CN105441467B

CN105441467B - 一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及其应用

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Publication number: CN105441467B
Application number: CN201510901096.3A
Authority: CN
Inventors: 张作明; 李海超; 张静; 李正强; 于擎
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2035-12-09
Also published as: CN105441467A

Abstract

一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及其应用，属于生物工程技术领域。该工程菌的保藏编号为CGMCC No.11460，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年9月29日。本发明主要公开嗜热碱性果胶裂解酶，最适反应温度为70℃，最适Ca²⁺浓度为0.8mM，底物为0.2％(w/v)多聚半乳糖醛酸，pH 9.5。该酶在最适pH 9.5、Ca²⁺0.8mM、70℃时酶比活为900U/mg；在70℃保温下，半衰期为6h；经过镍柱纯化处理后CbPelC可达到50mg/L(1L发酵液)。本发明所述嗜热碱性果胶裂解酶的耐热性和产量有大幅度挺高，更加适应现代工业生产要求，也为工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。

Description

一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及该酶在降解果胶物质中的应用。

背景技术

果胶物质主要由多聚半乳糖醛酸(GalA)组成，并且侧链还常带有海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖等，广泛存在于植物初生细胞壁中。

果胶酶是一系列分解果胶物质的酶类的总称，在高等植物和微生物中分布甚广。植物在成熟过程中，果胶酶使植物细胞壁更松软，对植物组织腐败再生平衡也起到了重要作用。果胶酶按其作用方式的不同可分为两大类，即酯酶和解聚酶，而解聚酶又分为水解酶和裂解酶。水解酶是通过引入水分子水解糖苷键，而裂解酶是通过反式消去作用断裂糖苷键。

果胶裂解酶是果胶酶的重要组成部分，是一种能降解植物细胞壁并导致植物组织软化甚至死亡的解聚酶，它在果胶降解过程中起着重要的作用。其作用机制是通过β-消旋的方式作用于断裂糖苷键，形成不饱和双键，产生不饱和的半乳糖醛酸寡聚糖。果胶裂解酶也是麻料脱胶工艺和纺织工艺中不可缺少的主要酶类。在医药、生物技术、饲料加工、环保方面也具有相当地位，在木材防腐和造纸等方面也应用广泛。

目前果胶裂解酶主要以碱性酶为主，而且大多是常温酶，嗜热酶较少，迄今为止，关于嗜热纤维素酶的报道很多，而关于嗜热果胶酶的报道很少。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种Caldicellulosiruptor bescii基因来源的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌以及构建方法，所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌Escherichia coliBL21(DE3)/pET20b(+)-PelC，其保藏编号为CGMCC No.11460，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏日期为2015年9月29日。

工程菌表达产物是细胞可溶性蛋白，通过细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋白，进行分离纯化得到嗜热蛋白，即嗜热碱性果胶裂解酶。

本发明制备的嗜热碱性果胶裂解酶的产量可达到50mg/L(1L发酵液)，相对现有国内筛选到的碱性果胶酶，是一种效价很高的碱性果胶酶，为进一步实现工业化铺垫，也为工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。

本发明所述的嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌以源于热梭杆菌Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的基因为模板，设计引物，通过PCR反应扩增3’端含有6个组氨酸标签的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，测序谱图如图1所示。将该嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC连接到表达载体pET20b(+)上获得重组表达载体，将该重组表达载体转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到嗜热碱性果胶裂解酶工程菌。

本发明所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌的构建方法参见文献：Overproductionof alkaline polygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach.2011，Shuying Fang，Jianghua Li，Long Liu，Guocheng Du，Jian Chen.Volume 102，Issue 22，November 2011，Pages 10671–10678。具体步骤如下：

(1)以热梭杆菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725全基因组DNA为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到3’端含有6个组氨酸标签基因的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因；

(2)将步骤(1)得到的嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC酶切后与pET20b(+)表达载体连接，得到重组表达载体pET20b(+)-PelC；

(3)将重组表达载体pET20b(+)-pelC转化到大肠杆菌表达宿主Escherichia coliBL21(DE3)中，构建得到本发明所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b(+)-PelC。

PCR引物，包括上游引物和下游引物，

上游引物：5'GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC 3'，

下游引物：5'CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG 3'，

上游引物5'端CATATG为NdeⅠ酶切位点，保护碱基GGAATTC；下游引物5'端CTCGAG为XholⅠ酶切位点，保护碱基CCG。

所述的重组表达载体pET20b(+)-PelC是将嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC插入到表达载体pET20b(+)的NdeⅠ和XholⅠ位点间得到。

所述工程菌是将重组表达载体导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)得到的。

本发明的第二个目的是提供一种应用本发明所述的工程菌发酵生产的嗜热碱性果胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。其是将嗜热碱性果胶裂解酶工程菌接种(接种量2‰～5‰(v/v))至装有20mL种子培养基的50mL锥形瓶中，37℃、170r/min振荡培养至OD₆₀₀＝6.0，获得种子液；然后将种子液接种至含有50μg/mL氨苄的发酵培养基中，接菌量为2‰～5‰(v/v)，装液量为2L/5L(2L指的是发酵培养液体积，5L指的是锥形瓶的容积)，于37℃、170r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时加入终浓度0.5mM IPTG进行诱导，同时将温度调整为25～28℃，转速调整为100～120r/min，诱导发酵18～24h，从而得到工程菌发酵液。将细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋白，通过镍柱亲和层析法得到嗜热碱性果胶裂解酶。经过镍柱纯化处理后嗜热碱性果胶裂解酶含量可达到50mg/L(1L发酵液)。

在上述方法中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；培养基的pH值为7.0-7.2；发酵培养基的成份如下：培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；培养基的pH值为7.0～7.2；

本发明的第三个目的是提供所述的嗜热碱性果胶裂解酶在降解果胶物质中的应用。

在本发明应用中，所述果胶物质为多聚半乳糖醛酸。

本发明所述嗜热碱性果胶裂解酶，在70℃降解多聚半乳糖醛酸的酶活为900U/mg；热稳定较好，在70℃保温下，半衰期为6h；最适反应温度为70℃，最适Ca²⁺浓度为0.8mM，底物为0.2％(w/v)pH＝9.5。本发明所提供的工程菌中嗜热碱性果胶裂解酶发酵量比野生菌株Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725有大幅度的提高，更加适应工业化生产需求，为工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。

附图说明

图1为嗜热碱性果胶裂解酶基因测序谱图(分为图1(a)和图1(b)两部分)。

图2为嗜热碱性果胶裂解酶SDS—PAGE蛋白电泳图；其中，1道是Marker，2道透析后溶液中的蛋白。

图3为本发明嗜热碱性果胶裂解酶的最适pH曲线。

图4为本发明嗜热碱性果胶裂解酶的最适反应温度曲线。

图5为本发明嗜热碱性果胶裂解酶的最适Ca²⁺浓度曲线。

图6为本发明嗜热碱性果胶裂解酶的热稳定性曲线。

具体实施方案

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。

下述实施例中所使用的耗材、试剂、仪器，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中蛋白含量的测定使用的仪器为Nano Drop微型分光光度计检测蛋白浓度。

实施例1：嗜热工程菌的构建及酶的表达

(1)引物设计及用PCR方法获取嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC

以热梭杆菌Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的基因组为模板，设计引物，通过PCR方法扩增PelC基因，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1300bp，测序表明，该片段的大小为1305bp，其序列如SEQ ID NO.1所示。

上游引物的序列如下：

上游引物1：

5'GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC 3'

(下划线碱基为NdeⅠ酶切识别序列)；

下游引物的序列如下：

下游引物2:

5'CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG 3'

(下划线碱基为XholⅠ酶切识别序列)。

PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

PCR反应条件：94℃预变性10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存，得到序列表序列所示的DNA片段。将序列表序列的DNA片段，用NdeⅠ和XholⅠ双酶切，与经过NdeⅠ和XholⅠ双酶切的载体pET20b(+)的骨架片段进行过夜连接，获得重组载体pET20b(+)-PelC，经过测序证实，重组载体为在载体pET20b(+)的NdeⅠ和XholⅠ位点间插入序列表序列。

酶切体系如下(20μL)：

pET20b(+)-pelC(pET20b(+)购于EMD Biosciences(Novagen)公司)的构建方法参考文献：Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in recombinantEscherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach.2011，Shuying Fang，Jianghua Li，Long Liu，Guocheng Du，Jian Chen.Volume 102，Issue 22，November 2011，Pages 10671–10678。

(2)制备工程菌

感受态细胞的制备：将E.coli BL21(DE3)在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到LB培养基中。37℃振荡培养。测定OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值达到0.3时(大约培养3-4小时，此为实验成功的关键)。取上述菌体培养液于50mL离心管中，冰上放置10min。4℃离心10min(4000r/min)，倒出培养基，将管口倒置以便培养基流尽。用冰冷(4℃)的0.1mol/L CaCl₂10mL悬浮细胞沉淀，冰上放置30min。4℃离心10min(4000r/min)。倒出上清液，用冰冷的0.1mol/L CaCl₂2mL悬浮细胞沉淀(务必放在冰上)。分装细胞，加入预冷的含30％(v/v)甘油，每管200μL分装，-80℃冰箱保存，此细胞为感受态细胞。本感受细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃冰箱保存，以备以后使用。在-80℃冰箱保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦冻融，不能在进行-80℃冰箱保存。

表达载体的扩增验证：感受态细胞的DNA转化是将-80℃冰箱保存的感受态细胞置于冰中融化5min。加入表达载体pET20b(+)-PelC 2μL(50ng)，轻轻混匀后冰上放置30min。42℃水浴锅中放置90s后，立即于冰中放置3min。每管加入980μL预温的LB培养基，37℃培养1h(160r/min)。取适量涂布平板，将平板倒置于37℃培养箱中培养一夜。

(3)嗜热碱性果胶裂解酶的表达(蛋白的制备)

制备种子液：将步骤(2)获得的工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b(+)-PelC以4‰(v/v)接种至装有20mL种子培养基的50mL锥形瓶中，37℃、170r/min振荡8h至OD₆₀₀＝6.0，获得种子液；所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基的终浓度分别为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；培养基的pH值为7.0。

发酵培养：取种子液以4‰(v/v)的接种量接种至装有2L发酵培养基的5L的锥形瓶中；先37℃、170r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，然后加入IPTG(诱导剂，诱导目的蛋白嗜热碱性果胶裂解酶的表达)至终浓度为0.5mM，25℃、110r/min继续振荡培养20h，获得发酵液。

所述发酵培养基与前面所述的种子培养基成分相同(均为LB培养基，种子培养基20mL，发酵培养基2L)。

将上述步骤中所获得发酵液6000r/min离心10min，弃上清，收集菌体(500mL菌液收集一管，放入-20℃保存)；从该菌体中分离嗜热碱性果胶裂解酶，具体方法如下：

缓冲液10×Tris-HCl(200mM)的配方：取24.2g Tris-base置于1L烧杯中，加入约800mL去离子水充分搅拌溶解，用1mol/L HCl调pH至8.0，将溶液用容量瓶定容至1L，4℃保存。使用时稀释10倍。

嗜热碱性果胶裂解酶纯化过程：将步骤(2)获得的工程菌按照1g/10mL的比例溶于20mM、pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，置于冰上超声破碎30min，当菌液由粘稠状态变为透亮即可，4℃、12000r/min离心15min，收集上清蛋白液；将上清蛋白液放入72℃水浴锅中保温30min，4℃、12000r/min离心15min，收集上清蛋白液；将上清蛋白液通过镍柱亲和层析法处理，通过50mM咪唑-Tris-HCl洗脱，得到洗脱蛋白液；洗脱蛋白液透析过夜得到的蛋白液即本发明所述的嗜热碱性果胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：重组嗜热碱性果胶裂解酶特性

实施例1所述嗜热碱性果胶裂解酶的酶活测定方法具体如下：

底物的配制：称取0.2g多聚半乳糖醛酸置于100mL烧杯中，加入约溶于80mL、50mMGly充分搅拌溶解，用1mol/L NaOH调pH至9.5，将溶液用容量瓶定容至100mL，配成0.2％(w/v)的底物。

对照组：在800μL底物中加入100μL、0.8mM、CaCl₂，70℃预热1min，加入100μL、20mM、pH8.0的Tris-HCl，2min内测定235nm的吸光度值；

实验组：在800μL底物中加入100μL、0.8mM、CaCl₂，70℃预热1min，加入100μL、20μg/mL的嗜热碱性果胶裂解酶溶液，2min内测定235nm的吸光度值。

嗜热碱性果胶裂解酶的一个标准酶活单位(1U)定义为：在上述条件下，1min反应时间内使多聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和多聚半乳糖醛酸所需的酶量。

嗜热碱性果胶裂解酶酶活(U/mL)计算公式如下：

式中：4600(L·mol^-1·cm^-1)为不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数

本发明所测嗜热碱性果胶裂解酶的性质研究，如无特殊说明，都是透析后的嗜热碱性果胶裂解酶蛋白液；采用测活方法如无特殊说明，都是235nm处紫外吸收。

(1)最适pH

方法：将实施例1所得到嗜热碱性果胶裂解酶液作为待测溶液，按照实施例2中的方法，在70℃进行嗜热碱性果胶裂解酶活性检测，差异仅在于将反应体系中的底物的溶于50mMGly缓冲液中，滴加1M NaOH调pH值(3.5～12.0，每隔0.5测不同的酶活)。

将最高酶活记为100％，计算嗜热碱性果胶裂解酶在各种不同pH的缓冲液下的相对酶活(％)，结果如图3所示；以Gly-NaOH缓冲液溶解底物，测得pH为9.5时的相对酶活为100％。本发明所述嗜热碱性果胶裂解酶对pH的变化比较敏感，在酸性条件下基本检测不到活力，在碱性条件下活力较大。当pH<7或pH>11时，基本检测不到酶活力；当8<pH<10.5时，在pH＝9.5时，酶活力最大，而pH＝8或pH＝11时，活力不到pH 9.5时酶活最大的20％。

结果表明，本发明所述嗜热碱性果胶裂解酶的最适pH值为9.5，pH<7或pH>11时，几乎丧失酶活力。

(2)最适温度

方法：将实施例1所得到嗜热碱性果胶裂解酶液作为待测溶液，按照实施例2中的方法，在不同温度下进行嗜热碱性果胶裂解酶活性检测，差异仅在于反应条件中使用不同的反应温度(35～90℃，每隔5℃测不同酶活)。

将最高酶活记为100％，计算采用其他不同温度的相对酶活。结果如图4所示，70℃的相对酶活为100％。嗜热碱性果胶裂解酶的活性随温度的升高而升高，温度在65℃～70℃时酶活都比较大，保留最大酶活的80％以上；在70℃时，酶活力最大；在高于70℃时，酶活力迅速下降。

结果表明：嗜热碱性果胶裂解酶的最适温度为70℃，在65℃～70℃时酶活保持80％以上。

(3)Ca²⁺浓度

方法：将实施例1所得到嗜热碱性果胶裂解酶液作为待测溶液，按照实施例2中的方法，在70℃进行嗜热碱性果胶裂解酶活性检测，差异仅在于反应条件中Ca²⁺浓度(0～1之间每隔0.1mM，1～3之间每隔1mM)不同。

将Ca²⁺浓度为0.8mM时酶活最高记为100％，计算采用其他不同Ca²⁺浓度的相对酶活。结果如图5所示：本发明所述嗜热碱性果胶裂解酶为完全依赖Ca²⁺型，即当反应体系中没有Ca²⁺存在时，该酶不表现活力。Ca²⁺浓度在0.6～1.0mM时酶活都比较大，保留最大酶活的80％；在0.8mM时，酶活力最大；在浓度大于1mM时，酶活力迅速下降。

结果表明：嗜热碱性果胶裂解酶的最适Ca²⁺浓度为0.8mM，在0.6～1.0mM时酶活保留80％以上。

(4)热稳定性

方法：将实施例1所得到嗜热碱性果胶裂解酶液作为待测溶液，按照实施例2中的方法，在70℃进行嗜热碱性果胶裂解酶活性检测，每隔1h检测其相对酶活力。

将开始时(0min)作为酶活最高100％，计算70℃时该酶半衰期。结果如图6所示，在70℃时酶活下降较慢，半衰期为5～6h；10h后酶活力还剩余40％左右。

结果表明：嗜热碱性果胶裂解酶在70℃以下具有良好的热稳定性，半衰期为6h。

本发明所公开的内容，相信本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。本领域研究人员在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改变。

Claims

1.一种嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌，其特征在于：该工程菌的保藏编号为CGMCCNo.11460，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年9月29日。

3.权利要求2所述的一种嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌的构建方法，其步骤如下：

(1)以Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725全基因组DNA为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到3’端含有6个组氨酸标签基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因；

(3)将重组表达载体pET20b(+)-pelC转化到大肠杆菌表达宿主Escherichia coliBL21(DE3)中，构建得到嗜热碱性果胶裂解酶工程菌。

4.如权利要求3所述的一种嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(1)中所述的引物包括上游引物和下游引物，

上游引物5'GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC 3'，

下游引物5'CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG 3'，

5.一种嗜热碱性果胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求5所述的嗜热碱性果胶裂解酶的制备方法，其特征在于：是将权利要求2所述的嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌接种至装有20mL种子培养基的50mL锥形瓶中，接种量2‰～5‰(v/v)，37℃、170r/min振荡培养至OD₆₀₀＝6.0，获得种子液；然后将种子液接种至含有50μg/mL氨苄的装有2L发酵培养基的5L锥形瓶中，接菌量为2‰～5‰(v/v)，于37℃、170r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时加入终浓度0.5mM IPTG进行诱导，同时将温度调整为25～28℃，转速调整为100～120r/min，诱导发酵18～24h，从而得到工程菌发酵液；再将细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋白，通过镍柱亲和层析法得到嗜热碱性果胶裂解酶。

7.权利要求5所述嗜热碱性果胶裂解酶在降解果胶物质中的应用。

8.如权利要求7所述嗜热碱性果胶裂解酶在降解果胶物质中的应用，其特征在于：果胶物质为多聚半乳糖醛酸。