CN114854798A - 一种有效提高生物质乳酸发酵的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种有效提高生物质乳酸发酵的方法，该方法以生物质水解液为原料，利用戊糖片球菌发酵生物质水解液产乳酸，向水解发酵液中添加高浓度吐温80可以促进生物质水解液的高效利用。在含有抑制物的发酵液中添加高浓度吐温80可以减少毒性物质对细胞的损伤、有效降低毒性抑制物对发酵的抑制作用，有助于提高乳酸浓度及转化率。本发明的优点在于：在吐温80的保护下戊糖片球菌可以直接发酵含有抑制物的发酵液，吐温80可以促进戊糖片球菌在发酵过程中将糠醛降解为糠醇，将5‑HMF降解为2,5‑呋喃‑二甲基甲醇，将愈创木酚降解为2,6‑二甲氧基苯酚进行自我脱毒发酵乳酸，此特性有助于吐温80用于生物质乳酸发酵，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物质能源技术领域，具体涉及一种有效提高生物质乳酸发酵的方法。
背景技术
乳酸是合成多种化学品的重要中间体，可广泛应用在食品、药品、化妆品、制革、纺织、环保和农业生产中。目前最重要的用途是从乳酸生产聚乳酸产品。乳酸的生产方法可分为化学合成法和微生物发酵法。化学法是用乙醛和氢氰酸为原料经过一系列化学催化反应合成，生产成本高，环境污染严重，且难于合成高光学纯度的乳酸；而微生物发酵法则是以糖、淀粉和木质纤维素等做原料，利用各种细菌或真菌经过生物转化合成乳酸，相对化学法工艺路线，微生物发酵法具有原料可再生、污染小和成本低等优点，故成为现在乳酸生产研发的热点。
利用微生物发酵廉价的生物质水解液产乳酸不仅可以降低成本，还能减少因焚烧生物质如玉米秸秆等带来的环境污染问题，具有广阔的应用前景。由生物质原料生产乳酸需要经过预处理、脱毒、酶解、发酵等过程。预处理过程中产生的抑制物显会著影响生物炼制发酵菌株的细胞代谢活性、菌体生长与产物发酵过程(International Journal ofHydrogen Energy,2014,39:16885-16890，Bioresource Technology,2011,102:9965-9969)。尽管一些脱毒方法如活性炭吸附、蒸发处理、过碱中和以及酶或微生物脱毒等已被报道过(Process Biochemistry,2004,39:1909-1912；Biotechnology andBioengineering,2000,69:526-536)，但同时亦増加了生物炼制工艺的复杂性与过程成本，还会造成可发酵糖的损失，因此，如果能有一种保护剂可以使微生物直接在免脱毒的生物质水解液中发酵乳酸，那就可以避免传统脱毒工艺的缺点。
表面活性剂是一类具有亲水和亲油基团的并且加入少量就能使溶液体系界面发生明显变化的物质。按照表面活性剂是否带离子来划分，表面活性剂可以分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂。现阶段，表面活性剂主要用于石油、农药等的分解上(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2007,58:91-97)。而在发酵工业之中，表面活性剂主要用作消泡剂、稳泡剂、消毒洗涤剂以及下游产品的分离之中(化学与生物工程,2006,23:61672-5425)。在纤维素的降解方面，已经有一些报道研究表明表面活性剂，特别是非离子的表面活性剂能促进纤维素酶降解纤维素(Bioresource Technology,2013,131:357-364)。吐温-80是非离子型表面活性剂中的一种，对电解质有很强的抵抗能力，具有很强的亲水性，常被当做乳化剂、稳定剂、润滑剂、增溶剂而广泛运用于食品和医药行业之中。本发明首次尝试将吐温作为保护剂，直接加入免脱毒的生物质水解液中，保护了细胞免受抑制物的损伤，有效提高了乳酸浓度及转化率。
发明内容
本发明的目的是针对现有的生物质预处理过程中产生的毒性物质对后续乳酸发酵过程的抑制作用，提供了一种吐温改进的以生物质为原料的乳酸发酵法。结果表明，吐温-80可以有效促进生物质乳酸的发酵。该技术工艺简单、避免其它高能耗操作，有效削减了乳酸的生产成本，具有实现工业化生产乳酸的潜力。
本发明的特征在于，先用五氧化二磷和生物质共球磨-水解得到生物质水解液，加入营养后配得生物质水解发酵液，在免脱毒的生物质水解发酵液中直接加入吐温-80可以促进戊糖片球菌发酵乳酸。
所述戊糖片球菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC22737。
所述的生物质选自玉米秸秆、稻草、稻壳、玉米芯、芦苇草、柳枝、甘蔗、废弃木头、木屑、报纸及木糖渣(以上生物质去除木糖后的渣)等生物质中的一种或多种富含木质纤维素的生物质材料。
向生物质水解液中添加高浓度吐温可以提高戊糖片球菌发酵生物质水解液产乳酸的效率。
所述生物质水解液为免脱毒的生物质水解液，含有的抑制物为5-HMF(5-羟甲基糠醛)、糠醛、乙酸、乙酰丙酸、苯酚、愈创木酚、香草醛中的一种或两种以上。
进一步地，所述戊糖片球菌可以将糠醛降解为糠醇，将5-HMF降解为2,5-呋喃-二甲基甲醇，将愈创木酚降解为2,6-二甲氧基苯酚。
进一步地，高浓度吐温80可以使戊糖片球菌在混合抑制剂终浓度在0g/L～35g/L的条件下进行乳酸发酵。
所述的乳酸发酵温度为30～50℃，优选37℃；发酵时间为2～120小时；pH为5～8，优选7.0。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：
生物质水解液的获得：将五氧化二磷和生物质按1％～20％的质量比于100～500rpm条件下共球磨5～200min，然后于50～200摄氏度条件下热处理5～120min，再于150～250℃条件下与自来水按照1％～30％的固液比水解5～60min，经固液分离得水解液，用KOH调pH至中性。
乳酸的发酵：将单菌落(戊糖片球菌)转接至种子培养基中，在37℃、180r/min下摇床培养10-24h，得种子培养液。将种子培养液按5～20％的体积比接种至发酵培养基(或生物质水解液发酵培养基)中，在37℃、180r/min的条件下进行发酵产乳酸。
上述利用生物质水解液生产乳酸的方法中所采用的培养基如下：
种子培养基：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠2.0g，柠檬酸二铵2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO4 2.0g，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4.H2O0.25g，CaCO3 20.0g，水1.0L，pH6.8-7.0。
发酵培养基：酪蛋白胨10.0g，葡萄糖30g，牛肉膏10.0g，酵母粉10.0g，乙酸钠4.0g，柠檬酸二铵4.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO4 4.0g，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4.H2O0.25g，CaCO3 40.0g，水1.0L，pH6.8-7.0。
生物质水解液发酵培养基：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉10.0g，乙酸钠4.0g，柠檬酸二铵4.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO4 4.0g，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4.H2O0.25g，CaCO3 40.0g，生物质水解液1.0L，pH6.8-7.0。
本发明的优点和有益效果是：工艺简单、避免复杂的脱毒工艺，节约成本。本发明方法解决了生物质水解液所含毒性物质对乳酸发酵的抑制问题，大大提高了生物质水解液发酵乳酸的产量和效率，有效削减了生产成本，为微生物发酵法生产乳酸的工业化提供了简单经济的发酵工艺，是一种具有工业应用前景的生产乳酸的方法。相对现有技术，本发明的优点在于：本发明通过添加吐温80，可以对生物质水解液不经过脱毒处理直接进行乳酸发酵，对于降低葡萄糖的损失、简化生产工艺、降低设备投资、提高乳酸产量等方面有经济、有效、可行的应用前景。本发明首次利用添加吐温对未脱毒的生物质水解液进行发酵生产乳酸，乳酸浓度及收率获得大幅度提高，有效降低了木质纤维素乳酸生产过程的总成本。
附图说明
图1吐温-80对戊糖片球菌发酵玉米秸秆水解液产乳酸的影响；
图2不同浓度吐温-80对菌发酵玉米秸秆水解液产乳酸的影响；
图3不同类型吐温对菌发酵玉米秸秆水解液产乳酸的影响；
图4吐温-80对菌发酵玉米秸秆渣水解液产乳酸的影响；
图5不同浓度吐温-80对菌发酵玉米秸秆渣水解液产乳酸的影响；
图6不同类型吐温对菌发酵玉米秸秆渣水解液产乳酸的影响；
图7不同浓度的苯酚对戊糖片球菌生长的影响；
图8不同浓度的苯酚对乳酸发酵的影响；
图9在吐温80作用下不同浓度的苯酚对戊糖片球菌生长的影响；
图10在吐温80作用下不同浓度的苯酚对乳酸发酵的影响；
图11不同浓度的愈创木酚对戊糖片球菌生长的影响；
图12不同浓度的愈创木酚对乳酸发酵的影响；
图13在吐温80作用下不同浓度的愈创木酚对戊糖片球菌生长的影响；
图14在吐温80作用下不同浓度的愈创木酚对乳酸发酵的影响；
其中：1：1.73g/L愈创木酚；2：3.70g/L愈创木酚；3：6.71g/L愈创木酚；4:8.71g/L愈创木酚；5：13.31g/L愈创木酚。
图15不同浓度混合抑制剂对生长曲线的影响；
图16不同浓度混合抑制剂对乳酸发酵的影响；
图17不同浓度的混合抑制物在吐温80存在时对生长曲线的影响；
图18不同浓度的混合抑制剂在吐温80存在时对乳酸发酵的影响；
图19吐温80对不同浓度混合抑制剂胁迫下糠醇和2,5-呋喃-二甲基甲醇生成的影响；
表1不同浓度吐温-80条件下菌株发酵玉米秸秆水解液产乳酸对比；
表2不同浓度吐温-80条件下菌株发酵玉米秸秆渣水解液产乳酸的对比；
表3各抑制物在不同等级的混合抑制剂中的浓度分布；
表4各抑制物在加有吐温80的不同等级的混合抑制剂中的浓度分布；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
以下实例中所述戊糖片球菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC22737。
本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，以下实施例中所用的试剂均为市售。本发明优选采用分析纯。分析方法：
(1)定性与定量检测仪器：高效液相色谱(HPLC)为Agilent 1260。糖及有机酸：液相色谱柱为87-H离子交换柱，柱温为65℃，示差折光检测器，检测器为50℃；流动相：5mMH2SO4，流速0.6ml/min，进样量25uL。发酵液各组分含量通过标准曲线计算得到。抑制物：液相色谱柱为Eclipse Plus Phenyl-Hexyl，柱温为35℃，紫外双通道可见光检测器，流动相：0.01M KH2PO4，流速1.0ml/min，进样量25uL。
(2)菌体浓度测定:分光光度法测定600nm下的光密度，以浊度表征细胞浓度。
实施例1吐温的添加对玉米秸秆水解液发酵产乳酸的影响
将粉碎的玉米秸秆(20-80目)与五氧化二磷按质量比5g/0.4g混合球磨30min，于140℃热处理60min后，按固液比10wt％在215℃条件下加水水解45min获得水解液，过滤后备用，其主要成分为纤维二糖1.82g/L，葡萄糖21.56g/L，木糖6.29g/L，1.6-脱水葡萄糖0.76g/L，5-HMF2.68g/L，糠醛4.31g/L，乙酸2.70g/L。在玉米秸秆水解液中添加下述终浓度的营养物配成玉米秸秆水解液的发酵培养基(生物质水解液发酵培养基)：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉10.0g/L，磷酸氢二钠4.0g/L，柠檬酸二铵4.0g/L，Tween 801.0g/L，K2HPO4 4.0g/L，MgSO4.7H2O 0.58g/L，MnSO4.H2O 0.25g/L，CaCO3 40.0g/L,pH6.8-7.0。
将玉米秸秆水解液发酵培养基分为两组，对照组的不再添加吐温-80，实验组在玉米秸秆水解液发酵培养基中再额外添加终浓度50g/L吐温-80。将戊糖片球菌种子液以10％(V/V)的接种量(接种后发酵液中的细胞数为4.0*106cell/mL)分别转接到对照组和实验组的发酵液中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养，定时取样检测葡萄糖消耗及生长情况。由图1可知，经过72h发酵，对照组仅能消耗2.12g/L葡萄糖产生1.51g/L乳酸，质量转化率为71.23％，而吐温实验组则可以消耗10.81g/L葡萄糖产生8.37g/L乳酸，是对照组的5.54倍，质量转化率为77.43％，比对照组提高了8.70％。
实施例2不同吐温浓度对玉米秸秆水解液发酵产乳酸的影响
将戊糖片球菌种子液以10％(V/V)的接种量(接种后发酵液中的细胞数为4.0*106cell/mL)分别转接到不再添加吐温80(0g/L)和在玉米秸秆水解液发酵培养基(其组成同实施例1中所示)的基础上再额外添加有不同终浓度(20g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L)的吐温-80的实验组中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养，经过72h发酵，各实验组中消耗葡萄糖及乳酸转化对比情况如表1所示，发酵过程中葡萄糖及乳酸变化的对比情况如图2所示，经过72h发酵，没有添加吐温-80的对照组仅能消耗2.12g/L葡萄糖产生1.51g/L乳酸，而添加吐温-80后菌株的发酵能力加强，且葡萄糖消耗速率及生成的乳酸浓度与吐温-80的浓度呈正相关。当吐温-80浓度为200g/L时表现最优，产生的乳酸浓度及转化率可达12.16g/L、86.98％，乳酸浓度是对照组的8.05倍，乳酸转化率提高了15.75％，因此，吐温-80的浓度优选为200g/L。
表1
实施例3不同吐温类型对玉米秸秆水解液发酵产乳酸的影响
将戊糖片球菌种子液以10％(V/V)的接种量(接种后发酵液中的细胞数为4.0*106cell/mL)分别转接到在玉米秸秆水解液发酵培养基(其组成同实施例1中所示)的基础上再额外添加有200g/L的不同类型吐温(吐温-20、吐温-40、吐温-60或吐温-80)的实验组中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养，定时取样检测葡萄糖消耗及生长情况。不同类型的吐温对玉米秸秆水解液发酵乳酸的影响如图3所示，在前24h吐温-40和吐温-60的作用下菌能消耗7.23g/L的葡萄糖分别产生0.43g/L、1.58g/L乳酸，24h之后发酵停滞。而吐温-20和吐温-80则表现出了突出的保护作用，经过48h发酵，菌在吐温-20的保护作用下可产生8.06g/L乳酸，发酵液中残余葡萄糖浓度为3.56g/L，而吐温-80则可以产生9.65g/L乳酸，发酵液中残余葡萄糖浓度仅为0.64g/L，因此优选吐温-80，其次是吐温-20。
实施例4吐温的添加对玉米秸秆渣水解液发酵产乳酸的影响
将玉米秸秆渣(获得方法：将150g玉米秸秆和150g去离子水(含5wt％的H3PO4)装入压力密封的不锈钢水解反应器中在205～210℃的饱和蒸汽下保持30min后迅速打开阀门，对收集的湿玉米秸秆渣进行压力过滤，然后在通风条件下于室温干燥，直到水分质量含量小于10％)与五氧化二磷按质量比10g/1g混合球磨30min，于140℃热处理60min后，按固液比10wt％在215℃条件下加水水解45min获得水解糖化浆液，将糖化浆液进行固液分离即得玉米秸秆水解液，其主要成分为：纤维二糖1.50g/L，葡萄糖33.90g/L，木糖3.41g/L，1.6-脱水葡萄糖0.92g/L，5-HMF 2.66g/L，糠醛1.30g/L，乙酸1.13g/L。在玉米秸秆水解液中添加下述终浓度的营养物配成玉米秸秆渣水解液的发酵培养基：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉10.0g/L，磷酸氢二钠4.0g/L，柠檬酸二铵4.0g/L，Tween 80 1.0g/L，K2HPO44.0g/L，MgSO4.7H2O 0.58g/L，MnSO4.H2O0.25g/L，CaCO3 40.0g/L,pH6.8-7.0。
将玉米秸秆渣水解液发酵培养基分为两组，对照组的不再添加吐温-80，实验组在玉米秸秆渣水解液发酵培养基中再额外添加终浓度50g/L吐温-80。将戊糖片球菌种子液以10％(V/V)的接种量(接种后发酵液中的细胞数为4.0*106cell/mL)分别转接到额外添加有终浓度0g/L、50g/L的吐温-80的玉米秸秆渣水解液发酵培养基中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养，定时取样检测葡萄糖消耗及生长情况。由图4可知，吐温-80可以明显促进玉米秸秆渣水解液中的乳酸发酵，不添加吐温-80的对照组可以消耗10.65g/L葡萄糖产生7.68g/L乳酸，而在50g/L吐温-80作用下可以将葡萄糖全部消耗完，可产生15.40g/L乳酸，比对照组提高了100.52％，可见吐温-80的加入有助于玉米秸秆渣水解液中乳酸的发酵。
实施例5不同吐温浓度对玉米秸秆渣水解液发酵产乳酸的影响
将戊糖片球菌种子液以10％(V/V)的接种量(接种后发酵液中的细胞数为4.0*106cell/mL)分别转接到不再添加吐温80(0g/L)和在玉米秸秆渣水解液发酵培养基(其组成同实施例4中所示)的基础上再额外添加有不同终浓度(50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L)的吐温-80的实验组中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养发酵。吐温-80对菌发酵玉米秸秆渣水解液产乳酸的影响如图5所示，吐温-80可以明显促进发酵，且吐温-80的浓度与促进作用呈正比。不同浓度吐温条件下乳酸转化的对比情况如表2所示，不添加吐温-80的对照组仅能消耗部分葡萄糖净产生9.52g/L乳酸，而在吐温-80作用下可以将葡萄糖全部消耗完；在50g/L的吐温-80可以促进底物消耗，但时间较长，乳酸浓度和转化率均较低；当吐温浓度提高到100g/L及以上时，发酵时间缩短至48h，其消耗速率增强，乳酸浓度及转化率也随着吐温浓度的增加而增大。考虑到发酵后期吐温回收问题，优选150g/L吐温-80为玉米秸秆渣水解液发酵产乳酸的优选浓度。
表2
实施例6不同吐温类型对玉米秸秆渣水解液发酵产乳酸的影响
将戊糖片球菌种子液以10％(V/V)的接种量(接种后发酵液中的细胞数为4.0*106cell/mL)分别转接到在玉米秸秆渣水解液发酵培养基(其组成同实施例4中所示)的基础上再额外添加有150g/L的不同类型吐温(吐温-20、吐温-40、吐温-60或吐温-80)的实验组中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养，定时取样检测葡萄糖消耗及生长情况。不同类型的吐温对玉米秸秆渣水解液发酵乳酸的影响如图6所示，在有吐温-80的发酵培养基中发酵性能最优，可以消耗17.98g/L的葡萄糖产生16.22g/L乳酸，乳酸转化率为90.21％；其次是吐温-20，但其在48h之内不能将葡萄糖消耗完，可见其保护作用弱于吐温-80，在吐温-20的作用下可消耗14.84g/L葡萄糖产生12.56g/L乳酸，乳酸转化率为84.64％；相比之下，在吐温-60、吐温-40的保护作用逐渐变弱，产生的乳酸浓度较小，且不能耗完葡萄糖。因此，在各类型吐温中优选吐温-80，其次是吐温-20。
实施例7不同浓度的苯酚对乳酸发酵的影响
将种子液以10％(体积比)的接种量分别转接到同时含有不同浓度(0.92g/L、2.95g/L、4.60g/L、6.63g/L、9.55g/L)苯酚的发酵液中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养。其生长曲线如图7所示，在苯酚浓度低于2.95g/L时，苯酚浓度越大，菌株生长所受抑制越强。不同浓度的苯酚对乳酸发酵的影响如图8所示，苯酚对戊糖片球菌发酵乳酸的影响较大，在0.92g/L苯酚存在时，发酵液中的葡萄糖直到72h都不能被消耗完，可以产生27.92g/L乳酸；随着苯酚浓度增加到2.95g/L时，葡萄糖的消耗速率明显下降，在24h后几乎停滞消耗葡萄糖，仅能消耗8.22g/L葡萄糖；而当苯酚浓度增加到4.6g/L及6.63g/L、9.55g/L后，戊糖片球菌不再消耗葡萄糖，可见戊糖片球菌对苯酚的耐受性较差，最高可耐受浓度低于4.6g/L。
实施例8吐温80对戊糖片球菌在不同浓度苯酚条件下乳酸发酵的影响
将种子液以10％(体积比)的接种量分别转接到同时含有不同浓度(0.73g/L、2.79g/L、4.36g/L、6.19g/L、8.19g/L)苯酚的发酵液中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养。在以上实验组均在添加有不同浓度苯酚的发酵培养基的基础上再额外添加了终浓度200g/L吐温80，如图9所示，即使在苯酚浓度高达8.19g/L时戊糖片球菌仍然可以生长，而在苯酚浓度低于8.19g/L时，戊糖片球菌在前24h的生长几乎不受影响，可见吐温80确实阻止了苯酚对细胞的损伤，起到了很好的保护作用。与实施例1中无吐温80的实验组不同，在添加了吐温80的实验组(图10)中表现出的是，虽然随着苯酚浓度的增加，抑制作用逐渐加强，但并没有完全抑制发酵，即使在8.19g/L苯酚条件下，戊糖片球菌仍然可以在吐温80的保护下消耗葡萄糖产16.20g/L乳酸。可见吐温80有效阻止了苯酚对细胞发酵的抑制，保护了细胞免受高浓度的苯酚损伤，进而可以发酵葡萄糖产乳酸。
实施例9不同浓度的愈创木酚对乳酸发酵的影响
将种子液以10％(体积比)的接种量分别转接到同时含有不同浓度(0.85g/L、2.58g/L、4.23g/L、9.70g/L、11.91g/L)的愈创木酚的发酵液中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养，其生长曲线如图11所示。在愈创木酚浓度小于等于9.7g/L时，菌株生长会受到愈创木酚的微弱抑制。当愈创木酚浓度提高到11.91g/L，抑制作用明显加强。但可以看得出戊糖片球菌对愈创木酚具有很好的耐受性。不同浓度的愈创木酚对乳酸发酵的影响如图12所示，愈创木酚对戊糖片球菌发酵乳酸的影响没有苯酚大，随着愈创木酚浓度的增加，戊糖片球菌消耗葡萄糖的速率逐渐下降，产生的乳酸浓度降低，在0.85g/L、2.58g/L、4.23g/L、9.70g/L愈创木酚时可分别产生28.31g/L、24.85g/L、22.02g/L、18.17g/L乳酸。直到愈创木酚浓度达到11.91g/L时，葡萄糖消耗的抑制程度增加，仅能产生6.75g/L乳酸。
实施例10吐温对戊糖片球菌在不同浓度愈创木酚条件下发酵乳酸的影响
将种子液以10％(体积比)的接种量分别转接到同时含有不同浓度(1.73g/L、3.70g/L、6.71g/L、8.71g/、13.31g/L)的愈创木酚的发酵液中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养，以上实验组均在添加有不同浓度愈创木酚的发酵培养基的基础上再额外添加了终浓度200g/L吐温80，其生长曲线如图13所示：在添加了吐温80的发酵实验组中，不同浓度的愈创木酚对菌株的抑制作用之间的差距缩小，特别是在13.31g/L愈创木酚时吐温80实验组中的细胞浓度大于没有吐温80实验组。可见吐温80在一定程度上对菌株的生长起到了保护作用。与无吐温实验组不同，在添加了吐温80的实验组(图14)中表现出的是，虽然随着愈创木酚浓度的增加，葡萄糖的消耗速率逐渐微弱减缓，但即使在13.31g/L愈创木酚存在时，戊糖片球菌仍然可以正常消耗葡萄糖产生乳酸。在1.73g/L、3.70g/L、6.71g/L、8.71g/L、13.31g/L愈创木酚条件下可分别发酵乳酸28.86g/L、23.60g/L、24.94g/L、21.24g/L、20.39g/L。可见吐温80保护了戊糖片球菌在高浓度愈创木酚条件下乳酸的发酵。愈创木酚在发酵过程中被降解为2,6-二甲氧基苯酚，吐温实验组的降解率高于无吐温实验组，可见吐温80有助于愈创木酚的降解。
实施例11不同浓度的混合抑制剂对乳酸发酵的影响
将种子液以10％(体积比)的接种量分别转接到同时含有不同浓度的混合抑制物(苯酚、愈创木酚、香草醛、HMF、糠醛、乙酸)的发酵培养基中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养进行乳酸发酵，方案如表3所示，0级混合抑制剂中除了来源于种子液的乙酸外没有再额外添加别的抑制剂。菌在不同浓度的混合抑制剂中的生长曲线如图15所示，随着各抑制物浓度的增加，细胞密度逐渐下降，可见混合抑制剂会抑制菌生长，且浓度越大，抑制作用愈强。其发酵曲线如图16所示，不额外添加混合抑制剂时可在24h产生29.52g/L乳酸，转化率为89.58％；在1级混合抑制剂(各抑制物浓度的加和为5.59g/L)的发酵培养基中，菌仍然可以在24h几乎消耗完葡萄糖产生29.31g/L乳酸，转化率为90.03％；而在2级混合抑制剂(各抑制物浓度的加和为10.94g/L)中，随着各抑制物浓度的增加，已明显抑制了葡萄糖的消耗，在72h不能消耗完葡萄糖，仅消耗了66.82％的葡萄糖产生26.02g/L乳酸，转化率为117.46％，可见当抑制物的总和超过10g/L时葡萄糖的消耗会受到明显抑制。而当各抑制物浓度继续增加至3级(各抑制物浓度的加和为18.23g/L)、4级(各抑制物浓度的加和为25.14g/L)、5级(各抑制物浓度的加和为31.98g/L)时，葡萄糖不能被消耗。各抑制物浓度的加和超过18g/L时会完全抑制葡萄糖的消耗。各抑制物在发酵过程中除了香草醛和苯酚的浓度没变外，其他抑制物在发酵过程中的浓度均发生了不同程度的变化。糠醛在发酵过程中被降解为毒性较小的糠醇，从1级到5级混合抑制剂中的糠醛可分别被降解69.22％、61.32％、42.81％、46.79％、38.55％。5-HMF在发酵过程中被降解为2,5-呋喃-二甲基甲醇，1级、2级复合抑制剂中的5-HMF可分别被降解16.47％、6.56％，而3级、4级、5级中的5-HMF变化不明显。愈创木酚可被降解为2,6-二甲氧基苯酚，从1级到5级混合抑制剂中可分别被降解16.93％、14.49％、11.63％、15.03％、11.14％。
表3
实施例12吐温的添加对不同浓度混合抑制剂胁迫条件下乳酸发酵的影响
将种子液分别转接到同时含有不同抑制物(苯酚、愈创木酚、香草醛、HMF、糠醛、乙酸)、各抑制物浓度由低到高的混合抑制剂的发酵培养基中于37℃、180rpm的摇床上恒温震荡培养进行乳酸发酵，除此之外每组实验均在添加有不同浓度抑制物的发酵培养基的基础上再额外添加了200g/L吐温80，方案如表4所示，0级混合抑制剂中包含0g/L5-HMF、0g/L糠醛、0g/L苯酚、0g/L香草醛、0g/L愈创木酚、0.59g/L乙酸。其中乙酸的浓度是由从种子液中接种而来的。1级混合抑制剂包含0.94g/L 5-HMF、0.83g/L糠醛、0.75g/L苯酚、0.77g/L香草醛、0.80g/L愈创木酚、1.57g/L乙酸。其他等级的混合抑制剂的浓度如表2所示梯度增加。在200g/L吐温80的存在下，菌在不同浓度的混合抑制物威胁下的生长曲线如图17所示，混合抑制剂抑制菌正常生长，且浓度越大，抑制作用愈强。经过72h发酵，当高浓度(2、3、4、5级)的混合抑制剂条件下，在吐温80存在下的细胞密度大于没有吐温80实验组的细胞密度，可见吐温80保护了高浓度复合抑制物对细胞的损伤，有助于细胞的生长。其发酵曲线如图18所示，在0级混合抑制剂、1级混合抑制剂(各抑制物浓度的加和为5.66g/L)时均可在24h消耗完葡萄糖分别产23.95g/L、25.75g/L乳酸，转化率分别为83.00％、86.23％；在2级混合抑制剂(各抑制物浓度的加和为11.28g/L)中葡萄糖消耗时间延长，可在48h消耗完葡萄糖，最终产生28.70g/L乳酸，转化率为92.67％。当混合抑制剂的浓度增加到3级(各抑制物浓度的加和为15.65g/L)时，菌可在72h消耗94％的葡萄糖，产生29.31g/L乳酸，转化率为102.15％。而当各抑制物浓度继续增加至4级(各抑制物浓度的加和为20.78g/L)、5级(各抑制物浓度的加和为27.63g/L)时，菌可在72h分别消耗57％、37％的葡萄糖产生19.15g/L、16.10g/L乳酸，转化率分别为102.41％、125.53％。可见在吐温80的保护下，菌株可耐受高浓度的复合抑制物，即使在各抑制物的加和浓度高达27.63g/L的条件下仍然能进行乳酸发酵。可见吐温80可以有效减缓高浓度复合抑制物对发酵的抑制，有效提高了葡萄糖的消耗速率及乳酸的浓度，从2级复合抑制剂开始在吐温80实验组中生成的乳酸均高于没有吐温80实验组，在2级、3级、4级、5级复合抑制剂存在时，吐温80实验组的乳酸分别是没有吐温80实验组的1.10、10.93、8.74、7.76倍。可见，吐温80有助于乳酸在高浓度复合抑制剂存在下乳酸的积累。其机制可由图19可知，随着抑制剂浓度的增加，吐温80实验组中转化糠醛、5-HMF为糠醇、2,5-呋喃-二甲基甲醇的作用愈明显，即吐温80的保护作用愈明显，特别是在4级、5级复合抑制剂中，没有吐温80时均不能转化糠醛、5-HMF，而有吐温80时可以转化，可见吐温80有助于菌在极端环境下的自我解毒，有效促进了高浓度复合抑制物下的发酵。
表4
Claims (10)
1.一种有效提高生物质乳酸发酵的方法，其特征在于，采用添加有吐温的生物质水解液为原料进行戊糖片球菌发酵，生产乳酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生物质水解液为免脱毒的、含有抑制物的生物质水解液，所述抑制物为5-HMF、糠醛、乙酸、苯酚、愈创木酚、香草醛中的任一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物质水解液中添加有下述终浓度的营养物，作为戊糖片球菌的生物质水解液的发酵培养基，营养物为：酪蛋白胨1～10.0g/L，牛肉膏1～10.0g/L，酵母粉1～10.0g/L，磷酸氢二钠0.5～4.0g/L，柠檬酸二铵0.5～4.0g/L，Tween 80 0.1～1.0g/L，K2HPO4 0.5～4.0g/L，MgSO4.7H2O 0.05～0.58g/L，MnSO4.H2O0.05～0.25g/L，CaCO3 10～40.0g/L。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述额外添加的吐温的类型包括吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的一种或二种以上，其中优选为吐温-80。
5.根据权利要求1或3或4所述的方法，其特征在于，所述额外添加的吐温于生物质水解液或生物质水解液的发酵培养基中的终浓度为20～250g/L，优选为100～200g/L。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，吐温可以保护戊糖片球菌在抑制剂终浓度在0.5g/L～35g/L(优选0.5～20g/L)的条件下进行生长并发酵乳酸。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，吐温有助于戊糖片球菌将5-HMF降解为2,5-呋喃-二甲基甲醇、将糠醛降解为糠醇、将愈创木酚降解2,6-二甲氧基苯酚。
8.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述的生物质选自玉米秸秆、水稻稻草、水稻稻壳、玉米芯、芦苇草、柳枝、甘蔗、废弃木头、木屑、报纸及以上生物质经过预处理(如除去木糖)所剩的木糖渣等生物质中的一种或多种富含木质纤维素的生物质材料。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述生物质水解液的获得方法为酸催化、碱催化、蒸汽爆破法水解、超临界水解、酶催化水解等所有酶或非酶催化法中的任意一种或二种以上。
10.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵温度为30～50℃，优选37℃；发酵时间为2～120小时；pH值为5～8，优选6.8～7.0。
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