰水冷却，用20mL水分解，再加入50mL CH2Cl2搅拌，硅藻土过滤，CH2Cl2洗涤，分液，有机相再经饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，脱溶得淡黄色固体产品，收率93％，经手性HPLC测试ee值99％(测试条件：AD-H柱，流动相比例：正己烷：异丙醇＝75：25，外加0.1％的Et3N，紫外吸收波长254nm，流速：1.0mL/min)；熔点272℃ dec；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.83(s,1H),7.82(s,1H),7.31(s,1H),7.15(s,1H),4.63(d,J＝14.4Hz,1H),4.12(s,6H),4.06(s,3H),4.05(s,3H),3.67(d,J＝14.4Hz,1H),3.50–3.46(m,1H),3.39–3.34(m,1H),2.94–2.89(m,1H),2.52–2.46(m,2H),2.29–2.21(m,1H),2.08–2.01(m,1H),1.95–1.90(m,1H),1.81–1.74(m,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ148.7,148.5,148.4,126.3,125.9,124.4,123.6,123.4,104.0,103.5,103.3,103.1,60.2,56.1,55.93,55.89,55.2,54.0,33.8,31.3,21.7.
化合物NK007-1和NK007-2(如图6所示)
于250mL单口瓶中加入1.0mmol苹果酸，分别加入50mL CH2Cl2和50mL CH3OH，室温，缓慢滴加1.0mmol娃儿藤碱的50mL CH2Cl2溶液，滴毕，继续搅拌反应8h，过滤即得相应酸的娃儿藤碱盐衍生物。其中，使用L-苹果酸时得到的产物为NK007-1，使用D-苹果酸时，得到的产物为NK007-2。
化合物NK007-1和NK007-2的理化性质(表1)
表1
实施例2：化合物NK007-1和NK007-2的抗烟草花叶病毒活性(表2)
1、病毒提纯及浓度测定：
病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒SOP规范执行。病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用。
2、化合物溶液配制：
称量后，原药加入DMF溶解，制得1×105μg/mL母液，后用含1‰吐温80水溶液稀释至所需浓度；宁南霉素制剂直接兑水稀释。
3、离体作用：
摩擦接种珊西烟适龄叶片，用流水冲洗，病毒浓度10μg/mL。收干后剪下，沿叶中脉对剖，左右半叶分别浸于1‰吐温水及药剂中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养，每3片叶为1次重复，重复3次。3d后记录病斑数，计算防效。
4、活体保护作用：
选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。24h后，叶面撒布金刚砂(500目)，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10μg/mL，接种后用流水冲洗。3d后记录病斑数，计算防效。
5、活体治疗作用：
选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/mL，接种后用流水冲洗。叶面收干后，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。3d后记录病斑数，计算防效。
6、活体钝化作用：
选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，将药剂与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20μg/mL，接种后即用流水冲洗，重复3次，设1‰吐温80水溶液对照。3d后数病斑数，计算结果。
抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％
表2
通过对两个光学纯的NK-007异构体抗烟草花叶病毒试验数据可知：
(S)-娃儿藤碱与L-苹果酸形成的盐NK007-1的活性比与D-苹果酸形成的盐NK007-2活性高。
测试结果显示，化合物NK007-1和NK007-2活性显著，明显高于NK007。
实施例3：化合物NK007-1和NK007-2的调节免疫活性
测试方法
材料：手术剪2把，眼科镊2把，玻片，96孔板(corning公司)，移液器，40μm cellstrainer，15mL离心管(BD公司)，EP管，计数板，显微镜，离心机，排枪，Babl/c小鼠(维通利华)。试剂：PBS(北京索莱宝公司)，RPMI-1640培养基和DMEM培养基(Gibco公司)，血清(Gibco公司)，红细胞裂解液(北京索莱宝公司)，LPS(sigma公司)；台盼蓝。双抗(碧云天公司)(一)光学异构体对LPS刺激脾细胞产生TNF-α的影响
操作步骤：
1)各种溶液的配置：NK007光学异构体母液为1mM；
LPS：1mg/mL；
完全培养基：1640+10％血清+1％双抗。
2)脾细胞悬液的制备：
1、杀鼠消毒，取脾置于10mL的PBS液中，冰浴。
2、专用玻片磨脾脏，约5*107个细胞(培养皿中加PBS进行)。
3、移液至离心管，离心(4度，1400rpm,7min)。
4、弃上清，加入红细胞裂解液2-3mL，吹打混匀，室温裂解小于5分钟。
5、再稀释至10mL(PBS/1640液)，过滤过筛。
6、再次离心，(4度，1400rpm,7min)，后加带血清的培养液至10mL(10％FBS的1640)。
7、取100μL细胞悬液至900μL PBS中(稀释10倍)混匀，取其中10μL加10μL台盼兰计数。
8、计数：细胞浓度：p＝N/2(对角区的细胞个数)*10(稀释十倍)*104(系数)*2(2倍稀释)个/mL。
9、铺板浓度需：2*106个/mL,则计算需加培养液体积V＝(N*105)*10mL/2*106mL。
10、在总加样体积的细胞悬液中，加入LPS使其终浓度为50ng/mL。
11、铺板，加筛选化合物培养24h。
药物稀释流程
取200μM母液(DMSO)，解冻，充分混匀
取20μL 200μM母液(DMSO)，加1980μL细胞培养液(1640+10％血清+B-巯基乙醇+双抗)，充分混匀得到终浓度2μM的A
取100μL A，+900μL细胞培养液，得终浓度200nM的B
取100μL B，+900μL细胞培养液，得终浓度20nM的C
取100μL C，+900μL细胞培养液，得终浓度2nM的D
做终浓度100nM时，100μL细胞+100μL A
做终浓度10nM时，100μL细胞+100μL B
做终浓度1nM时，100μL细胞+100μL C
做终浓度0.1nM时，100μL细胞+100μL D
3)ELISA检测细胞因子
用Biolegend Mouse TNF-αELISA试剂盒。首先将溶解于包被缓冲液(coatingbuffer)中的特异性包被抗体(capture antibody)包被在固相载体上，密封后置于4℃冰箱中过夜，洗涤液(wash buffer)，即PBST，洗涤除去没有结合的抗体和杂质；加入封闭液(assay diluent)，可以阻断非特异性的结合，进而减少背景，置于20℃摇床中1小时，摇床转速200r/min。PBST洗涤除去上一步的多余物质。加入待测上清和梯度稀释的标准品，标准品依次浓度为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.2pg/mL、15.6pg/mL和7.8pg/mL，置于20℃摇床中2小时，摇床转速200r/min。此步可使抗体与抗原充分结合。PBST洗涤除去未结合的物质。加入检测抗体(detection antibody)，特异性结合抗原，置于20℃摇床中1小时，摇床转速200r/min。洗涤未结合的物质。加入酶标抗体(Avidin-HRP)，酶标抗体可与检测抗体结合，置于20℃摇床中30分钟，摇床转速200r/min。PBST洗涤未结合的物质。加入新鲜制备的底物(TMB Substrate Solution)，避光下置于20℃摇床15分钟，摇床转速200r/min。此时溶液会显现出蓝色。用终止反应液(Stop Solution)终止反应，溶液由蓝色变为黄色。酶联免疫检测仪470nm处测量各孔的吸光值。
化合物对TNF-α的抑制率按照如下公式计算:TNF-α抑制率(％)＝(对照组concentration–药物concentration)/对照组concentration×100％。
(一)光学异构体对LPS刺激RAW264.7细胞产生TNF-α的影响
1)Raw 264.7细胞系的培养
液氮中取出细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻，然后1000rpm/min,离心5min。换弃上清，加入预热的完全培养基，置于5％CO2，37℃培养箱中培养过夜。第二天更换培养基。继续培养至细胞铺满皿底。传代培养2-3次。
2)药物与细胞孵育
取对数期的细胞，调至细胞浓度为2×106/mL。取500μL细胞悬液加入24空板中，然后加入药物终浓度为(100nM，10nM，1nM),37℃培养箱孵育2h。2h后，加入500μL培养基(含有LPS,Golgiplug，药物)继续培养4h。
3)胞内染色
1)收集培养后的细胞置流式管中，1000rpm/min离心5min，弃上清。
2)加入1mL 2％的甲醛固定30min。
3)PBS洗涤2次。
4)加入1mL 0.5％sapomin打孔30min。
5)0.5％sapomin洗涤。
6)每管加入100μL Alex488-TNF-α(1:200稀释)荧光抗体染色30min。
7)0.5％sapomin洗涤1次。
8)PBS洗涤1次。
9)上机检测。
测定结果(见图7-14)
由图7-10的数据可以看出，NK007-1和NK007-2比NK007抑制TNF-α的效率高。
由图11-14的数据可以得出如下结论：药物作用2h后，加入LPS(10ng/mL)和Golgiplug继续孵育4小时，NK007-2抑制LPS刺激的RAW264.7产生TNF-α效率较高；药物和LPS(10ng/mL)作用2小时后，加入Golgi plug继续孵育6小时，NK007-2抑制TNF-α产生的细胞比例和平均荧光强度比其它化合物低。
由表7-14的数据可以看出，NK-007两个光学异构体NK007-1和NK007-2调节免疫活性明显优于NK007。

Claims (5)

1.一类光学异构体，其结构为如下的两个光学纯异构体化合物NK007-1和NK007-2：
2.一种如权利要求1所述光学异构体的制备方法，路线为：
其中，使用L-苹果酸时得到的产物为NK007-1，使用D-苹果酸时，得到的产物为NK007-2，其特征在于，使用固体光气使化合物8a酰氯化。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，化合物8a与固体光气的物质的量比例为1:1～3:1。
4.权利要求1所述的光学异构体在防治烟草花叶病毒(TMV)病害中的应用。
5.权利要求1所述的光学异构体在制备调节免疫活性药物中的应用。
CN201510930297.6A 2015-12-11 2015-12-11 Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用 Active CN105461716B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510930297.6A CN105461716B (zh) 2015-12-11 2015-12-11 Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用
PCT/CN2016/109174 WO2017097251A1 (zh) 2015-12-11 2016-12-09 Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510930297.6A CN105461716B (zh) 2015-12-11 2015-12-11 Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105461716A CN105461716A (zh) 2016-04-06
CN105461716B true CN105461716B (zh) 2017-03-22

Family

ID=55599930

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510930297.6A Active CN105461716B (zh) 2015-12-11 2015-12-11 Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN105461716B (zh)
WO (1) WO2017097251A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105461716B (zh) * 2015-12-11 2017-03-22 南开大学 Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101875657A (zh) * 2009-04-29 2010-11-03 南开大学 娃儿藤碱类生物碱有机酸盐衍生物在农药上的应用
CN101948470A (zh) * 2010-05-28 2011-01-19 南开大学 菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物在医药上的应用
CN105461716B (zh) * 2015-12-11 2017-03-22 南开大学 Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105461716A (zh) 2016-04-06
WO2017097251A1 (zh) 2017-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107286162B (zh) 杂环苦参碱衍生物及其制备方法和应用
CN103951566B (zh) 一种N-烃基-1,2,3,4,5,6-六氢-1,1,5,5-四甲基-7H-2,4α-桥亚甲基萘-7-胺类化合物及其合成方法和应用
Sever et al. Biological evaluation of a series of benzothiazole derivatives as mosquitocidal agents
Thant et al. Antidiabetes and Antioxidant agents from Clausena excavata root as medicinal plant of Myanmar
CN105461716B (zh) Nk007的两个光学纯异构体及其合成和应用
CN111138443A (zh) 一种4’-去甲基表鬼臼毒素全合成的制备方法
CN110845466B (zh) 氧杂环壬二烯衍生物、其药物组合物、其制备方法及用途
CN104817472B (zh) 一种新型棉酚衍生物及其制备方法和抗肿瘤应用
CN102093460B (zh) 三萜皂苷化合物、其合成方法及其应用
CN105294639B (zh) 一种不对称环丁烷衍生物及其制备方法和应用
CN101857889B (zh) 一种生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸的方法及菌株
CN105078987A (zh) 组合物38083001030527及其在抗急性痛风药物中的应用
CN101293889A (zh) 水溶性青蒿素衍生物及其制备方法
CN103724324A (zh) 一种类吡虫啉衍生物及其制备方法
CN102391204B (zh) 手性2,4-二取代-噻唑酮类化合物及其制备和在制备抗癌药物中的应用
CN105343043A (zh) 一种组合物及其在抗急性痛风药物中的应用
CN111072606B (zh) 一种八氢苯并呋喃衍生物、其制备及应用
CN105646398B (zh) N-((1r,4r)-4-(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)环己基)乙酰胺的制备方法
CN104326919B (zh) 化合物2‑羟基‑3‑氟‑5‑硝基‑1‑苯基丁酮及其制备方法和农用生物活性
CN108997149A (zh) 一种芳基取代的脱氢枞胺衍生物及其制备方法和应用
van Wyk et al. Transformations of manool. Tri-and tetracyclic norditerpenoids with in vitro activity against plasmodium falciparum
CN107955014B (zh) 萘并呋喃酮类化合物及制备与在制备抗肿瘤药物中的应用
CN102039060A (zh) 手性分离色谱柱
CN106928249A (zh) 一种简便、高效的青蒿砜—氨基二硫代甲酸酯类化合物的制备方法
CN104557844B (zh) 一种独一味素a的衍生物、制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant