CN105412114A - 6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-n-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在制备血管生成抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在制备血管生成抑制剂中的应用，其中，6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的结构式为式(I)：

Description

6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在制备血管生成抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及抑制血管生成的应用。更具体地说，本发明涉及6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在制备血管生成抑制剂中的应用。

背景技术

视网膜病变、风湿性关节炎、动脉粥样硬化等疾病的发生与血管生成有密切关系。

(1)肿瘤新生血管生成是指在肿瘤组织中，血管内皮细胞在相关刺激血管生成信号的作用下由相对静止转为快速生长，在已存在的血管组织中产生新生血管的过程，是肿瘤生长的重要前提。肿瘤新生血管的生成满足了肿瘤组织进一步生长代谢的需要，使肿瘤细胞不断分裂增殖，并成为肿瘤细胞浸润侵袭、远处转移的重要路径。

Folkman教授于1971年首次提出了肿瘤的生长需要新生血管形成。血管生成抑制剂是通过抑制促进血管生成的生长因子、生长因子受体及下游信号通路等，抑制新生血管生成，从而抑制肿瘤的生长和转移的发生。抗肿瘤新生血管生成治疗已成为恶性肿瘤综合治疗中的重要方法之一。针对肿瘤新生血管形成或血管生成的治疗手段在癌症治疗中占有重要地位，贝伐单抗等针对血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体生物制剂在临床上已被广泛运用。

(2)在视网膜血管性疾病的病理改变过程中，血管内皮生长因子(VEGF)呈高表达状态；抗VEGF治疗的临床试验证实，治疗可使脉络膜新生血管膜缩小、液体渗漏减少，在新生血管性年龄相关性黄斑变性、各种病因的脉络膜新生血管膜、糖尿病和静脉阻塞导致的黄斑水肿、早产儿视网膜病变及新生血管性青光眼的治疗中，抗VEGF治疗显示出一定程度的有效性。

血管生成是类风湿性关节炎(RA)早期滑膜病理改变的特征之一，也是产生和维持RA血管翳的主要因素，新血管生成被认为形成和维持RA血管翳的重要因素，抑制血管生成的药物可以有效缓解RA的病情。

(4)动脉粥样硬化引起血管阻塞的同时也涉及到动脉新血管生成。新血管从动脉外膜的营养血管开始生长并延伸入粥样斑块下内膜层，这些新生毛细血管可以起到促进粥样斑块生长的作用。因此抑制血管生成的药物对于抗动脉粥硬化治疗有着重要意义。

对于本发明涉及的6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在治疗糖尿病引起的视网膜神经损伤、类风湿性关节炎以及抗动脉粥样硬化中的应用属于首次公开，由于其对于上述疾病的治疗强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于抑制血管生成显然具有显著的进步。

发明内容

本发明的目的是提供一种6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在制备血管生成抑制剂中的应用，其能抑制促进血管生成的生长因子、生长因子受体及下游信号通路，抑制新生血管生成，从而抑制肿瘤的生长和转移的发生。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了1、6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在制备血管生成抑制剂中的应用，其中，6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的结构式为式(I)：

优选的是，所述的6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的应用中，所述血管生成抑制剂在制备治疗视网膜病变的药物制剂中的应用。

优选的是，所述的6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的应用中，所述血管生成抑制剂在制备治疗类风湿性关节炎的药物制剂中的应用。

优选的是，所述的6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的应用中，所述血管生成抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化的药物制剂中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

通过实验证明，6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺可以有效地降低糖尿病人的视网膜病变神经损伤，治疗类风湿性关节炎以及动脉粥样硬化。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用。

构建原型小鼠关节炎动物模型，研究6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺，以下简称化合物A，对小鼠胶原诱导性关节炎(CIA)的治疗作用。采用小鼠作为受试动物，SPF级DBA/1小鼠90只(由上海西普尔-必凯实验动物有限公司)提供，雄性，7-8周龄，体重18-22g，随机分成6组，分别是正常对照组、模型对照组、化合物A低中高(0.3、0.6、1.2mg/kg)3个剂量组和阳性药物(甲氨蝶呤2mg/kg)对照组。

除正常对照组外，实验第0天，6个实验组均建立小鼠CIA模型，方法是鸡软骨Ⅱ型胶原(cⅡ)用0.1mol/L醋酸溶液溶解成4mg/mL的溶液，于4℃冰箱中放置一夜。实验当天将醋酸溶解后的鸡软骨Ⅱ型胶原(cⅡ)与含4mg/mL结核分枝杆菌菌株H37Rv的完全弗氏佐剂(CFA)等体积充分乳化，制得第一乳化液，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮内每只注射第一乳化液50μL进行致敏，21d后将醋酸溶解后的鸡软骨Ⅱ型胶原(cⅡ)与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积充分乳化，制得第二乳化液，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮内每只注射第二乳化液50μL进行再次免疫。

造模第30d起皮下注射给药，化合物A低中高3个剂量组(0.3、0.6、1.2mg/kg)，每日两次，每次给药30mg，连续给药10d；阳性药物对照组(甲氨蝶呤2mg/kg)，每五天一次，每次给药30mg，连续3次；正常对照组和模型对照组(生理盐水)，每日两次，每次注射30mg，连续10天。

分别于造模后第21天至第70天每3天称量体重、关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对小鼠胶原型关节炎的影响。

实验结果：造模后小鼠与正常小鼠相比，免疫后第27天，CIA小鼠足爪红肿，关节炎指数评分增高，模型组第42-55天为肿胀高峰，模型组第34天开始体重几乎不增加，后期略有下降。

化合物A在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用具体结果如下：

化合物A对小鼠胶原型关节炎左足足爪肿胀度的影响：阳性对照组、化合物A低中高剂量组左后足踝直径与模型组比较，均有极显著的差异(P<0.01)，实验结果具有统计学意义。化合物A对小鼠胶原型关节炎右足足爪肿胀程度的影响：阳性对照组、化合物低中高剂量组右后足踝直径与模型组相比，均有极显著差异(P<0.01)，实验结果具有统计学意义。化合物A对胶原型关节炎小鼠临床评分的影响：化合物低中高剂量组四肢评分明显低于模型对照组(P<0.01)，与模型对照组比较有极显著差异，实验结果具有统计学意义。化合物A对胶原型关节炎小鼠体重影响，化合物低中高剂量组体重显著高于模型对照组(P<0.01)，与模型组比较有极显著性差异，实验结果具有统计学意义。由此可知，化合物A对小鼠胶原型关节炎具有治疗作用。

实施例2

化合物A的体外药效试验

精确称取化合物A，加入二甲基亚砜完全溶解，实验前用培养液梯度稀释成所需浓度(二甲基亚砜最终浓度<0.1％)。

取第三代滑膜细胞以5×10⁴个/mL细胞密度接种于96孔细胞培养板中，48h后更换培养基并分别加入各浓度药物，使化合物A最终浓度为100、50、10、5、1、0.5M，同时设空白调零组(即只加培养液200μL/孔)、对照组、及甲氨蝶呤对照组(最终浓度分别为5、1、0.1μM)每组5个复孔。继续培养48h后每孔加入15μL质量浓度为5mg/mL的MTT后继续培养4h，吸净培养液，加入150μL二甲基亚砜，振荡10min，在酶标仪上于490nm测定OD值。

药物对滑膜细胞生长抑制率(％)＝(1-受试药物组平均OD值/对照组平均OD值)×100％

以上各组OD值均需减去空白调零组OD值。

用SPSS软件计算IC₅₀值，体外MTT法试验结果表明，化合物A具有很强的抑制成纤维样滑膜细胞的增殖活性，其IC₅₀值为5μM。

实施例3

3.1实验动物

选择出生1-3d的标准普通级SD大鼠，由广西中医药大学提供，符合国家医用动物使用标准，标准号为清洁级。

3.2SD大鼠视网膜神经细胞的原代培养及高糖模型的建立

3.2.1配制以下主要试剂

含10％胎牛血清培养液、葡萄糖、5-溴-2’脱氧尿苷、4％多聚甲醛、PBS磷酸盐缓冲液。

3.2.2多聚赖氨酸处理细胞培养瓶或培养板

为促进所培养的视网膜神经细胞的贴壁，于接种前预先用多聚赖氨酸处理细胞培养瓶或培养板。方法：于实验前一天，25mm²培养瓶加入100μg/mL多聚赖氨酸2.0mL，均匀覆盖瓶底，于37℃培养箱内过夜，吸除培养瓶内多聚赖氨酸，PBS洗三遍，放于37℃培养箱内干燥备用。拟行免疫荧光鉴定的细胞接种于6孔板，培养板中预先放置27mm×29mm的盖玻片，并如上所述方法用多聚赖氨酸提前处理。

3.2.3原代视网膜神经细胞悬液的制备

将出生1-3d的SD大鼠浸泡至75％酒精中进行消毒5min，超净工作台内无菌取眼球，于冰浴PBS(含青霉素100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素)洗3遍，显微镜下自角巩膜缘后约1mm处作环形切口，去除眼前节组织及玻璃体，钝性分离出视网膜神经上皮层，冰浴PBS漂洗2遍。显微眼科剪将取出的视网膜神经上皮层剪成约1mm²大小的组织块，收集于离心管内。加入约10倍体积的0.125％胰蛋白酶，37℃消化10-15min。含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，吸管轻轻反复吹打成单细胞悬液后400目不锈钢滤网过滤，1000r/min离心5min，收集细胞沉淀，含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞。细胞计数板进行细胞计数，调整细胞密度为1×10⁶个/mL。

3.2.4原代视网膜神经细胞的接种培养

细胞悬液制备好后将其接种于事先置有包被了多聚赖氨酸盖玻片的6孔板或者多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，置于37℃、5％的CO₂培养箱培养。当培养24h时加入终浓度为20μg/mL的5-溴-2’脱氧尿苷以抑制非神经细胞的生长，48h时换液，此后每2-3d换液一次。

3.2.5高糖模型的建立

将细胞悬液接种于24孔板中，细胞培养3d时，选择30mmol/L葡萄糖继续培养48h，观察细胞形态。

3.3实验分组及方法

①正常细胞培养组；②高糖损伤组；③化合物A保护组(70μmol/L)。

第①组取原代视网膜神经细胞正常培养，第②组取高糖模型的视网膜神经细胞进行培养，第③组取高糖模型的视网膜神经细胞并加入化合物A进行培养，培养时间在24h和48h时进行台盼蓝拒染实验计算细胞存活率。具体步骤为：首先消化离心收集细胞，根据细胞量用适当的细胞重悬液重悬细胞，吸取100μL重悬的细胞至离心管中，加入100μL台盼蓝染色液，轻轻混匀，染色3min。吸取少量已染色的细胞，用细胞计数板计数，每个样品至少计数500个细胞。

细胞存活率＝(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数×100％。

3.4统计学处理

实验数据以Y±s表示，Y代表均值。采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。统计学方法采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。

3.5实验结果

该实验结果(见表1)显示：高糖作用下视网膜神经细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，化合物A保护组细胞凋亡率显著低于高糖损伤组(P<0.01)，显示化合物A能够抑制高糖损伤所致的细胞凋亡。

表1为化合物A对糖尿病性视网膜病变的视网膜神经损伤的影响

注：*表示与正常组比较P<0.05；**表示与正常组比较P<0.01，#表示与高糖组比较<0.01

实施例4

本发明通过细胞水平的研究及建立动脉粥样硬化模型等技术揭示了化合物A对动脉粥样硬化的作用。

本发明经口及静脉注射给予化合物A，可使动脉粥样硬化大鼠斑块面积/内膜面积(％)、内膜厚度(um)/中膜厚度(％)显著降低；MDA的含量显著降低(P<0.05)，SOD的含量显著升高，表明化合物A可治疗动脉粥样硬化。

材料与方法

4.实验材料

4.1动物和饲料

实验动物：健康大鼠，雌雄各半，体重(200.0±20)g。

饲料：基础饲料由江苏省实验动物中心提供；高脂饲料由2％的胆固醇、10％的猪油和88％的基础饲料组成，由江苏省实验动物中心加工完成。

4.2.实验方法：

4.2.1内皮细胞培养及化合物A作用研究

4.2.1.1建立高脂血清损伤的内皮细胞模型

取健康日本大耳白兔6只，每日饲喂高脂饲料(2％胆固醇，10％猪油，88％基础饲料)，4周后无菌条件下心脏取血5mL，分离血清，合并，56℃水浴30min灭活处理，再以0.45及0.22双层微孔滤膜过滤后，-30℃冷冻保存备用。

4.2.1.2细胞培养和传代

将传代培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304培养于含20％小牛血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100g/L链霉素的DMEM培养基中。用0.25％胰蛋白酶液与0.02％EDTA(1:1)消化传代。接种于100mL培养瓶中，送入5％CO2培养箱中培养。以备实验用。

化合物A，临用前用无血清培养基稀释。

4.2.1.3分组

取对数生长期的细胞用于实验。细胞加处理因素前24h更换无血清培养基，使细胞同步化至G1期，然后随机分3组：对照组、高脂血清组、化合物A组30μmol/mL组(给药组)。其中对照组：加无血清DMEM培养基；高脂血清组：加含5％高脂血清DMEM培养基。

4.2.1.4MTT法检测细胞存活率

将生长良好的EVC304细胞制备成3×10⁷个·L^-1的细胞悬液，按每孔0.1mL接种于96孔板，37℃，5％CO₂温育24h，无血清同步化处理及分组同上。各组细胞作用24h后，每孔加入20μLMTT(5.0g·L^-1)，37℃孵育4h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜100μL，充分细胞存活率(％)＝处理组A₅₇₀/对照组A₅₇₀×100％。

4.2.1.5MDA和SOD含量测定

细胞分组及处理同上。作用24h后弃去上清液，用PBS洗3次后每孔加入0.5mL细胞裂解液(150mmol/LNaCl，150mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，1％TritonX-100)，待细胞充分裂解后，参照MDA和SOD检测试剂盒说明书测定细胞MDA含量。

MDA即丙二醛，是自由基引起的脂质过氧化过程中生成的一种醛类物质。丙二醛可以作为交联剂促进核酸、蛋白质及磷脂的交联，改变生物大分子的功能。通过检测丙二醛的含量可以反映脂质过氧化的程度。SOD即超氧化物岐化酶，可以岐化超氧离子生成H₂O₂，哺乳类细胞含有SOD，SOD作用的重要意义在于清除H₂O₂和OH·的前身超氧离子，从而保护细胞不受毒性氧自由基的损伤。故SOD是人体防御内、外环境中超氧离子损伤的重要酶。MDA水平升高，SOD活性降低，即可引发氧化应激反应，导致细胞损伤甚至细胞死亡。

4.2.2化合物A对高脂动物的影响

4.2.2.1动物以基础饲料喂养1周，作为适应期。随机等分为3组：正常组、模型组、化合物A低剂量组(300μg/kg)。正常组喂以基础饲料100g·只^-1·d^-1；模型组及给药组喂以高脂饲料20g·100只^-1·d^-1，给药组每天经口或注射给予相应剂量的化合物A药物，连续给药20天。

4.2.2.2指标的测定

4.2.2.2.1主动脉斑块的病变分级

动物处死后，立即摘取主动脉(自心脏至髂动脉分叉处)，将其上的脂肪组织剔除，于背侧面纵行切开，用10％的甲醛溶液固定，苏丹IV染色，使斑块呈红色，铺平，照像。图像分析仪测定斑块面积及血管内膜总面积，并计算斑块/血管内膜面积比。

按以下规定进行分级：

0级：无病变

1级：病变占1％-25％；

2级：病变占26％-50％；

3级：病变占51％-75％；

4级：病变占76％-100％。

4.2.2.2.2血清MDA及SOD的测定

动物心脏采血，3000rpm·min^-1离心10min，取上清，用生理盐水稀释5倍，混匀待测。采用MDA试剂盒测定MDA含量及SOD活性。

实验结果

(1)化合物A对高脂血清损伤的内皮细胞细胞存活率的影响

高脂血清能显著降低内皮细胞的细胞存活率(P<0.01)，化合物A30μmol/mL能显著抑制高脂血清引起的细胞存活率的降低(P<0.01)。

表2为化合物A对高脂血清损伤的内皮细胞细胞存活率的影响

组别	正常组	模型组	化合物A组
				细胞存活率	91.2±1.3	43.4±4.8*	55.2±4.5#

与正常组相比*P<0.01；与模型组相比#P<0.01

(2)化合物A对高脂致动脉粥样硬化大鼠血清MDA、SOD的影响

与正常组相比，模型组血清中MDA的含量显著升高(P<0.01)，SOD活性显著下降；与模型组相比，化合物A组血清中MDA的含量显著降低(P<0.05)，SOD的含量显著升高(P<0.05)。

表3化合物A对高脂致动脉粥样硬化大鼠血清中MDA、SOD的影响

与正常组相比*P<0.01；与模型组相比#P<0.01。

(3)化合物A对高脂致动脉粥样硬化大鼠主动脉斑块的病变分级的影响

与模型组相比，化合物A组斑块面积/内膜面积(％)、内膜厚度(um)、内膜厚度/中膜厚度(％)均显著降低(P<0.05)。

表4化合物A对高脂致动脉粥样硬化大鼠主动脉斑块的病变分级的影响

组别	斑块面积/内膜面积(％)	内膜厚度/中膜厚度(％)
			模型组	34.4±5.5	34.23±2.3
化合物A组	23.9±3.5#	22.1±3.2#

与模型组相比#P<0.01

结论：化合物A能够显著抑制动脉粥样硬化，可以用来制备抗动脉粥样硬化药物。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (4)

1.6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在制备血管生成抑制剂中的应用，其中，6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的结构式为式(I)：

2.如权利要求1所述的6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的应用，其特征在于，所述血管生成抑制剂在制备治疗视网膜病变的药物制剂中的应用。

3.如权利要求1所述的6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的应用，其特征在于，所述血管生成抑制剂在制备治疗类风湿性关节炎的药物制剂中的应用。

4.如权利要求1所述的6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-N-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺的应用，其特征在于，所述血管生成抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化的药物制剂中的应用。