CN105420207A - 与水稻叶绿体rna聚合酶pep及叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

与水稻叶绿体rna聚合酶pep及叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与水稻叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质为WSL3，WSL3蛋白氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；其基因编码区如SEQ？ID？NO.2所示。本发明首次发现并克隆到一个定位于水稻叶绿体且与水稻叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的基因WSL3，WSL3基因编码蛋白为水稻PEP酶的一个外围亚基。将所述蛋白的编码基因导入叶绿体发育异常的植物中，可以培育成叶绿体发育和色素含量正常的植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

与水稻叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种与水稻叶绿体RNA聚合酶PEP(plastid-encodedplastidRNApolymerase)及叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在世界各地广泛种植。水稻也是我国最主要的粮食作物之一，全国约有一半以上的人口以水稻作为主粮。我国是世界水稻总产量最高的国家，在2012年水稻总产量约占全世界的29％(约2亿吨)，同时也占当年我国主要谷类作物总产量的38％。世界人口的迅速增长，耕地面积的锐减和生态环境的急剧恶化加剧了粮食供应不足和人口过度增长之间的矛盾，使进一步增加单位面积的粮食产量成为全世界育种家们亟需解决的难题之一。惟一在叶绿体内进行的光合作用是与粮食产量直接相关的生命活动。光合作用在将CO2转化为碳水化合物的过程中也将太阳能转化为生物能，为包括人类和动物在内的非自养生物提供了必需的物质基础和能量来源。鉴于叶绿体在提高作物产量和环境保护方面的重要作用，叶绿体的起源，分化，发育和功能的研究受到越来越多的关注和重视。叶绿体的正确分化和发育需要PEP依赖基因的正确表达。
PEP是成熟叶绿体中最主要的RNA聚合酶，主要负责与光合作用相关基因的转录。PEP是一个巨大的动态复合体，由叶绿体基因编码的核心亚基与细胞核基因编码的外围亚基组成。外围亚基对于PEP行使正常的转录功能是必需的，然而对于PEP外围亚基的种类和功能还不是特别清楚。已报道的PEP外围亚基的功能涉及氧化还原态的维持，活性氧的清除和核蛋白的降解等。近年来对于PEP外围亚基的研究主要集中在拟南芥等双子叶植物中，在单子叶植物玉米中也有少量报道，然而在重要作物水稻中尚无此类突变体和基因被报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种与水稻叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，命名为WSL3蛋白，来自水稻栽培品种93-11，是如下(a)或(b)：
(a)由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的由SEQIDNO.1衍生的蛋白质；
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQIDNO.2所示的DNA序列中缺失/添加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。
编码所述WSL3蛋白的基因(WSL3基因)也属于本发明的保护范围。
所述WSL3基因是如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：
(1)编码区如SEQIDNO.2所示的DNA分子；
(2)基因组如SEQIDNO.3所示的DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关蛋白的DNA序列。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，可使用所述基因本身启动子(序列4)，也可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境(如低温)筛选转化植株。
所述重组表达载体可为在pCUbi1390(参见图1)的多克隆位点HindⅢ和BamHI之间插入所述基因WSL3的自身启动子和cDNA序列，所述重组质粒具体可为pWSL3Pro::WSL3cDNA；所述pWSL3Pro::WSL3cDNA是通过重组技术将pCUbi1390载体的泛素启动子替换为所述基因WSL3的自身启动子后再将所述基因WSL3的cDNA序列插入到替换启动子的pCUbi1390载体的多克隆位点BamHI处得到。
含有以上任一所述基因(WSL3)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
扩增所述基因(WSL3)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种培育叶绿体发育正常的转基因植物的方法。
本发明提供的培育叶绿体发育正常的转基因植株的方法，是将所属基因导入叶绿体发育异常的植物中，得到叶绿体发育正常的转基因植物；所述叶绿体发育异常植物为细胞中叶绿体不发育或发育迟滞，叶绿体不含或只包含很少的类囊体导致植物整体或叶片褪绿的植物；所述叶绿体发育正常的转基因植物为细胞中叶绿体发育正常，具有丰富的类囊体，植物整体或叶片为绿色的植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入叶绿体发育异常的植物中。所述叶绿体发育异常植物可为wsl3。
所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
有益效果：
本发明首次发现并克隆到一个定位于水稻叶绿体且与水稻叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的基因WSL3，WSL3基因编码蛋白为水稻PEP酶的一个外围亚基。本发明的实验证明，缺失WSL3基因的植株叶片褪绿，尤其是在低温(如25℃)时植株整株完全白化、叶片色素含量显著降低、叶肉细胞中不含叶绿体或仅含很少的未发育或发育不完全的叶绿体。即WSL3蛋白是叶绿体正确发育所需要的。将所述蛋白的编码基因导入叶绿体发育异常的植物中，可以培育成叶绿体发育和色素含量正常的植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。
附图说明
图1pCUbi1390载体图谱
图2野生型和突变体wsl3的表型
A野生型和突变体wsl3在低温(恒温25℃)时的表型；B野生型和突变体wsl3在较高温度(恒温30℃)时的表型。
图3野生型和突变体wsl3的叶绿素含量测定
A野生型和突变体wsl3在低温(恒温25℃)条件下生长至三叶期时各叶片的色素含量；B野生型和突变体wsl3在较高温度(恒温30℃)条件下生长至三叶期时各叶片的色素含量。WT：野生型；L2：第二真叶；L3：第三真叶；Chla：叶绿素A；Chlb：叶绿素B。
图4野生型和突变体wsl3叶肉细胞中叶绿体的超微结构观察
图5WSL3基因的精细定位
图6WSL3基因示意图，显示wsl3中突变形式
图7互补转基因株系的PCR鉴定
图8野生型、互补转基因株系和突变体在恒温30℃条件下生长至三叶期时的表型
图9野生型、互补转基因株系和突变体在恒温30℃条件下生长至三叶期时的色素含量测定
图10互补转基因株系叶肉细胞中叶绿体的超微结构观察
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、水稻中与叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关蛋白及其编码基因的发现
一、水稻与叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关突变体的发现。
突变体wsl3是水稻栽培品种93-11经60Co辐照诱变产生的。突变体wsl3对温度敏感，在低温(恒温25℃)时整株完全白化(图2A)，在较高温度(恒温30℃)时仅前三叶表现出白条纹的表型，从第四叶开始新生叶与野生型无明显差异，但前三叶的白条纹部分不会重新回复绿色(图2B)。突变体wsl3褪绿部位的色素含量明显降低(图3)。观察叶绿体的亚显微结构发现在低温时突变体wsl3的叶肉细胞中几乎没有叶绿体的存在，在较高温度生长时褪绿部位的叶肉细胞中仅含有少量未发育或发育不完全的叶绿体，正常绿色部位的叶肉细胞中的叶绿体与野生型无差异(图4)。
二、突变基因定位
1、突变基因初步定位
为确定wsl3突变体的遗传模式，我们首先配制了突变体wsl3与野生型93-11的正反交组合93-11/wsl3和wsl3/93-11。正反交所得F1植株的叶片颜色均与野生型无差异。正反交组合的F1代植株都表现出与野生型93-11相似的表型，F2群体中叶片正常绿色与叶片褪绿的植株符合3:1的分离比，说明wsl3突变体的表型受一个单隐性核基因的控制。
用突变体wsl3和粳稻栽培品种滇粳优1号(DJY)杂交，在wsl3/DJY的F2分离群体进行基因定位，选取在苗期表现出白化或白条纹等褪绿表型的极端隐性个体进行基因初定位。首先利用实验室已筛选出的在粳稻品种日本晴和籼稻品种93-11之间多态性良好且均匀分布于不同染色体上的160对SSR标记和10株隐性极端个体进行连锁分析。经全基因组扫描后将目的基因初步连锁在第10号染色体的长臂上，与SSR标记RM271共分离。
上述SSR标记分析的方法如下所述：
(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：
①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。
②加入660μL提取液(含100mMTris-Hcl(pH8.0)，20mMEDTA(pH8.0)，1.4MNaCl,0.2g/mLCTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。
③加入40μL20％SDS，65℃水浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。
④加入100μL5MNaCl，温和混匀。
⑤加入100μL10×CTAB，65℃水浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。
⑥加入900μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。
⑦转移上清液至1.5mLEppendorf管中，加入600μL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。
⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。
⑨加入100μL1×TE(121克Tris溶于1L水中，用盐酸调pH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。
⑩取2μL溶解的DNA用电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(BechmanInstrumentInc.U.S.A)。
(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μL，作为模板进行PCR扩增；
PCR反应体系(10μL)：DNA(20ng/μL)1μL，上游引物(2pmol/μL)1μL，下游引物(2pmol/μL)1μL，10xBuffer(MgCl2free)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，MgCl2(25mM)0.6μL，rTaq(5U/μL)0.1μL，ddH2O5.1μL，共10μL。
PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJResearchPTC-225热循环仪中进行。
(3)SSR标记的PCR产物检测
扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNALadder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。
2、突变基因精细定位
根据初步定位的结果，在突变基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记，并自行开发InDel标记。用F2群体中的极端隐性单株验证，在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体基因。从wsl3/DJY的F2分离群体挑取确认为突变表型的隐性极端个体，用于突变体基因的精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的InDel分子标记对突变位点进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变位点，具体方法如下：
(1)InDel标记开发
下载突变位点附近日本晴的BAC/PAC克隆序列，在NCBI数据库中与籼稻品种93-11序列进行比对，寻找两者之间存在的3个及3个以上碱基缺失的位置，运用PrimerPremier5.0软件设计含有缺失位点的引物，并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的InDel成对引物等比例混合，检测其在93-11和DJY之间的多态性，表现多态者用作精细定位WSL3基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表1。
标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/μL)2μL，正向引物(10pmol/μL)2μL，反向引物(10pmol/μL)2μL，10xBuffer(MgCl2free)2μL，dNTP(10mM)0.4μL，MgCl2(25mM)1.2μL，rTaq(5U/μL)0.4μL，ddH2O10μL，总体积20μL。
表1用于精细定位的分子标记
利用1620株取自F2定位群体的隐性极端个体和开发的InDel标记将突变体基因最终定位在InDel标记LY10-40和LY10-48之间，左侧LY10-40处有1个交换单株，右侧LY10-48处有3个交换单株，物理间距为66-kb(图5)。
(2)突变基因的获得
通过对66-kb区间的测序，发现WSL3基因的第九个外显子上存在九个碱基的缺失(图6)。
根据网上公布的序列设计引物，序列如下所述：
引物1：
5'ATGGCCACCCCTACCCCCAC3'(SEQIDNO.5)
引物2：
5'TTACTCCTCTGCAGGTGGCG3'(SEQIDNO.6)
以引物1和引物2为引物，以93-11的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。
扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30s，60℃45s，72℃3min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后克隆到载体pEASY(北京全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京TIANGEN公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。
序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，编码899个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的SEQIDNO.1)。将SEQIDNO.1所示的蛋白命名为WSL3(即为基因定位中所述的WSL3基因)，将SEQIDNO.1所示的蛋白的编码基因命名WSL3。
实施例2、转基因植物的获得和鉴定
以93-11的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得WSL3基因的启动子序列，PCR引物序列如下：
引物3：(下划线所示的序列为HindⅢ酶切位点)
5'CCGGCGCGCCAAGCTTCGTTCCCGTTGTTCCAGG3'(SEQIDNO.7)
引物4：(下划线所示的序列为BamHI酶切位点)
5'GAATTCCCGGGGATCCAAGGGCCGCGGCGGGGTT3'(SEQIDNO.8)
上述引物位于SEQIDNO.2所示基因的上游1.6-kb区间(参见SEQIDNO.4)。将PCR产物回收纯化，采用INFUSION重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pCUbi1390中，构建成pWSL3Pro::pCUbi1390
INFUSION重组反应体系(10μL)：PCR产物1.0μL，pCUbi13906.0μL，5×Infusionbuffer2.0μL，Infusionenzymemix1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴15min，而后50℃水浴15min，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京TIANGEN公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有序列4所示基因上游启动子的重组表达载体，将其命名为pWSL3Pro::pCUbi1390。
以93-11的cDNA为模板，进行PCR扩增获得WSL3基因，PCR引物如下：
引物5：(下划线所示的序列为BamHI酶切位点)
5'CGCGGCCCTTGGATCCATGGCCACCCCTACCCCCAC3'(SEQIDNO.9)
引物6：(下划线所示的序列为BamHI酶切位点)
5'GAATTCCCGGGGATCCTTACTCCTCTGCAGGTGGCGGTT3'(SEQIDNO.10)
将PCR产物回收纯化，采用INFUSION重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pWSL3Pro::pCUbi1390中，构建成pWSL3Pro::WSL3cDNA。
INFUSION重组反应体系(10μL)：PCR产物1.0μL，pWSL3Pro::pCUbi13906.0μL，5×Infusionbuffer2.0μL，Infusionenzymemix1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴15min，而后50℃水浴15min，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京TIANGEN公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQIDNO.2所示基因的重组表达载体，将含有WSL3的pWSL3Pro::pCUbi1390命名为pWSL3Pro::WSL3cDNA。
二、重组农杆菌的获得
用电击法将pWSL3Pro::WSL3cDNA转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英骏公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pWSL3Pro::WSL3cDNA。
三、转基因植物的获得
分别将EH-pWSL3Pro::WSL3cDNA转化突变体wsl3与DJY杂交的F5代自交群体中的隐性纯合个体(纯93-11背景的突变体wsl3不能被成功转化)，具体方法为：
①28℃培养EH-pWSL3Pro::WSL3cDNA培养16小时，收集菌体，并稀释到含有100μM乙酰丁香酮的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD600≈0.5，获得菌液；
②将培养至一个月的F5代wsl3/DJY隐性纯合个体水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；
③将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L抗卡那霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；
④挑取健康愈伤转入含有100mg/L抗卡那霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；
⑤挑取健康愈伤转入含有50mg/L抗卡那霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；
⑥挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；
得到分化成苗的T0代阳性植株。
四、转基因植株的鉴定
1、PCR分子鉴定
本发明是将WSL3基因的cDNA和自身启动子转化到叶绿体发育异常的植物中，若转化成功则能够在基因组DNA中扩增出WSL3基因的cDNA片段。故本发明利用前述引物引物1和引物2扩增转基因植株的基因组DNA，若能扩增出大小约为2700-bp的条带则为阳性植株，若不能扩增出条带则为阴性植株。
扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30s，55℃(引物不同，有所调整)45s，72℃3min，35个循环；72℃5min。
结果表明获得25株PCR检测阳性的植株，见图7(所示三个株系为随机挑选)，图7中，泳道1为野生型93-11，泳道2为突变体wsl3，泳道3为ddH2O对照，泳道4为pWSL3Pro::WSL3cDNA载体，泳道5～7为随机挑选的三个转pWSL3Pro::WSL3cDNA株系。
2、表型鉴定
将野生型93-11，突变体wsl3和随机挑选的3个转pWSL3Pro::WSL3cDNA株系(Line1、Line2和Line3)种植在恒温30℃，湿度为70％的光照培养箱中，待生长至三叶期时观察表型。发现转pWSL3Pro::WSL3cDNA株系的叶片回复正常绿色(图8)，色素含量和叶绿体的亚显微结构也得到了恢复(图9，10)。由此验证了转基因前的叶绿体发育异常和叶片褪绿性状是由WSL3基因控制的。

Claims (10)

1.一种与水稻叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的蛋白，其特征在于所述的蛋白WSL3来自水稻栽培品种93-11，选自如下(a)或(b)中的任意一种：
(a)由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关的由SEQIDNO.1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1中所述蛋白的基因WSL3。
3.根据权利要求2所述的基因WSL3，其特征在于所述基因WSL3是如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：
(1)编码区如SEQIDNO.2所示的DNA分子；
(2)基因组如SEQIDNO.3所示的DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；
(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物叶绿体RNA聚合酶PEP及叶绿体发育相关蛋白的DNA序列。
4.含有权利要求3所述基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在pCUbi1390的多克隆位点HindⅢ和BamHI之间插入权利要求2或3所述基因WSL3的自身启动子和cDNA序列所得；所述重组表达载体优选通过重组技术将pCUbi1390载体的泛素启动子替换为所述基因WSL3的自身启动子后再将所述基因WSL3的cDNA序列插入到替换启动子的pCUbi1390载体的多克隆位点BamHI处得到。
6.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7.用于扩增权利要求2或3所述基因的引物对，其特征在于上游序列如SEQIDNO.5所示，下游序列如SEQIDNO.6所示。
8.权利要求2或3所述基因在水稻育种中的应用，优选在改造叶绿体发育异常的植物获得叶绿体发育正常的植物中的应用。
9.权利要求4所述的重组表达载体、权利要求6所述的表达盒、转基因细胞系或重组菌在水稻育种中的应用。
10.一种培育叶绿体发育正常的转基因植株的方法，其特征在于将权利要求2或3所述基因导入叶绿体发育异常的植物中，得到叶绿体发育正常的转基因植物；所述叶绿体发育异常植物为细胞中叶绿体不发育或发育迟滞，叶绿体不含或只包含很少的类囊体导致植物整体或叶片褪绿的植物；所述叶绿体发育正常的转基因植物为细胞中叶绿体发育正常，具有丰富的类囊体，植物整体或叶片为绿色的植物。
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