CN105420237A - 靶向抑制小鼠白细胞介素17A基因的序列siRNA-180 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个靶向抑制小鼠白细胞介素17A的siRNA-180序列，siRNA-180的序列为SEQ.No.1。本发明的有益效果为：本发明提供的一个靶向抑制小鼠白细胞介素17A的siRNA-180序列，通过相关实验结果表明，其可以抑制小鼠细胞介素17A基因的表达，同时，相关实验结果提示，序列siRNA-180可用于抑制由小鼠细胞介素17A基因的表达引起的病理损伤，并能调节与之相关的细胞因子的表达，达到治愈疾病的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一个靶向抑制小鼠白细胞介素17A的siRNA-180序列。
背景技术
白细胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)属于IL-17细胞因子家族，是近年来发现的重要的促炎性反应细胞因子。IL-17家族目前有6个成员，分别为：IL-17A～F，其中IL-17A是通常所说的IL-17，主要由Th17细胞分泌。IL-17受体识别相应的配体后，招募Act1/CIKS[NFκBactivator1，核因子NFκB激活剂1，又称TRAF3作用蛋白2(TRAF3IP2)，也称CIKS(ConnectiontoIKK-complexandSAPK)]，使其磷酸化，活化TRAF6向下游传递信号，调控炎症分子和趋化分子的表达，譬如：IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13、TGF-β、CXCL1、CCL2、CCL7、CCL20和C-反应蛋白等的表达。IL-17A具有促炎性作用，诱导促炎性细胞因子(如IL-6，TNF-α)、趋化因子(如MCP-1和MIP-2)和基质金属蛋白酶的表达，引起组织细胞浸润和组织破坏。IL-17A也参与中性粒细胞的增殖、成熟和趋化，对T细胞的活化起协同刺激作用，并能促进树突状细胞的成熟。IL-17A可以诱导小鼠巨噬细胞和树突状细胞表面MHCI类分子的表达，继而促进抗感染细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的增殖，使得机体能够更好的清除病原体。IL-17A也能够协同活化NK细胞，增强NK细胞杀伤活性，进而增强NK细胞杀伤性分子IFN-γ和颗粒酶B的分泌，杀伤周围肝细胞。研究表明，IL-17A在多种肝脏疾病的发生发展过程中发挥重要作用。酒精性肝病患者血清中IL-17A的水平要远远高于正常人。在慢性HBV相关肝病尤其是乙型肝炎肝硬化中IL-17A表达也明显升高。在巨型艾美耳球虫感染所诱导分泌的炎性细胞因子中，IL-17A可升高1650倍，并加重疾病。在克氏锥虫感染的急性阶段，IL-17A及TNF-α显著上调。曼氏血吸虫虫卵可溶性抗原可诱导小鼠产生高水平的IL-17A和IFN-γ，而在小鼠体内注入IL-17A特异性抗体后，肝虫卵肉芽肿炎症会受到明显抑制，表明IL-17A在曼氏血吸虫感染诱导的肝脏免疫病理损伤中发挥重要作用。综上所述，IL-17A在免疫反应中具有双重作用，即致病作用和炎性反应。对IL-17A基因进行RNA干扰(RNAinterference,RNAi)，将会IL-17A的合成中断，影响其他相关因子的表达，从而达到机体调节的作用。根据小鼠IL-17A基因设计siRNA靶序列，合成siRNA正义链和反义链，并以loop相连，在细胞内转录出与siRNA相同干扰效果，但干扰时间更长的shRNA(shorthairpinRNA)，发挥阻断小鼠IL-17A生成的作用。目前少有基于shRNA干扰技术靶向抑制小鼠IL-17A表达的报道，相关siRNA靶序列值得深入挖掘和应用。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一个靶向抑制小鼠白细胞介素17A的siRNA-180序列，其在相关的实验中表现出对小鼠细胞介素17A基因的表达具有抑制作用。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一个靶向抑制小鼠白细胞介素17A的siRNA-180序列，siRNA-180的序列为SEQ.No.1。
基因序列siRNA-180为：GGACTTCCTCCAGAATGTG(SEQ.No.1)。
本发明的有益效果为：本发明提供的一个靶向抑制小鼠白细胞介素17A的siRNA-180序列，通过相关实验结果表明，其可以抑制小鼠细胞介素17A基因的表达，同时，相关实验结果提示，序列siRNA-180可用于抑制由小鼠细胞介素17A基因的表达引起的病理损伤，并能调节与之相关的细胞因子的表达，达到治愈疾病的目的。
附图说明
图1显示为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180干扰质粒BamHI和PstI酶切鉴定结果。
其中1-5为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180的PstI酶切结果，6-10为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180的BamHI酶切结果。阳性重组载体可以被BamHI切开，而不能被PstI切开。
图2显示为pcDNA3.1-mIL-17A过表达载体酶切鉴定结果。
其中1，2为pcDNA3.1-mIL-17A阳性质粒1,2的酶切结果。
图3显示为本发明的pcDNA3.1-mIL-17A过表达载体和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180干扰载体共转染24h后，RT-PCR检测GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)/mIL-17AmRNA转录水平的扩增曲线，结果显示PCR扩增特异性高。
图4显示为本发明的pcDNA3.1-mIL-17A过表达载体和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180干扰载体共转染48h后，RT-PCR检测GAPDH/mIL-17AmRNA转录水平的扩增曲线，结果显示PCR扩增特异性高。
图5显示为转染24h后，各试验组mIL-17AmRNA转录水平比较。
其中，24H-N为干扰阴性对照+过表达组，24H-N1为过表达阴性对照组，24H-N0为过表达组，24H-B为空白对照组，24H-2为过表达和干扰载体组。结果显示，pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180干扰载体+pcDNA3.1-mIL-17A过表达载体组共转染24h后，mIL-17AmRNA转录水平远低于阴性干扰对照+过表达组(P＝0.000<0.05)。
图6显示为转染48h后，各试验组mIL-17AmRNA转录水平比较。
其中，48H-N为阴性干扰对照+过表达组，48H-N1为过表达阴性对照组，48H-N0为过表达组，48H-B为空白对照组，48H-2为过表达和干扰载体组。结果显示，pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180干扰载体+pcDNA3.1-mIL-17A过表达载体组共转染48h后，mIL-17AmRNA转录水平远低于阴性干扰对照+过表达组(P＝0.000<0.05)。
图7显示为转染24h后，各试验组mIL-17A蛋白表达水平比较。
结果显示，pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180干扰载体+pcDNA3.1-mIL-17A过表达载体共转染24h后，红色荧光量远低于阴性干扰对照+过表达组和过表达组，说明在干扰片段的作用下，mIL-17A蛋白表达水平较阴性干扰对照+过表达组和过表达组低。
图8显示为转染48h后，各试验组mIL-17A蛋白表达水平比较。
结果显示，pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180干扰载体与pcDNA3.1-mIL-17A过表达载体共转染48h后，红色荧光量远低于阴性干扰对照+过表达组和过表达组，说明在干扰片段的作用下，mIL-17A蛋白表达水平较阴性干扰对照+过表达组和过表达组低。
具体实施方式
实施例1：
以下结合实施例对本发明进行说明。
1、序列设计：
针对mIL-17A基因设计siRNA干扰序列，用于合成shRNA，siRNA-180基因序列为SEQ.No.1。
2、mIL-17A干扰载体构建：
2.1OligoDNA设计合成：
shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATCC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；如果shRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。小鼠IL-17A基因shRNA寡核苷酸序列(shRNA-180oligoDNA)如表1所示，设计与合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
表1
| 名称 | 序列5’-3’ | |
| shRNA-180 | 上游 | CACCGGACTTCCTCCAGAATGTGTTCAAGAGACACATTCTGGAGGAAGTCCTTTTTTG |
| 下游 | GATCCAAAAAAGGACTTCCTCCAGAATGTGTCTCTTGAACACATTCTGGAGGAAGTCC |
2.2shDNA模板的退火：
将oligoDNA分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100μmol/L。取相应的正义链和反义链oligoDNA溶液，正义链和反义链oligoDNA退火反应体系如表2所示，按照表2的配比配置退火反应体系。
表2
在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min；85℃5min；75℃5min；70℃5min；4℃保存。退火处理后得到浓度为10μmol/L的shRNA模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200nmol/L，用于连接反应。
2.3pGPU6/GFP/Neo载体的线性化：
取10μgpGPU6/GFP/Neo载体，按照表3pGPU6/GFP/Neo载体酶切反应体系进行酶切处理，37℃酶切1h，琼脂糖凝胶电泳，使用AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng/μL。
表3
2.4pGPU6/GFP/Neo-shRNA-180载体的构建：
按照表4所示的pGPU6/GFP/Neo载体与shRNA-180干扰片段的连接反应体系进行载体和片段的连接，22℃连接1h,转化Top10感受态细胞。
表4
2.5阳性克隆的鉴定与测序：
从每块平板上挑取5个菌落，接种到含50μg/mlKanamycin的LB培养基中，37℃培养16h，使用碱裂解法抽提质粒。所得质粒用BamHI，PstI分别酶切鉴定，如图1所示。阳性重组载体应该可以被BamHI切开，而不能被PstI切开。挑选酶切结果正确的两个克隆进行序列测定。
3、mIL-17A过表达载体构建：
由TaKaRa公司合成mIL-17A基因序列，同时在序列两端分别加入BamHI和NotI两个酶切位点，并连接于pMD18-Tsimple载体。用BamHI和NotI酶对pMDl8-Tsimple质粒进行双酶切，胶回收目的片段。用T4DNA连接酶连接到经BamHI和NotI双酶切并纯化回收的pcDNA3.1载体，转化JM109感受态细胞，涂布于含有100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板，置于37℃培养箱过夜培养。挑取菌落置于LB培养基摇菌增殖，小量质粒制备，BamHI和NotI双酶切鉴定，阳性质粒送公司进行序列测定，确定构建表达质粒pcDNA3.1-mIL-17A序列正确且插入阅读框无误。
4、mIL-17A过表达和干扰载体共转染：
将293T细胞在10cm2培养皿中培养至80％-90％融合时，接种6孔板。倾去培养液，用2mLPBS洗涤细胞两次。加入2mLTrypsin-EDTAsolution,混匀后，37℃放置3-5min。小心吸去胰酶溶液，在加入2mL含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。血球计数板计数，将细胞稀释至1.5×106细胞/mL。按1.5×106细胞/孔的浓度接种6孔板，混匀后于37℃下5％CO2培养条件下培养24h。在1.5mLEP管中加入250μLOpti-MEMI，加入1μgpcDNA3.1-mIL-17A过表达质粒，并加入1μgpGPU6/GFP/Neo-shRNA-180干扰质粒。取另一1.5mLEP管，加入250μLOpti-MEMI，加入6μLlipofectamin2000，混匀，室温放置5min后将两管混合，室温放置20min。实验设过表达阴性对照组，过表达组，阴性干扰对照+过表达组及空白组。吸去6孔板中的培养液，每孔加入1mL无血清的DMEM培养液。将转染混合物逐滴加入6孔板中，混匀后，在培养箱中温育4-6h。吸弃转染液，加入1.5mL含10％FBS的DMEM培养液。37℃5％CO2培养条件下继续培养24h和48h，收样。所得细胞用于Real-TimePCR检测。
5、总RNA的提取：
吸弃6孔板中的培养液，每孔加入1mLTrizolReagent，用枪头吹打使细胞完全裂解。将裂解液转移至1.5mLEP管中，室温放置10min。加入200μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温放置10min。12000×g4℃离心10min，吸取上层清液至新离心管中，加入等体积的异丙醇，室温沉淀10min。12000×g4℃离心15min，弃上清。沉淀用500μL75％乙醇洗涤一次。12000×g4℃离心5min，回收沉淀，弃上清。常温倒置晾干10min。用20μLDEPC-H2O溶解沉淀，测定OD260、OD280，计算RNA浓度。琼脂糖电泳检查RNA的完整性。
6、Real-timePCR分析：
逆转录反应体系如表5所示，反应程序为42℃30min；85℃10min。
表5
实时荧光定量PCR反应体系如表6所示。定量PCR反应程序为95℃3min变性；95℃，12S；62℃，40S；40循环。
表6
7、免疫荧光检测：
将293T细胞在10cm2培养皿中培养至80％-90％融合时，接种12孔板。倾去培养液，用2mLPBS洗涤细胞两次。加入2mLTrypsin-EDTAsolution,混匀后，37℃放置3-5min。小心吸去胰酶溶液，加入2mL含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。血球计数板计数，将细胞稀释至1.5×106细胞/mL。按2×105细胞/孔的浓度接种12孔板，混匀后于37℃5％CO2培养条件下培养24h。在1.5mLEP管中加入250μLOpti-MEMI，加入0.4μgpcDNA3.1-mIL-17A过表达质粒，并加入0.4μgpGPU6/GFP/Neo-shRNA-180干扰质粒。取另一1.5mLEP管，加入250μLOpti-MEMI，加入3μLlipofectamin2000，混匀，室温放置5min后将两管混合，室温放置20min。实验设过表达阴性对照组，过表达组，阴性干扰对照+过表达组及空白组。吸去12孔板中的培养液，每孔加入1mL无血清的DMEM培养液。将转染混合物逐滴加入12孔板中，混匀后，在培养箱中温育5h。吸弃转染液，加入1.5mL含10％FBS的DMEM培养液。37℃5％CO2培养条件下继续培养24h和48h。取出12孔板，PBS清洗三次，每次10min。4％多聚甲醛，室温固定30min，去除固定液，PBS洗三次，每次10min。用含0.2％TritonX-100的PBS室温下通透处理15min，PBS漂洗三次，每次10min。一抗1:600稀释，二抗1:150稀释，并加入1％BSA，4℃孵育过夜。取出12孔板，PBS清洗未结合的抗体稀释液，显微镜下观察拍照。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>靶向抑制小鼠白细胞介素17A基因的序列siRNA-180
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列（siRNA-180）
<400>1
ggacttcctccagaatgtg19
Claims (1)
1.一个靶向抑制小鼠白细胞介素17A的siRNA-180序列，其特征在于，siRNA-180的序列为SEQ.No.1。
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