CN105420324B - 一种高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法。该方法步骤如下：（1）将新鲜白鲢鱼皮清洗去除杂物后，先用碱溶液脱脂，再用酸溶液脱除杂蛋白，漂洗至近中性；（2）将预处理好的白鲢鱼皮加水，调节pH至3.5~4.5，温度至40~45℃，加入胃蛋白酶进行酶解反应，反应时间10~18h，反应过程中维持pH及温度恒定；（3）对上述胃蛋白酶酶解液进行超低温真空浓缩；（4）控制反应条件进行转蛋白反应得到大分子胶原蛋白肽溶液，后处理得。该方法通过控制条件下的转蛋白反应在蛋白质水解的基础上再进行蛋白质的合成获得大分子胶原蛋白肽，分子量分布集中，原辅料利用率高，工艺简单，加工成本低。

Description

一种高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术中蛋白肽制备领域，具体涉及一种用转蛋白反应制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法。

背景技术

胶原蛋白，是结缔组织中极其重要的一种结构蛋白，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，约占体内蛋白质总量的25%~30%，而分子量过大的胶原蛋白在人体的吸收利用率低，需经过生物技术降解至分子量到200~10000Da范围的胶原蛋白肽，人体才能有效吸收。研究证明蛋白质水解物的平均分子量是决定其生物学性质最重要的因素之一，蛋白肽组分的理化、功能特性与其分子量大小有关。

通过猪皮、牛皮提取胶原蛋白肽的应用较为广泛，但是鱼皮价格低廉、来源丰富和提取比较容易，且无陆生动物疫病的风险。我国是世界上最大的淡水鱼养殖国，随着淡水鱼类加工业的快速发展，加工过程中产生大量的鱼皮及鱼鳞等废弃物，如不充分利用，污染环境的同时还对资源造成极大的浪费，因此研究从鱼类下脚料中提取胶原蛋白肽具有深远意义。

中国专利申请公布号CN102621213A公开了一种胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法，将原料浸泡溶解、加热、酶解后得到分子量在30万Da以上的完整三螺旋结构胶原蛋白，并对胶原蛋白的热变性程度进行评价。中国专利CN102676620 B公开了一种高分子量鱿鱼皮胶原蛋白的制备方法，选用截留分子量为100kda的超滤膜对酶解液进行超滤，得到大分子胶原蛋白肽的同时回收小分子胶原蛋白肽。中国专利申请公开号103627763A公开了一种安康鱼皮胶原蛋白肽分子量的分级方法，安康鱼皮酶解液经过一级板式超滤膜截留分子量在10000道尔顿以上的胶原蛋白肽，然后经过二级卷式超滤膜截留分子量在2000道尔顿以上的胶原蛋白肽，再后经过卷式纳滤膜截留分子量在200道尔顿以上的胶原蛋白肽。以上方法制备的胶原蛋白肽之间分子量大小差距甚远，分布不集中，最终通过超滤分级来得到不同分子量区段的胶原蛋白肽，工艺复杂且成本较高。

发明内容

本发明的发明目的在于针对现有技术存在的不足提供了一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法。该方法通过控制条件下的转蛋白反应在蛋白质水解的基础上再进行蛋白质的合成获得的大分子胶原蛋白肽，分子量分布集中，原辅料利用率高，工艺简单，加工成本低。

本发明的目的是通过如下技术方案得以实现的：

一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其步骤如下：

(1)将新鲜白鲢鱼皮清洗去除杂物后，先用碱溶液脱脂，再用酸溶液脱除杂蛋白，漂洗至近中性（pH 6.5-7.5）；

(2)将预处理好的白鲢鱼皮加水，调节pH至3.5~4.5，温度至40~45℃，加入胃蛋白酶进行酶解反应，反应时间10~18h，反应过程中维持pH及温度恒定；

(3)对上述胃蛋白酶酶解液进行超低温真空浓缩；

(4)控制反应条件进行转蛋白反应得到大分子胶原蛋白肽溶液，后处理得高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽。

进一步地，所述的脱脂为用0.2%~0.4%碱溶液（w:v，g/ml）浸泡6-10h脱脂，冲洗至近中性；所述的脱除杂蛋白为用0.1%~0.3%酸溶液（w:v，g/ml）浸泡3~6h脱除杂蛋白；所述脱脂后先洗涤至近中性再脱除杂蛋白。

进一步地，脱脂所用碱溶液的量为起始原料新鲜白鲢鱼皮重量的4~6倍，脱除杂蛋白所用酸溶液的量为起始原料新鲜白鲢鱼皮重量的4~6倍。

进一步地，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或两种以上的混合，所述酸为盐酸、硝酸、磷酸、柠檬酸、草酸中的一种或两种以上的混合。

进一步地，步骤（2）中加水量为起始原料新鲜白鲢鱼皮质量1.5~2.5倍，胃蛋白酶的用量为起始原料新鲜白鲢鱼皮质量的0.1~0.3%。

进一步地，步骤（3）中超低温浓缩温度控制在30~45℃，最终浓缩液质量百分比浓度控制在30%~35%。

进一步地，步骤（4）中调节反应体系pH 6.0~6.5，温度40~45℃，进行转蛋白反应，反应时间1~2h。

进一步地，步骤（3）中的整个超低温真空浓缩过程在无剪切力或低剪切力工况下进行，以保留胃蛋白酶的活性。如在超低温真空浓缩时，将超低温真空浓缩设备配套使用无剪切力的正弦泵，保证整个超低温真空浓缩过程在无剪切力工况下进行，以保留胃蛋白酶的活性。

进一步地，所述的后处理为将转蛋白反应液经灭酶、脱色脱臭、除菌过滤、喷雾干燥后得胶原蛋白肽粉。

进一步地，灭酶温度85~90℃，时间10~20min。

进一步地，脱色脱臭用活性炭添加量为反应液的1%~3%（w:v，g/ml），温度60~70℃，时间30~60min。

进一步地，除菌过滤采用0.45μm+0.22μm组合式过滤器，将脱色液经0.45μm过滤器预过滤后再经0.22μm精密过滤器过滤得无菌滤液。

进一步地，喷雾干燥进风温度190~200℃，出进风温度90~95℃，雾化压力40~60bar。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

1、本发明通过在蛋白质水解的基础上通过控制条件下的转蛋白反应进行蛋白质的合成获得大分子胶原蛋白肽，分子量分布集中，无需后续的分级处理，原料利用率高；

2、蛋白质的分解和合成使用同一种酶完成（仅需改变、控制反应条件），成本低。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明方法做进一步的阐述，应理解，以下实施例仅用于详细说明本发明的技术方案，而不应在任何程度上被理解为对本发明请求保护范围的限制。

实施例1

一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其步骤如下：

（1）称取1000Kg的鲜白鲢鱼皮，冲洗去除异物，用4倍鱼皮重的0.2%碳酸钠溶液浸泡8h，冲洗至近中性，再用5倍鱼皮重的0.1%盐酸溶液浸泡3h，冲洗至近中性；

（2）将洗好的鱼皮投入反应罐，加入2000Kg纯净水，开启搅拌，用稀盐酸调节混合物pH至4.5，向反应罐夹套通蒸汽升温至42℃左右，待混合物温度与pH恒定后加入2Kg胃蛋白酶，维持起始pH与温度搅拌反应12h；

（3）用超低温真空浓缩设备对酶解液进行浓缩，浓缩温度40℃，至浓缩液质量百分比浓度达34%时转至反应罐，其中超低温真空浓缩设备所使用的循环泵为无剪切力的正弦泵，以充分保留胃蛋白酶的活性；

（4）调节浓缩液pH至6.0，温度40℃，搅拌进行转蛋白反应1.5h；

（5）将转蛋白反应液升温至87℃并维持10min后转入脱色罐中，向脱色罐夹套通冷却水降温至68℃，再加入反应液1%（w:v，g/ml）的粉末活性炭搅拌脱色30min，脱色液经0.45μm过滤器预过滤后再经0.22μm精密过滤器过滤得无菌滤液，无菌滤液于进风温度195℃、出风温度93℃、雾化压力45bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉180Kg。

经检测所得胶原蛋白肽水分4.8%、灰分0.2%、总氮16.7%、分子量居于1638Da与5808Da之间的占70%，游离氨基酸含量1.65%。

实施例2

一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其步骤如下：

（1）称取2000Kg的鲜白鲢鱼皮，冲洗去除异物，用6倍鱼皮重的0.3%氢氧化钠溶液浸泡6h，冲洗至近中性，再用5倍鱼皮重的0.2%柠檬酸溶液浸泡6h，冲洗至近中性；

（2）将洗好的鱼皮投入反应罐，加入3000Kg纯净水，开启搅拌，用柠檬酸调节混合物pH至4.4，向反应罐夹套通蒸汽升温至45℃左右，待混合物温度与pH恒定后加入3Kg胃蛋白酶，维持起始pH与温度搅拌反应15h；

（3）用超低温真空浓缩设备对酶解液进行浓缩，浓缩温度45℃，至浓缩液质量百分比浓度达32%时转至反应罐，其中超低温真空浓缩设备所使用的循环泵为低剪切力的蠕动泵，以充分保留胃蛋白酶的活性；

（4）调节浓缩液pH至6.2，温度42℃，搅拌进行转蛋白反应1h；

（5）将转蛋白反应液升温至85℃并维持15min后转入脱色罐中，向脱色罐夹套通冷却水降温至70℃，再加入反应液1.5%（w:v，g/ml）的粉末活性炭搅拌脱色45min，脱色液经0.45μm过滤器预过滤后再经0.22μm精密过滤器过滤得无菌滤液，无菌滤液于进风温度190℃、出风温度95℃、雾化压力42bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉350Kg。

经检测所得胶原蛋白肽水分4.2%、灰分0.15%、总氮16.8%、分子量居于1638Da与5808Da之间的占72%，游离氨基酸含量1.38%。

实施例3

一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其步骤如下：

（1）称取2500Kg的鲜白鲢鱼皮，冲洗去除异物，用5倍鱼皮重的0.4%氢氧化钙溶液浸泡10h，冲洗至近中性，再用4倍鱼皮重的0.1%硝酸溶液浸泡4h，冲洗至近中性；

（2）将洗好的鱼皮投入反应罐，加入4000Kg纯净水，开启搅拌，用稀盐酸调节混合物pH至3.5，向反应罐夹套通蒸汽升温至41℃左右，待混合物温度与pH恒定后加入2.5Kg胃蛋白酶，维持起始pH与温度搅拌反应18h；

（3）用超低温真空浓缩设备对酶解液进行浓缩，浓缩温度44℃，至浓缩液质量百分比浓度达35%时转至反应罐，其中超低温真空浓缩设备所使用的循环泵为低剪切力的螺杆泵，以充分保留胃蛋白酶的活性；

（4）调节浓缩液pH至6.5，温度42℃，搅拌进行转蛋白反应2h；

（5）将转蛋白反应液升温至90℃并维持10min后转入脱色罐中，向脱色罐夹套通冷却水降温至60℃，再加入反应液2%（w:v，g/ml）的粉末活性炭搅拌脱色60min，脱色液经0.45μm过滤器预过滤后再经0.22μm精密过滤器过滤得无菌滤液，无菌滤液于进风温度200℃、出风温度90℃、雾化压力60bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉500Kg。

经检测所得胶原蛋白肽水分4.5%、灰分0.1%、总氮16.3%、分子量居于1638Da与5808Da之间的占68%，游离氨基酸含量1.25%。

实施例4

一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其步骤如下：

（1）称取1500Kg的鲜白鲢鱼皮，冲洗去除异物，用5.5倍鱼皮重的0.3%氢氧化钙溶液浸泡7h，冲洗至近中性，再用6倍鱼皮重的0.3%柠檬酸溶液浸泡5h，冲洗至近中性；

（2）将洗好的鱼皮投入反应罐，加入3750Kg纯净水，开启搅拌，用稀盐酸调节混合物pH至3.8，向反应罐夹套通蒸汽升温至40℃左右，待混合物温度与pH恒定后加入4.5Kg胃蛋白酶，维持起始pH与温度搅拌反应10h；

（3）用超低温真空浓缩设备对酶解液进行浓缩，浓缩温度30℃，至浓缩液质量百分比浓度达30%时转至反应罐，其中超低温真空浓缩设备所使用的循环泵为低剪切力的转子泵，以充分保留胃蛋白酶的活性；

（4）调节浓缩液pH至6.4，温度45℃，搅拌进行转蛋白反应1.5h；

（5）将转蛋白反应液升温至88℃并维持20min后转入脱色罐中，向脱色罐夹套通冷却水降温至67℃，再加入反应液2.5%（w:v，g/ml）的粉末活性炭搅拌脱色50min，脱色液经0.45μm过滤器预过滤后再经0.22μm精密过滤器过滤得无菌滤液，无菌滤液于进风温度192℃、出风温度94℃、雾化压力40bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉315Kg。

经检测所得胶原蛋白肽水分4.7%、灰分0.12%、总氮16.6%、分子量居于1638Da与5808Da之间的占63%，游离氨基酸含量1.47%。

实施例5

一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其步骤如下：

（1）称取1800Kg的鲜白鲢鱼皮，冲洗去除异物，用4.5倍鱼皮重的0.4%碳酸氢钠溶液浸泡9h，冲洗至近中性，再用6倍鱼皮重的0.2%草酸溶液浸泡5.5h，冲洗至近中性；

（2）将洗好的鱼皮投入反应罐，加入3500Kg纯净水，开启搅拌，用稀盐酸调节混合物pH至4.1，向反应罐夹套通蒸汽升温至43℃左右，待混合物温度与pH恒定后加入2.7Kg胃蛋白酶，维持起始pH与温度搅拌反应12h；

（3）用超低温真空浓缩设备对酶解液进行浓缩，浓缩温度33℃，至浓缩液质量百分比浓度达30%时转至反应罐；

（4）调节浓缩液pH至6.1，温度43℃，搅拌进行转蛋白反应1h；

（5）将转蛋白反应液升温至87℃并维持10min后转入脱色罐中，向脱色罐夹套通冷却水降温至65℃，再加入反应液3%（w:v，g/ml）的粉末活性炭搅拌脱色30min，脱色液经0.45μm过滤器预过滤后再经0.22μm精密过滤器过滤得无菌滤液，无菌滤液于进风温度198℃、出风温度92℃、雾化压力45bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉358Kg。

经检测所得胶原蛋白肽水分4.9%、灰分0.23%、总氮16.7%、分子量居于1638Da与5808Da之间的占65%，游离氨基酸含量1.38%。

实施例6

一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其步骤如下：

（1）称取2200Kg的鲜白鲢鱼皮，冲洗去除异物，用6倍鱼皮重的0.2%氢氧化钾溶液浸泡7h，冲洗至近中性，再用4倍鱼皮重的0.15%盐酸溶液浸泡3.5h，冲洗至近中性；

（2）将洗好的鱼皮投入反应罐，加入3300Kg纯净水，开启搅拌，用稀盐酸调节混合物pH至4.3，向反应罐夹套通蒸汽升温至44℃左右，待混合物温度与pH恒定后加入2.2Kg胃蛋白酶，维持起始pH与温度搅拌反应17h；

（3）用超低温真空浓缩设备对酶解液进行浓缩，浓缩温度38℃，至浓缩液质量百分比浓度达34%时转至反应罐；

（4）调节浓缩液pH至6.4，温度41℃，搅拌进行转蛋白反应1.2h；

（5）将转蛋白反应液升温至85℃并维持20min后转入脱色罐中，向脱色罐夹套通冷却水降温至63℃，再加入反应液1%（w:v，g/ml）的粉末活性炭搅拌脱色60min，脱色液经0.45μm过滤器预过滤后再经0.22μm精密过滤器过滤得无菌滤液，无菌滤液于进风温度193℃、出风温度90℃、雾化压力53bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉407Kg。

经检测所得胶原蛋白肽水分4.1%、灰分0.35%、总氮16.4%、分子量居于1638Da与5808Da之间的占67%，游离氨基酸含量1.79%。

Claims (7)

1.一种制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤如下：

（1）将新鲜白鲢鱼皮清洗去除杂物后，先用碱溶液脱脂，再用酸溶液脱除杂蛋白，漂洗至近中性；

（2）将预处理好的白鲢鱼皮加水，调节pH至3.5~4.5，温度至40~45℃，加入胃蛋白酶进行酶解反应，反应时间10~18h，反应过程中维持pH及温度恒定；

（3）对上述胃蛋白酶酶解液在无剪切力或低剪切力工况下进行超低温真空浓缩，以保留胃蛋白酶的活性；超低温浓缩温度控制在30~45℃，最终浓缩液质量百分比浓度控制在30%~35%；

（4）控制反应条件进行转蛋白反应得到大分子胶原蛋白肽溶液，后处理得高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽；步骤（4）中调节反应体系pH 6.0~6.5，温度40~45℃，进行转蛋白反应，反应时间1~2h。

2.根据权利要求1所述的制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的脱脂为用按质量体积比g/ml 计为0.2%~0.4%的碱溶液浸泡6-10h脱脂，冲洗至近中性；所述的脱除杂蛋白为用按质量体积比g/ml 计为0.1%~0.3%的酸溶液浸泡3~6h脱除杂蛋白；所述脱脂后先冲洗至中性再脱除杂蛋白。

3.根据权利要求2所述的制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其特征在于：脱脂所用碱溶液的量为起始原料新鲜白鲢鱼皮重量的4~6倍，脱除杂蛋白所用酸溶液的量为起始原料新鲜白鲢鱼皮重量的4~6倍。

4.根据权利要求1或2所述的制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其特征在于：碱为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或两种以上的混合，酸为盐酸、硝酸、磷酸、柠檬酸、草酸中的一种或两种以上的混合。

5.根据权利要求1所述的制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其特征在于：步骤（2）中加水量为起始原料新鲜白鲢鱼皮质量1.5~2.5倍，胃蛋白酶的用量为起始原料新鲜白鲢鱼皮质量的0.1~0.3%。

6.根据权利要求1所述的制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的后处理为将转蛋白反应液经灭酶、脱色脱臭、除菌过滤、喷雾干燥后得胶原蛋白肽粉。

7.根据权利要求1所述的制备高分子量白鲢鱼皮胶原蛋白肽的方法，其特征在于：

灭酶温度85~90℃，时间10~20min；

脱色脱臭用活性炭添加量按质量体积比g/ml 计为反应液的1%~3%，温度60~70℃，时间30~60min；

除菌过滤采用0.45μm+0.22μm组合式过滤器，将脱色液经0.45μm过滤器预过滤后再经0.22μm精密过滤器过滤得无菌滤液；

喷雾干燥进风温度190~200℃，出进风温度90~95℃，雾化压力40~60bar。