CN105420288A - 一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法 - Google Patents

一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，涉及生物质原料降解通过发酵工艺生产燃料乙醇领域。通过在发酵液中直接添加表面活性剂作为细胞保护剂，在发酵过程中对发酵液进行原位脱毒，在减少发酵体系中苯酚、愈创木酚、香兰素、醛类化合物、脂肪酸等毒性物质对发酵的抑制作用的同时改善乙醇生产效率。本发明具有如下优点：(1)工艺简单、操作方便。(2)操作时间短、设备投资低、节约能源；(3)有效提高乙醇发酵效率、降低工业生产成本，对降低木质纤维素生产乙醇的成本具有重要意义。

Description

一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法
技术领域
本发明涉及生物质原料降解通过发酵工艺生产燃料乙醇领域，具体涉及一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法。
背景技术
随着化石能源的日益枯竭和环境污染的日益加剧，可再生清洁能源生物乙醇的开发和利用受到了人们的广泛关注。木质纤维素是自然界最为丰富且廉价的可再生资源，其主要成分纤维素半纤维素是潜在的燃料乙醇的生产原料，利用木质纤维素生产燃料乙醇具有重大的经济价值和社会意义。但是木质纤维素材料中纤维素、半纤维素和木质素三者链接紧密，对木质纤维素原料进行预处理，打破三者之间的紧密结构、去掉木质素是生物乙醇生产过程中必不可少的步骤。稀酸和蒸汽爆破预处理是目前研究较多的预处理方法，在稀酸和蒸汽爆破预处理后的水解液不只包含可发酵糖，还存在弱酸、糠醛和5-羟甲基糠醛(HMF)以及酚类化合物等，这些物质对酿酒酵母发酵产生强烈抑制作用，从而影响酵母菌的正常生长和随后的发酵过程。
因此，对预处理的木质纤维素水解液进行脱毒处理显得尤其重要。目前文献报道的脱毒方法主要包括水洗脱毒、物理脱毒(真空浓缩气提法、膜分离法)、化学脱毒(是石灰中和、活性炭吸附、离子交换、溶剂萃取)、生物脱毒。例如文献BioprocessBiosystEng(2013)36:659–666采用活性炭吸附法讨论了糠醛、HMF、乙酰丙酸等发酵抑制剂对酵母细胞生长速度的影响；专利CA102226204B公开了一种木质纤维素乙醇发酵液的脱毒方法，通过在待处理糖液中添加可溶性电解质盐后加热得到恒温原料液通过膜组件进行膜蒸馏去除糖液中对后续发酵产生抑制作用的物质。可是，水洗、物理、化学脱毒等方式消耗大量水资源、设备投资成本高且工艺复杂，而且脱毒效果差、糖分损失严重；YanlingYu报道了一种生物脱毒法(BioresourceTechnology,2011,102(8):5123-5128),通过利用构巢曲霉(FLZ10)对玉米秸秆蒸汽爆破液进行生物脱毒处理，然后利用酿酒酵母进行同步糖化发酵，乙醇浓度达到34g/L,乙醇浓度未达工业生产的基准浓度(5％体积比)。该方法需要增加构巢曲霉的设备投资、培养基化学试剂及能量消耗。因此，开发一种工艺简单、成本低廉、效果好的脱毒的方法是木质纤维素乙醇工业的必经之路。
发明内容
本发明的目的是针对现有的生物质预处理过程中产生的毒性物质对后续发酵过程的抑制作用，提供了一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法。
一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，通过在发酵液中直接添加表面活性剂作为细胞保护剂，在发酵过程中对发酵液进行原位脱毒，以降低直至消除毒性物质对细胞生长的影响，提高发酵效率；具体按照以下步骤进行：
称取酿酒酵母置于容器中，在33℃条件下用超纯水复水活化15～30min后即可做酒母使用；然后加入可发酵碳水化合物、表面活性剂、pH缓冲溶液、发酵抑制剂；封口，放入摇床中进行震荡培养，摇床转速为160转/min；进行超高浓度乙醇发酵，发酵温度为25～39℃，发酵时间1～130小时；
在整个反应体系中，所述酿酒酵母0.025-0.25g，所述发酵碳水化合物的浓度为60～400g/L、表面活性剂与缓冲液的质量比为0-50％、发酵抑制剂的浓度为0～6g/L，溶液的pH为3.3～5.5。
所述的发酵介质是包含木质纤维素原料的预水解糖液或可发酵碳水化合物、酿酒酵母、PH缓冲液。
所述发酵抑制剂包括苯酚、愈创木酚、香兰素中的一种或几种的混合物，发酵抑制剂浓度为0-6.0g/L。
所述水溶性表面活性剂聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇二甲醚、聚二甲基硅氧烷、吐温中的至少一种；优选为聚乙二醇。
所述pH缓冲溶液为：醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸-磷酸钠缓冲液或硫酸溶液。
所述水溶性表面活性剂聚乙二醇的分子量为200-8000；优选为200-2000。
所述水溶性表面活性剂的添加量为缓冲液质量的0％-40％；优选为25％。
所述木质纤维素原料的预水解液、可发酵碳水化合物为葡萄糖的浓度为60-400g/L。
由于表面活性剂不仅蒸汽压低、而且具有可调整的水溶性、通过对结构及分子量的选择能够实现对其物理、化学、生物性质的精细调控，对很多微生物都具有广泛的生物相容性。在含有毒性抑制物质的发酵介质中添加非离子表面活性剂可直接或间接的作为细胞保护剂有效改善酵母细胞的生存能力，抑制毒性物质对细胞的伤害，从而提高发酵性能。
相对现有技术，本发明在发酵培养基中直接加入表面活性剂作为细胞保护剂进行同步脱毒发酵的方法具有如下优点：(1)工艺简单、操作方便。(2)操作时间短、设备投资低、节约能源；(3)有效提高乙醇发酵效率、降低工业生产成本，具有良好的应用前景。
附图说明
图1不同浓度苯酚对葡萄糖转化率的影响；
图2不同浓度苯酚对乙醇浓度的影响；
图34g.L-1苯酚在不同发酵时间对葡萄糖转化率的影响；
图44g.L-1苯酚在不同发酵时间对乙醇浓度的影响；
图5不同浓度愈创木酚对葡萄糖转化率的影响；
图6不同浓度愈创木酚对乙醇浓度的影响；
图74g.L-1愈创木酚在不同发酵时间对葡萄糖转化率的影响；
图84g.L-1愈创木酚在不同发酵时间对乙醇浓度的影响；
图9不同浓度混合抑制剂对葡萄糖转化率的影响；
图10不同浓度混合抑制剂对乙醇浓度的影响；
图112g.L-混合抑制剂对葡萄糖转化率的影响；
图122g.L-混合抑制剂对乙醇浓度的影响；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围不受实施例的限制，下述实施例和说明书中描述的内容只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
另外，值得说明的是，以下各实施例中发酵液中各组分物的含量测定采用高效液相色谱仪(Agilent1260)，依据葡萄糖投料量计算其转化率、乙醇收率，依据发酵液中乙醇质量、活化水与pH液体积计算乙醇浓度：
色谱条件为：离子交换柱，柱温为65℃，视差折光检测器，检测器为50℃；流动相：5MmH2SO4，流速0.6ml/min，进样量25uL。
实施例1
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、苯酚(0-5g.L-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、苯酚(0-5g.L-1)、PEG-1000(2.0g)，预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。
葡萄糖转化率、乙醇浓度分别如图1、图2所示。从图中数据可以看出，向发酵体系中加入苯酚对发酵效率有较强的抑制作用，而且随着苯酚浓度的增加发酵效率逐渐下降；而当将PEG-1000加入含苯酚的发酵体系中，发酵效率有大幅提高。
实施例2
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、苯酚(4g.L-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵8-100小时。
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、苯酚(4.0g.L-1)、PEG-400(2.0g)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵8-100小时。
葡萄糖转化率、乙醇浓度分别如图3、图4所示。从图中数据可以看出，向发酵体系中加入苯酚(4.0g.L-1)对发酵效率有较强的抑制作用；而当将PEG-400加入含苯酚的发酵体系中，发酵效率明显大幅度提高。
实施例3
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、愈创木酚(0-5g.L-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、愈创木酚(0-5g.L-1)、PEG-1000(2.0g)，预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。
葡萄糖转化率、乙醇浓度分别如图5、图6所示。从图中数据可以看出，向发酵体系中加入愈创木酚对发酵效率有较强的抑制作用，而且随着苯酚浓度的增加发酵效率逐渐下降；而当将PEG-1000加入含苯酚的发酵体系中，发酵效率有大幅提高。
实施例4
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、愈创木酚(5g.L-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵8-100小时。
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、愈创木酚(4.0g.L-1)、PEG-1000(2.0g)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵8-100小时。
葡萄糖转化率、乙醇浓度分别如图7、图8所示。从图中数据可以看出，向发酵体系中加入愈创木酚(4.0g.L-1)对发酵效率有较强的抑制作用；而当将PEG-400加入含苯酚的发酵体系中，发酵效率明显大幅度提高。
实施例5
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、混合抑制剂(苯酚、愈创木酚、香兰素、HMF、糠醛、乙酰丙酸混合物)(0-5g.L-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、混合抑制剂((0-5g.L-1)、PEG-1000(2.0g)，预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。
葡萄糖转化率、乙醇浓度分别如图9、图10所示。从图中数据可以看出，向发酵体系中加入混合抑制剂，对发酵效率有很强的抑制作用，当混合抑制剂浓度超过3g.L-1时，发酵完全停止。加入PEG-1000以后，葡萄糖转化率及乙醇浓度均有所改善，但均未达没有抑制剂存在时的发酵效率。
实施例6
将0.025-0.15g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入0.8g葡萄糖、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液8mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵48小时。
将0.025-0.15g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入0.8g葡萄糖、混合抑制剂(苯酚、愈创木酚、香兰素、HMF、糠醛、乙酰丙酸混合物)(2.0g.L-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵48小时。
将0.025-0.15g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入0.8g葡萄糖、混合抑制剂((2.0g.L-1)、PEG-1000(2.0g)，预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。
葡萄糖转化率、乙醇浓度分别如图11、图12所示。从图中数据可以看出，发酵体系未含抑制剂时，0.05g酵母粉即可使0.8g葡萄糖完全100％转化并获得29g.L-1乙醇；然而当加入2.0g.L-1的混合抑制剂后，发酵效率大幅度下降即使酵母用量提高到0.15g，葡萄糖只能转化88％，同时获得29g.L-1的乙醇；然后向发酵体系中加入PEG-1000，0.05g酵母粉即可使0.8g葡萄糖完全100％转化并获得31g.L-1乙醇。
实施例7
将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、苯酚(4.0g.L-1)、PEG-1000(2.0g)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在28℃条件下发酵72小时。
实施例8
实验步骤和实施例7相同，不同点在发酵温度为36℃，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表1.
实施例9
实验步骤和实施例7相同，不同点在发酵温度为39℃，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表1.
实施例10
实验步骤和实施例7相同，不同点在PEG-1000(0.5g)，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表1.
实施例11
实验步骤和实施例7相同，不同点在PEG-1000(1.5g)，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表1.
实施例12
实验步骤和实施例7相同，不同点在PEG-1000(3.0g)，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表1.
表1葡萄糖转化率、乙醇浓度数据
由表1可以看出：在28-39℃的发酵温度条件下，PEG-1000对发酵效率及终点乙醇浓度有很大改善；PEG-1000的添加量对终点乙醇浓度有一定影响。
实施例13
实验步骤和实施例7相同，不同点在于加入预先配置好pH为3.6的缓冲液溶液柠檬酸-柠檬酸钠6mL，葡萄糖转化率、乙醇浓度数据见表2。
实施例14
实验步骤和实施例7相同，不同点在于加入预先配置好pH为5.5的缓冲液溶液柠檬酸-柠檬酸钠6mL，葡萄糖转化率、乙醇浓度数据见表2。
实施例15
实验步骤和实施例7相同，不同点在于加入预先配置好pH为4.0的缓冲液溶液磷酸-磷酸钠6mL，葡萄糖转化率、乙醇浓度数据见表2。
实施例16
实验步骤和实施例7相同，不同点在于加入预先配置好pH为4.1的缓冲液溶液醋酸-醋酸钠6mL，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表2。
实施例17
实验步骤和实施例7相同，不同点在于加入表面活性剂PEG-400(2.0g)，葡萄糖转化率、乙醇浓度数据见表2。
实施例18
实验步骤和实施例14相同，不同点在于加入表面活性剂PEG-4000(2.0g)克，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表2。
实施例19
实验步骤和实施例7相同，不同点在于加入表面活性剂聚乙二醇单甲醚(2.0g)，葡萄糖转化率、乙醇浓度数据见表2。
实施例20
实验步骤和实施例7相同，不同点在于加入表面活性剂聚乙二醇二甲醚(2.0g)，葡萄糖转化率、乙醇浓度数据见表2。
表2葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据
由表2可以看出：缓冲液种类对发酵效果没有明显影响；表面活性剂种类对发酵效果影响较大。

Claims (8)

1.一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，其特征在于在发酵培养基中加入表面活性剂作为细胞保护剂进行同步脱毒发酵，在减少发酵体系中毒性物质对发酵的抑制作用的同时改善乙醇生产效率，具体按照以下步骤进行：
称取酿酒酵母置于摇瓶中，在33℃条件下用超纯水复水活化15～30min后即可做酒母使用；然后加入包含木质纤维素原料的预水解糖液或可发酵碳水化合物、水溶性表面活性剂、pH缓冲溶液、发酵抑制剂；封口，放入摇床中进行震荡培养，摇床转速为160转/min；进行超高浓度乙醇发酵，发酵温度为25～39℃，发酵时间1～130小时；
在整个反应体系中，所述酿酒酵母0.025-0.25g，所述包含木质纤维素原料的预水解糖液或可发酵碳水化合物的浓度为60～400g/L、表面活性剂加入量为缓冲液质量的0％-40％、发酵抑制剂的浓度为0～6g/L，溶液的pH为3.3～5.5。
2.按照权利要求1所述的一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，其特征在于所述水溶性表面活性剂为聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇二甲醚、聚二甲基硅氧烷、吐温中的至少一种。
3.按照权利要求1所述的一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，其特征在于所述发酵抑制剂包括苯酚、愈创木酚、香兰素中的一种或几种的混合物。
4.按照权利要求1所述的一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，其特征在于pH缓冲溶液为：醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸-磷酸钠缓冲液或硫酸溶液。
5.按照权利要求2所述的一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，其特征在于所述水溶性表面活性剂优选为聚乙二醇,分子量为200-8000。
6.按照权利要求2所述的一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，其特征在于所述水溶性表面活性剂优选为聚乙二醇,分子量为200-2000。
7.按照权利要求1所述的一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，所述水溶性表面活性剂的添加量优选为缓冲液质量为25％。
8.按照权利要求1所述的一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，其特征在于优选：发酵温度为29-38℃，发酵时间为4～100h，酿酒酵母为0.025g-0.25g，发酵体系pH值为3.3-5.5，搅拌速度为160rpm。
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