CN105407919A - 胃泌素肽免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种免疫原性组合物，其包括a.定向佐剂，其包括至少一种与TLR9配体和第一肽α-螺旋连接的抗-CD32部分；以及b.胃泌素-17肽免疫原，与卷曲到第一肽α-螺旋的第二肽α-螺旋连接，其中肽免疫原是以下任一种：(i)人胃泌素-17，包括SEQ？ID？1的氨基酸序列，或其包括SEQ？ID？2氨基酸序列的片段，或SEQ？ID？2的至少4个N-末端氨基酸；(ii)(i)的类似物，优选恒河猴或鼠科动物来源；与/或(iii)(i)或(ii)任一项的功能活性变体，在SEQ？ID？2的氨基酸序列中存在一个、两个、三个或四个点突变。本发明进一步提供一种用于制备该免疫原性组合物的试剂盒、含这种免疫原性组合物的疫苗及其医疗用途，如用于处理胃泌素依赖性疾病。

Description

胃泌素肽免疫原性组合物
本发明涉及包含胃泌素肽免疫原及与TLR9配体连接的抗-CD32部分(moiety)的免疫原性组合物，包含这种免疫原性组合物的疫苗及其在处理胃泌素依赖性疾病状况中的用途。
背景技术
癌症在医学上被称为恶性肿瘤，包括范围广泛的各种疾病，这些疾病全都涉及不受管制的细胞生长。在癌症中，细胞不受控制地分裂和生长，形成恶性肿瘤，侵袭附近的身体部位。癌症还通过淋巴系统或血流向更远的身体部位扩散。并非所有肿瘤都是癌性的。良性肿瘤的生长不会不受控制，也不会侵袭附近组织和全身扩散。已知有200多种不同的癌症困扰人类。
确定癌症的成因是非常复杂的。人们知道许多东西会增加癌症风险，包括使用烟草、某些感染、辐射、缺乏体育锻炼、肥胖和环境污染。这些因素会直接损害基因或与细胞内已经存在的基因缺陷共同作用，引发疾病。大约有5％至10％的癌症完全是遗传的。
癌症可以通过许多方法检测，包括某些迹象和症状的存在、筛选试验或医学成像。一旦检测出可能患有癌症，即通过组织样本的镜检进行确诊。癌症通常采用化学疗法、放射疗法和外科手术治疗。这种疾病的幸存几率根据癌症的类型、位置及开始治疗时疾病的程度而有很大不同。虽然癌症会影响所有年龄的人，而且有一些类型的癌症在儿童中更常见，但是，患癌症的风险通常随年龄增加而增加。2007年，癌症导致世界范围内所有人类死亡的大约13％(790万)。由于老年人口增加及发展中国家大众生活方式的变化，比率正在上升。
由于免疫系统根据自身和非自身之间的区别，对其遇到的环境因素进行响应，因此，癌症发生所引起的许多类型的肿瘤细胞多多少少被患者本身的免疫系统所耐受，因为肿瘤细胞基本上是患者本身细胞非适当调控地生长、分裂和扩散。
免疫耐受或免疫学耐受是免疫系统不攻击抗原的过程。在自然或自身耐受时，机体对自身抗原并不引发免疫响应。它以三种形式出现：中枢耐受性、外周耐受性和后天耐受性。
中枢耐受性 1 ：
中枢耐受性发生在淋巴细胞发育期间，并在胸腺和骨髓中作用。在此处，识别自身抗原的T淋巴细胞和B淋巴细胞在其发育成为完全免疫活性细胞之前即被删除，防止自身免疫。该过程在胎儿期最为活跃，但是，由于不成熟淋巴细胞的产生而持续一生。
外周耐受性 2 ：
外周耐受性是T细胞和B细胞成熟和进入外周后发展出的免疫耐受性。离开胸腺的T细胞相对安全但并不完全安全。有些T细胞将具有响应自身抗原的受体(TCR)，所述自身抗原的浓度非常高，以致它们能够与T细胞在胸腺中未碰到的“弱”受体结合(例如，组织特异性分子，如胰岛、脑部或脊髓中的那些分子)。那些在胸腺中逃过胸腺内阴性选择的自身反应性T细胞会造成细胞伤害，除非它们被删除或被有效地封锁在外周组织中。已知有几种阻止这些潜在自身反应性T细胞的反馈机理。这些机理包括以下几种：无变应性、活化-诱导的细胞死亡、外周抑制。
后天或诱导耐受性 3 ：
后天或诱导耐受性指的是免疫系统对外部抗原的适应性，其特征在于，淋巴组织对其它情况下可能诱导细胞介导或体液免疫性的给定抗原具有特异性无反应性。其中最重要的自然后天耐受性之一是妊娠期的免疫耐受性，其中胎儿和胎盘必须被母体免疫系统耐受。
靶向肿瘤相关抗原的免疫疗法：
癌症免疫疗法是利用免疫系统来拒绝癌症。这种疗法的主要前提条件是刺激患者的免疫系统攻击引发疾病的恶性肿瘤细胞。这可以通过患者的主动免疫实现(例如，通过施用细胞癌疫苗，如美国华盛顿西雅图Dendreon公司的Provenge)4，在这种情况下，患者本身的免疫系统被训练，从而将肿瘤细胞识别为待破坏目标，或通过施用治疗抗体作为药物，在这种情况下，患者的免疫系统被募集，以通过治疗抗体破坏肿瘤细胞。另一种活化患者免疫系统对抗肿瘤的方法是利用所谓肿瘤相关抗原(TAA)，肿瘤相关抗原是在健康的正常细胞上有一定程度表达，但在肿瘤细胞上过表达的自身蛋白5。这些TAA经配制，以免疫原性方式在体内呈现，使得免疫系统可以建立响应，尽管这些蛋白是自身蛋白。显然，仅在患者已经出现了对TAA的外周耐受性或后天耐受性时，这种方法才有用。当识别TAA的T细胞和B细胞已经从免疫组库中删除时，不能采用癌症主动免疫疗法。
胃泌素：
可作为胃肠道癌(如胰腺癌)治疗靶的自体抗原实例有小胃泌素(G17)6-9。此外，由于胃泌素调节胃内pH，G17的中和作用亦对任何胃泌素相关疾病状况(包括胃溃疡、胃-食管返流病(GERD)10)有益，由于在ESRF患者中，胃泌素的循环浓度比正常浓度高，因此，亦对终末期肾功能衰竭(ESRF)11有益。
US5023077描述了治疗和预防胃和十二指肠溃疡疾病的免疫原性组合物及方法，其中的免疫原性组合物是基于胃泌素肽，胃泌素肽与免疫原性载体，如白喉类毒素、破伤风类毒素和钥孔戚血蓝蛋白或牛血清白蛋白结合。
在胃肠道中，胃泌素有几种重要作用，其中最重要的两种作用是刺激胃肠道内酸的分泌和刺激细胞的生长。这种激素至少以两种分子形式存在，即十七胃泌素(所谓的小胃泌素(“G17”))和三十四胃泌素(“G34”)，它们是根据每个分子中氨基酸残基(“AA”)的数量命名的，其中G17构成G34的17个氨基端(“N-末端”)残基。
US5609870描述了抗-G17免疫原的制备方法，在该方法中，在哺乳动物中产生抗其自身G17但不与G34反应的抗体，包括将肽通过其C-末端与间隔肽偶联，所述肽由与G17的N-末端氨基酸序列至氨基酸残基数12的片段对应的序列组成，所述间隔肽与免疫原性载体偶联，所述免疫原性载体如白喉类毒素、破伤风类毒素和钥孔戚血蓝蛋白或牛血清白蛋白。
免疫平衡：
Th1/Th2/Th17/Treg细胞调节的免疫平衡在免疫疗法的发展中起着非常重要的作用。
Th1细胞(1型辅助性T细胞)的特征在于产生促炎细胞因子如IFN-γ、IL-2和TNF-。Th1细胞参与细胞介导的免疫。Th1细胞产生的细胞因子刺激微生物病原的吞噬和破坏。有几种慢性炎性疾病已经被描述为Th1主导的疾病，即多发性硬化、糖尿病和类风湿性关节炎。
Th2细胞(2型辅助性T细胞)的特征在于产生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。Th2细胞被认为在过敏反应中起作用。细胞因子如IL-4通常刺激抗体的产生。IL-5刺激嗜酸性粒细胞响应，该响应也是免疫响应的一部分。遗传性过敏症和过敏症被认为是Th2主导的病状。
Th1/Th2或Th17/Treg免疫性的不平衡是各种免疫疾病的原因。
过敏症被认为是对环境中的蛋白质的过敏性反应。过敏原是遗传性过敏症患者以IgE抗体响应，随后导致过敏反应的抗原。复合或融合蛋白中的抗原可以是环境过敏源(如屋尘螨、桦树花粉、草花粉、猫抗原、蟑螂抗原)，或食物过敏源(如牛奶、花生、虾、大豆)，或它们的组合。鉴于其在效应细胞(肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)中的作用，IgE分子非常重要。人们通常认可的是，IgE还通过低亲和力受体(CD23)和高亲和力受体(FcεRI)，上调B细胞和树突状细胞(DC)的抗原捕获能力，从而在过敏性疾病的诱导期起着重要的作用。IgE抗体的负面作用可通过过敏源特异性IgG抗
体抵消，例如，因为它们指导免疫响应远离B细胞，指向单核细胞和DC。此外，它们与IgE分子竞争过敏源结合位点。因此，可以通过诱导过敏源特异性IgG分子处理、治疗和预防过敏源。
IgG分子的血清半衰期是大约三周，相比之下，IgE分子是大约三天。IgE分子由(初始)B细胞和Th2细胞之间的相互作用诱导，Th2细胞提供诱导记忆B细胞和浆细胞中类别转换至IgE必需的IL-4、IL-13及CD40L表达。相反，产生IFN-γ和IL-2的Th1细胞诱导IgG类别转换。因此，是Th1，而非Th2辅助性T细胞诱导对过敏源的响应，对于过敏性疾病的预防、处理和治疗是有益的。
在WO97/07218中，描述了过敏原-抗-CD32融合蛋白。在此公开文件中，绕开了分离特异性IgG分子及这些IgG抗体对CD32的亲和力低的问题，降低了利用完整的“IgE结合”过敏原的经典免疫疗法的风险因素。
WO2007098934A1描述了能够与TLR9和CD32结合的分子，其包括至少一个抗原的至少一个表位，其制备及其在医药，特别是在处理过敏症方面的用途。
TLR9的作用：
Toll样受体(TLR)是在先天免疫系统中起关键作用的一类蛋白质。它们是通常在岗哨细胞如巨噬细胞和树突状细胞的细胞表面上和内吞区室内表达的单一的跨膜非催化受体。TLR识别病原相关分子(来源于微生物的结构上保守的分子)模式(PAMPs)和启动信号发送，诱导产生先天免疫和随后的适应性免疫必需的细胞因子。
不同的TLR表现出不同的表达模式。这种基因优选在富含免疫细胞的组织，如脾、淋巴结、骨髓和外周血白细胞中表达。
人类和小鼠中共鉴定了13种TLR(简单地命名为TLR1至TLR13)，并且已经在其它哺乳动物品种中发现了多种这些TLR的相当形式。但是，并非小鼠中的每种TLR受体也都在
人类中发现，反之亦然。此外，并非每种TLR受体，人们都了解其配体和功能，例如，TLR10是一种功能未知的孤儿受体。
TLR受体的活化已经用于治疗各种疾病，例如，已经表明，医药产品引起的TLR9活化对治疗过敏症和肿瘤有好处。小鼠和人类中的研究表明，TLR9的天然配体是DNA分子中的未甲基化CpG序列。与细菌基因组或病毒DNA相比，脊椎动物基因组上的CpG位点相对稀少(～1％)。TLR9被免疫系统的许多细胞表达，如树突状细胞、B淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤(NK)细胞。但是，在健康的人类中，TLR9的表达限于浆细胞样树突状细胞(pDC)和B细胞。这种表达是细胞内的，位于内体区室内，其作用是通过与CpG基序中富含的DNA结合，向免疫系统警示病毒和细菌感染。但是，据报道，在病理状态下，TLR9表达也在细胞表面发生12-14。
人们已经报道了许多不同的合成TLR9激动剂分子。激动剂配体(TLR9活化)分为三组：
由A类CpG，特别是CpG-A(D)15寡脱氧核苷酸(ODN)，亦称为“D”-型ODN组成的一组激动剂配体。这样的TLR9激动剂引起强烈的IFNa诱导和树突状细胞的最低成熟，在此被称为“1组”TLR9配体。其中一个实例是ODN221616：GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQID46)
由B类CpG，特别是CpG-B(K)15寡脱氧核苷酸(ODN)，亦称为“K”-型ODN组成的一组激动剂配体。这样的TLR9激动剂引起弱的IFNa诱导和树突状细胞的成熟，在此处亦称为“2组”TLR9配体。其中一个实例是ODN200617-18：
TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQID47)
由C类CpG，亦称为CpG-C15寡脱氧核苷酸(ODN)组成的一组激动剂配体。这样的TLR9激动剂诱导IFNa和不成熟树突状细胞的成熟，在此被称为“3组”TLR9配体。其中一个实例是ODNM36215：
TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(SEQID48)
到目前为止描述的所有TLR9配体都基于核苷酸。虽然对TLR9具有特异性的抗体已经进行了报道，并用于证明受体的存在和位置，但是，这些分子并未描述为TLR9的配体，没有关于任何TLR9活化或抑制活性的报道。
CD32的作用：
CD32在单核细胞/树突状细胞和B细胞上强烈表达，因此，这种分子设计用于将免疫响应定向于这些重要的免疫细胞，其目的是防止B细胞抗原呈递，同时促进特别是树突状细胞(DC)的抗原呈递，充分刺激时，后者会诱导针对抗原的Th1响应。至少有两种类型的DC：髓样树突状细胞(mDC)和浆细胞样树突状细胞(pDC)，这导致出现了DC1细胞和DC2细胞的新概念。在这种概念中，DC1细胞在抗原特异性刺激后促进诱导Th1细胞发育，DC2细胞支持Th2细胞的发育。单核细胞衍生的DC(或mDC)通常被认为是DC1类型，而pDC被认为是DC2类型。这两种类型的DC均表达CD32a，并将诱导抗原特异性T细胞响应；但是，并不保证结果将是Th1类型。事实上，在过敏性供体中，更可能是Th2响应。重要的是，pDC表达与CpG-ODN(含未甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODNs))结合的TLR9受体。pDC中这种受体的活化导致非常强烈地产生IFN-α和IL-12，促进Th1诱导并从而将潜在的DC2转化为DC1细胞。
因此，这些分子可将pDC中TLR9受体的活化与抗原特异性Th1细胞的特异性刺激和诱导相结合。
在肿瘤免疫疗法中，具体的目标是除了细胞毒素T淋巴细胞(CTL)外，采用肿瘤抗原特异性T辅助性1型(Th1)细胞。
卷曲螺旋：
卷曲螺旋由蛋白质中的结构基序组成，其中2-7个α-螺旋像多股绳子一样卷曲在一起；二聚体和三聚体是最常见的类型。卷曲螺旋已经用于稳定Fv抗体片段，形成异源二聚体卷曲螺旋结构域19。
发明内容
需要提供一种针对胃泌素和胃泌素依赖性疾病的改进免疫疗法。因此，本发明的目的是提供一种调节特异性胃泌素表位免疫响应的免疫原性、稳定性和结构改进的疫苗。
该目的通过要求保护的主题实现。
本发明提供一种免疫原性组合物，包括：
a.定向佐剂，其包括至少一种与TLR9配体和第一肽α-螺旋连接的抗-CD32部分；及
b.胃泌素-17肽免疫原，其与卷曲到所述第一肽α-螺旋的第二肽α-螺旋连接，其中肽免疫原是以下任一种：
(i)人胃泌素-17，包括SEQID1的氨基酸序列，或其包含SEQID2氨基酸序列的片段，或SEQID2的至少4个N-末端氨基酸；
(ii)(i)的类似物，优选恒河猴或鼠科动物来源；与/或
(iii)(i)或(ii)任一项的功能活性变体，在SEQID2的氨基酸序列中存在一个、两个、三个或四个点突变。
特别是，所述肽免疫原是线性肽，包括以下序列或由以下序列组成：
(i)SEQID3氨基酸序列，优选是SEQID4；
(ii)SEQID5氨基酸序列，优选是SEQID6；
(iii)SEQID7氨基酸序列，优选是SEQID8；或
(iiii)SEQID2或9氨基酸序列。
优选本发明的免疫原性组合物包括至少两个与第二肽α-螺旋连接的肽免疫原，优选包括2、3或4个肽免疫原。
当一个以上肽免疫原与第二肽α-螺旋连接时，肽免疫原可以例如相继与α-螺旋偶联，即将肽免疫原连成一排，例如，将第一肽免疫原的C-末端与第二肽免疫原的N-末端连接，其中第一肽免疫原和第二肽免疫原彼此相同或不同。替代地或额外地，可以通过交联在本发明的免疫原性组合物中纳入其它肽免疫原，例如，通过化学反应，如建立分子间交联的化学交联反应，例如，采用同源双功能试剂，如二甲基己二亚酰胺化物(DMA)、二甲基辛二亚酰胺化物(Dimethylsuberimidate)(DMS)或戊二醛，将彼此相同或不同的两个或多个肽免疫原与同一α-螺旋连接。例如，可以采用戊二醛交联，分别利用α-螺旋的游离赖氨酸基团或间隔子/接头实施这种交联。从而，本发明使用的两个或多个肽免疫原与α-螺旋平行或并排连接。
根据本发明的一个具体方面，所述第一α-螺旋和第二α-螺旋每个包括氨基酸基序的3-5个氨基酸重复序列，它们彼此特异性结合，Kd小于10-6M，优选Kd小于10-7M，更优选Kd小于10-8M或10-9M。
根据本发明的其它方面，所述抗-CD32部分选自抗-CD32抗体、抗体片段和肽，优选靶向CD32a。特别是，抗体片段可以是，例如Fab、Fv、scFv、dAb、F(ab)2或Fcab片段，或任何其它可能的结合实体，只要其与受体特异性结合，在结合后内在化即可。
特别是，所述抗-CD32部分靶向CD32a，优选具有高亲和力，Kd≤10-6M，更优选小于10-7M或小于10-8M。
更特别地说，所述抗-CD32部分是特异性或选择性CD32a结合物，即不靶向CD32b或靶向CD32b的亲和力低，Kd＞10-6M，优选高于10-5M，更优选高于10-4M。结合CD32a和CD32b的差分亲和度优选Kd值相差较高，相差至少1log，更优选相差至少2log或至少3log。
抗-CD32部分与CD32a结合而不与CD32b结合的特别优选高亲和力或高差分亲和度通常用于进一步采用激动性TLR9配体的免疫刺激疫苗。
抗-CD32部分特异性靶向CD32a或CD32b中的任一个，或CD32a和CD32b两者的结合亲和力，可以采用合适的试验测定，例如，采用典型的ELISA方法，该方法采用市售涂覆到Ni-NTAELISA板上例如，Ni-NTAHisSorb板上的CD32a和CD32b的HIS-标记重组体形式(奥地利Qiagen公司)。抗-CD32部分可以是生物素化的，因此可以采用链霉亲和素-HRP或链霉亲和素AP和合适的底物检测。或者，这些部分可以采用FACS试验，采用表达CD32a但不表达CD32b的U937细胞(如ATCC：CRL1593)和表达CD32b但不表达CD32a的EBV转化B细胞，如vanReijsen等人20所描述的CFB4:2进行测试。
根据本发明的另一个具体方面，所述TLR9配体是TLR9激动剂，选自A、B和C类CpG寡脱氧核苷酸或模拟任何CpG寡脱氧核苷酸的免疫刺激肽。
根据本发明的具体方面，TLR9配体是选自A类CpG，特别是CpG-A(D)17寡脱氧核苷酸(ODN)，亦称为“D”-型ODN的TLR9激动剂。这种TLR9激动剂引起强烈的IFNa诱导和最少的树突状细胞成熟，在此被称为“1组”TLR9配体。
根据本发明另一个具体方面，TLR9配体是选自B类CpG，特别是CpG-B(K)21寡脱氧核苷酸(ODN)，亦称为“K”-型ODN的TLR9激动剂。这种TLR9激动剂引起弱的IFNa诱导和树突状细胞成熟，在此被称为“2组”TLR9配体。
根据本发明的另一个具体方面，TLR9配体特别是选自C类CpG，亦称为CpG-C15；21寡脱氧核苷酸(ODN)的TLR9激动剂。这种TLR9激动剂诱导IFNa和不成熟树突状细胞的成熟，在此被称为“3组”TLR9配体。
IFNa的诱导可通过IFNa表达水平及相对于参照水平的相应增加测定。相对非刺激细胞的增加可与1、2或3组TLR9配体定义的每种CpG类型建立的参照引起的诱导水平进行对比，通常是各参照水平的30％至300％，优选至少100％，更优选是至少120％，至少150％，至少200％或至少250％。
不成熟树突状细胞的成熟可通过CD80、CD83和CD86中任一个标记物的表达水平确定。相对未刺激细胞的各增加可与1、2或3组TLR9配体定义的每种CpG类型建立的参照引起的诱导水平进行对比，通常是各参照水平的30％至300％，优选至少是100％，更优选是至少120％，至少150％，至少200％或至少250％。
特别是，1组和3组TLR9激动剂将导致IFNa表达增加，2组和3组TLR9激动剂将导致任一个DC成熟因子CD80、CD83和CD86表达增加。TLR9拮抗剂将导致IFNa表达减少及任一个DC成熟因子CD80、CD83和CD86表达减少，甚至在存在1-3组任一组TLR9激动剂时也如此。
作为上述多核苷酸TLR9配体的替代，可以使用具有激动效应的任何其它TLR9结合物，例如，肽结合物或蛋白结合物，包括抗体或抗体片段。
根据本发明的其它具体方面，免疫原性组合物包括一个或多个接头序列，优选由甘氨酸与/或丝氨酸与/或赖氨酸残基组成，优选SEQID12或13氨基酸序列。接头序列可以是线性的或支化的，例如，以在两个或多个肽或多肽实体之间提供连接或交联。
根据本发明的另一个具体方面，免疫原性组合物包括SEQID10或SEQID11的氨基酸序列或由SEQID10或SEQID11的氨基酸序列组成。
根据本发明，进一步提供一种包括本发明免疫原性组合物和药学上可接受的载体的疫苗。这种疫苗通常是免疫刺激疫苗，例如，刺激体液和T-细胞(Th1)免疫响应。
根据一个优选的实施例，体液和T-细胞(Th1)免疫响应是瞬时的，例如，疫苗接种后诱导的IgG特定最高滴度通常在接种后2至8周实现，然后在接种6个月内，优选在5个月内，或4个月内，或3个月内，或2个月内，滴度减少至少30％，优选至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或高达100％。在加强注射之后，减少的滴度可再次增加。在一系列疫苗接种中，可以在最后一次注射免疫原性组合物或疫苗后确定这种瞬时免疫响应。这种瞬时免疫响应的优点是治疗可控，例如，可以根据需要中断或停止治疗。根据本发明，进一步提供一种制备本发明免疫原性组合物的试剂盒，包括下述组分：
a.定向佐剂，其包括至少一种与TLR9配体和第一肽α-螺旋连接的抗-CD32部分；及
b.胃泌素-17肽免疫原，其连接至与第一α-螺旋匹配的第二肽α-螺旋，其中肽免疫原是以下任一种：
(i)人胃泌素-17，包括SEQID1的氨基酸序列，或其包含SEQID2氨基酸序列的片段，或SEQID2的至少4个N-末端氨基酸；
(ii)(i)的类似物，优选恒河猴或鼠科动物来源；与/或
(iii)(i)或(ii)任一项的功能活性变体，在SEQID2的氨基酸序列中存在一个、两个、三个或四个点突变。
该试剂盒可特别用于利用预先形成的定向佐剂组分，与根据主体(subject)组或单个主体的需要提供的免疫原组合，方便疫苗的制备。
根据本发明，进一步提供用于处理患胃泌素依赖性疾病或病症主体的免疫原性组合物。这些疾病或病症主要是主体体内产生或过量产生内源性胃泌素引起的或与其有关。胃泌素依赖性疾病或病症特别地包括胃泌素依赖性肿瘤或胃泌素依赖性癌症，如胰腺癌，或胃肠道癌、胃溃疡、胃食管返流疾病(GERD)、终末期肾功能衰竭(ESRF)或肥胖病。
因此，本发明特别提供一种通过向主体施用有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗，处理患胃泌素依赖性疾病主体的方法，所述胃泌素依赖性疾病如胃泌素依赖性肿瘤或胃泌素依赖性癌症，如如胰腺癌，或胃肠道癌、胃溃疡、胃食管返流疾病(GERD)、终末期肾功能衰竭(ESRF)或肥胖病，处理可以是预防性的，例如，防止疾病或病症爆发或疾病进展，或治疗性的，如改善疾病或病症。
特别是，采用初免-加强策略，向主体施用有效量的组合物。特别是，有效量是每次施用0.0001至2mg，优选每剂0.001至2mg。
根据本发明的一个具体实施例，主体进一步接受化学疗法处理，例如，在治疗胃泌素依赖性癌症期间。
特别是，本发明的免疫原性组合物在主体体内触发保护性免疫响应，优选抗人胃泌素-17的血清IgG滴度是至少1/1000，优选至少1/104，优选至少1/105，优选至少1/106或更低，从而，在较高稀释度时可以检测出来。
附图说明
图1是食蟹猴的抗体(IgG诱导)。在d0、d14和d28三次注射疫苗(TYG100_2RM)后的IgG抗G17诱导-时间曲线。可以看出明显的抗ScFV-螺旋1、G17RM和G17H的IgG诱导。抗类似分子量的对照肽或动物采用G17RM_2免疫，但不存在弹头时，未看到任何响应。最后一次免疫后4周，所有特异性IgG滴度均下降，表明要保持IgG水平，必须进行加强注射。此外，天然G17RM的存在并不会增强响应，而且，由于抗G17RM的IgG下降幅度明显高于ScFV-螺旋1的，因此，可以得出结论，诱导的免疫响应是可逆的。
图2表明了抗-胃泌素免疫接种后出现体重下降。免疫接种TYG100_2RM的6只动物中有4只表现出显著的时间依赖性体重下降。动物管理员观察到，这些动物对下午的小吃失去食欲，但对每天正常的食物并没有失去兴趣。采用其它疫苗时，从未出现过这种现象，因此，本发明的抗胃泌素疫苗可用于控制肥胖病。
图3表明了以下序列的序列信息：
SEQID1：人小胃泌素，G17；
SEQID2：人胃泌素肽，小胃泌素的前(N-末端)12AA(氨基酸)，G12；
SEQID3：小胃泌素的N-末端表位，前(N-末端)4AA，包括带点突变的特异性功能活性变体；
SEQID4：小胃泌素的N-末端表位，前(N-末端)4AA，包括带点突变的多个特异性功能活性变体；
SEQID5：小胃泌素的N-末端表位，前(N-末端)12AA，包括带点突变的特异性功能活性变体；
SEQID6：小胃泌素的N-末端表位，前(N-末端)12AA，包括带点突变的多个特异性功能活性变体；
SEQID7：小胃泌素的N-末端表位，前(N-末端)13AA，包括带点突变的特异性功能活性变体；
SEQID8：小胃泌素的N-末端表位，前(N-末端)13AA，包括带点突变的多个特异性功能活性变体；
SEQID9：人胃泌素肽，小胃泌素的前(N-末端)13AA(氨基酸)，G13；
SEQID10：TYG100_1H的免疫原组分：本发明的免疫原性组合物的一部分，包括一个SEQID9的人胃泌素肽、一接头序列和一肽α-螺旋(TYG100_1H)。这部分可通过卷曲螺旋连接与合适的定向佐剂连接。
粗体是肽免疫原，斜体是接头，下划线是螺旋。
SEQID11：TYG100_2H的免疫原组分：本发明的免疫原性组合物的一部分，包括两个SEQID9的人胃泌素肽、一支化接头序列和一肽α-螺旋(TYG100_2H)。这部分可通过卷曲螺旋连接与合适的定向佐剂连接。
粗体是肽免疫原，斜体是接头，下划线是螺旋。
SEQID12：线性接头序列；
SEQID13：支化接头序列。
具体实施方式
整个说明书使用的特定术语的意思如下。
本文使用的词语“佐剂”指的是疫苗的集成或共同施用组分，其：
-增强对特定免疫原，如抗原或半抗原的免疫响应。该免疫响应通常大于没有佐剂时等量免疫原性组合物引起的免疫响应，
与/或
-佐剂用于引导抗免疫原的特定类型或类别的免疫响应，例如，Th1或Treg型免疫响应，此处理解为“定向佐剂”。
本发明佐剂的“有效量”特别指的是增强对免疫原的免疫响应的量，使得，例如，降低或减少产生指定类别高效免疫响应所需的免疫原性组合物的剂量。
本发明的定向佐剂不仅调节高效的免疫响应，而且还以期望的方式调节免疫响应。通过将免疫原引导到合适的免疫细胞，使其实现内化并进一步处理，诱导Th1免疫响应而非Th2免疫响应，特别是采用的TLR9配体是3组TLR9激动剂时。如果将1组TLR9激动剂与结合CD32b的抗-CD32部分一起使用，通常预期诱导Treg细胞。
“有效量”的免疫原性组合物，例如本发明疫苗中使用的“有效量”的免疫原性组合物指的是当其作为疫苗接种施用方案的一部分施用时足够在接受处理的主体体内显示有意义的益处的量。熟悉本领域的技术人员应该理解的是，在一些实施例中，如果特定的组合物包含的量适合特定接种方案中施用的单位剂量，尽管如果按单一单位剂量施用时这个量可能不足够实现有意义的益处，亦可认为其包含预防或治疗有效量。那些熟悉本领域的技术人员将进一步理解的是，免疫原性组合物的有效量可能因接受该组合物的主体不同而不同，例如，取决于期望的生物学终点、组合物的性质、施用途径、接受处理的主体的健康状况、体型与/或年龄等因素。在一些实施例中，有效量是当其作为特定施用方案的一部分施用时与有益效果相关的量，例如，单次施用或例如在“加强”方案中的一系列施用。
本发明中使用的词语“肽α-螺旋”应指的是基于包括多个重复序列(亦称为螺旋重复序列)的肽序列的卷曲结构基序。这种α-螺旋能够与另一对应部分结合，亦称为与同一类型的α-螺旋匹配，形成二聚体、三聚体或进一步形成低聚物，亦称为卷曲螺旋。
卷曲螺旋是多肽或肽中的结构基序，其中两个至七个α-螺旋像多股绳子一样卷曲在一起。在一些实施例中，疫苗的卷曲螺旋是两个α-螺旋卷曲在一起。正如采用合适的卷曲螺旋相互作用结合试验测定的，这种α-螺旋区可能形成卷曲螺旋结构，并且可能参与螺旋重复序列的低聚反应。
特别是，使两个单体接触，可以形成α-螺旋二聚体，从而二聚体是通过两个α-螺旋卷曲螺旋域相互作用形成的。在一些实施例中，螺旋包括具有SEQIDNO：14或16(螺旋和反螺旋)给出的氨基酸序列的肽，其中包括x个重复序列。
EVSAL(SEQID14)
E5：EVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK-NH2(SEQID15)
KVSAL(SEQID16)
K5：KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE-NH2(SEQID17)
或者，可以使用Chao等人22或Litowsky等人23；24描述的任何序列或产生特定卷曲螺旋类型连接的任何功能相当序列，如下表中所示的序列，包括它们的变体，例如，具有不同数量的重复序列，或在螺旋类型中有一个、两个或三个点突变：
对于本发明的目的，优选的卷曲螺旋类型是二聚体，可以是两个在螺旋重复序列中至少有一个氨基酸不同但相匹配的螺旋的异源二聚体(异源螺旋)，或者是两个相同的匹配螺旋的同源二聚体，即包括匹配螺旋重复序列(“螺旋”)的那些。
螺旋重复序列的优选数量是3-5，优选是3+3、3+4、3+5、4+4、4+5、5+5、4+3、5+3或5+4的任一组合。
作为七聚重复序列(氨基酸序列的重复序列由7个氨基酸组成，7-聚体)的替代，也可以使用6-聚体、8-聚体或9-聚体。
若使用同源二聚体卷曲螺旋，螺旋重复序列的典型数量特别是不超过5，从而避免不期望看到的结构不匹配。若为异源二聚体卷曲螺旋，通常需要采用至少3个螺旋的肽序列长度。从而，疫苗各组分，即定向佐剂与免疫原组分彼此结合，通常优选以Kd小于10-7M的高亲和力实现，更优选小于10-8M或10-9M。但是，虽然重复序列多可以增加亲和力，但是，这样做的代价是同源二聚作用增加。
本发明的免疫原性组合物的组分还包括间隔肽，从而分别将抗-CD32部分与/或TLR9配体，任选还有(肽免疫原的)表位与螺旋重复序列连接。例如，间隔肽可以在卷曲螺旋的任一端或两端。每个间隔肽可以附着到卷曲螺旋的单个α螺旋卷曲螺旋的卷曲螺旋域。
间隔肽可以是，例如，5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸或更多氨基酸的肽，或线性或支化，例如，以提供两个、三个、四个或多个支链。间隔肽中氨基酸的数量可以是，在一些实施例中，20个氨基酸或不超过10个氨基酸，或更多或更少，这取决于具体的序列和螺旋的长度。
本发明使用的词语“抗-CD32部分”指的是与细胞靶CD32特异性结合的配体，与CD32a、CD32b中任一个结合，或与CD32a和CD32b两者都结合。该部分可以是任何结合结构，如源自蛋白质、多肽或肽，包括抗体和抗体片段或带结合部分的复合分子。本发明分子或分子复合物的结合部分可以由蛋白质组成，如抗体或抗体片段，如Fab、Fv、scFv、dAb、F(ab)2、微抗体、小突变免疫球蛋白域，或其它生物结合物，如可溶T-细胞受体，Darpins等。可以产生和选择抗体和抗体片段和衍生物，采用人们熟悉的方法，例如，杂交瘤技术、B-细胞克隆、噬菌体展示、核糖体展示或抗体库的细胞表面展示、变体抗体的阵列筛选，与CD32结合。抗-CD32部分的示范例有源自抗CD32单克隆抗体AT-1025、IV.326、2E127或任何其它aCD32单克隆抗体的scFv。
特异性结合可采用合适的结合试验，如常规免疫试验进行确定。本领域熟悉的在免疫试验中检测结合的方法有许多种。可以采用本领域熟悉的各种免疫试验，包括采用技术如放射性免疫试验、ELISA(酶联免疫吸附测定)、免疫放射测定试验、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散试验、蛋白质印迹法、BIAcore等的竞争性和非竞争性试验系统。
本发明相对于抗原或抗体使用的词语“交叉反应”指的是不同来源，例如，来源于人类、恒河猴或小鼠的抗原之间共有的表位。人们发现，包括G17前4AA或由其组成的N-末端表位在各种来源的肽中具有交叉反应性，其中表位触发免疫响应及与表位交叉反应的IgG抗体。
本发明的免疫原性组合物特别用于处理与过量胃泌素有关的胃泌素依赖性疾病或病症，例如，胃泌素依赖性肿瘤或胃泌素依赖性癌症，如胰腺癌，胃溃疡、胃食管返流疾病(GERD)、终末期肾功能衰竭(ESRF)或肥胖病。
本发明使用的词语“胃泌素依赖性肿瘤”或“胃泌素依赖性癌症”应指的是与胃泌素相关的肿瘤或疾病或病症，例如，胃泌素依赖性结直肠腺癌和其它胃泌素依赖性癌症，如胃癌、肝癌、胰腺癌和小细胞肺癌。该词语在本文中特别是相对于处理肿瘤，预防肿瘤疾病进展、实现肿瘤正响应或肿瘤收缩时使用。该词语亦适用于最小化可以成功处理的残留疾病，例如，靶向循环肿瘤细胞，以将其数量减少到某一阈值以下，例如，检测限以下。
胃溃疡疾病可由胃酸增加和正常防止胃粘膜受酸损伤的复杂的胃防御崩解引起。虽然这两种状况的病因学不同，但是，两者都可以从胃酸分泌减少中受益。胃酸是在专门的胃细胞–壁细胞中产生的。在乙酰胆碱、组胺和胃泌素与细胞表面上的特异性受体结合时，这些化合物刺激壁细胞，分泌出酸。在这些物质中，最有效的酸分泌刺激剂是肽激素胃泌素。本发明所描述的抗-胃泌素免疫疗法将改善胃溃疡的病状。
本发明使用的词语“胃泌素-17肽”或“G17肽”或“G17”指的是小胃泌素G17，它由胃泌素的N-末端17AA组成。G17肽可以来自人类或其它哺乳动物，包括恒河猴或小鼠，从而，具有人或其它哺乳动物的序列，或可以是人工构建体，例如，纳入人工序列，如通过改变天然(天然存在的)G17序列中氨基酸残基的类型与/或序列得到的人工序列。该词语应特别包括人G17的变体，这些变体具有SEQID1氨基酸序列，或其片段，但是，不同于其肽序列，不同之处在于，其是来源于不同物种的同源序列。这些都称为天然存在变体或类似物。词语“类似物”还指的是源自两个或多个来源的嵌合构建体，其中至少一部分是天然存在的，例如，其构成肽免疫原的主要部分(至少50％)，而且，另一部分与其不同，或者是天然存在的或者是合成的(人工的)。
该词语应特别包括G17的片段或功能活性变体，例如，包括一个或多个点突变的那些，或除G17以外还包括其它氨基酸序列的其它肽或多肽，例如，通过增加一个或多个氨基酸残基或序列，延长N-末端与/或C-末端。C-末端的延长，例如优选采用G17序列的相同的或不同的重复序列，或者采用胃泌素其它氨基酸序列。
该词语应特别包括带一个或多个修饰氨基酸残基的肽。常见修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化、酰胺化、形成吡咯烷酮羧酸、异构化、羟基化、硫酸盐化、黄素-结合、半胱氨酸氧化和亚硝基化。此处描述的示范性修饰是G17的N-末端谷氨酸的修饰，即位置1处的pyroGlu，亦称为“吡咯烷酮羧酸(Glu)”或pGlu或pE。
本文相对于本发明的肽免疫原使用的词语“功能活性变体”指的是，例如，通过插入、删除或替换一个或多个氨基酸，例如，通过重组技术或在氨基酸序列中化学衍生一个或多个氨基酸残基，或编码核苷酸序列中的核苷酸，或在序列的任一个或两个远端的核苷酸，对这个序列(母序列)进行修饰得到的序列，这种修饰并不影响(尤其是不会削弱)该序列的活性。在肽免疫原引起对靶胃泌素的某种免疫响应时，肽免疫原的功能活性变体将仍然包括抗原决定簇或表位，尽管这可以改变，例如，从而增加免疫原性。特别是，G17肽免疫原，或其片段(如G12或G13片段)的功能活性变体具有在接受处理主体中引起IgG抗-胃泌素抗体的效力，这些抗体与主体的内源性胃泌素交叉反应。
功能活性变体可以通过，例如，改变母肽(parentpeptide)的序列得到，母肽的序列如人、恒河猴或鼠科动物的G17肽，或其片段，如G12或G13肽，通过引入一种或多种基本上不会损害交叉反应性表位的修饰，得到具有基本上相同的免疫原性的分子。此处使用的词语“基本上相同的免疫原性”指的是用免疫原性组合物处理的主体中诱导的免疫响应或抗-胃泌素IgG抗体量优选是母肽测定量的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少100％或至少110％，或至少120％，或至少130％，或至少140％，或至少150％，或至少160％，或至少170％，或至少180％，或至少190％，例如，高达200％。
在优选的实施例中，母肽的功能活性变体是
a)源自至少一个氨基酸替换、插入(增加)与/或删除的肽，例如，包括一个或多个点突变，其中功能活性变体具有与母分子相同的特定序列，如至少50％序列一致性，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％；与/或
b)由这种肽及另外至少一个与该肽异源的氨基酸组成。
功能活性变体可通过肽序列中的序列改变得到，例如，通过一个或多个点突变，当在本发明中使用时，其中所述序列改变基本上保留了未更改肽序列的功能。这种序列改变或点突变包括但不限于，(保守)替换、增加、删除、突变和插入，例如，改变1、2、3或4个氨基酸，或增加或插入一个至数个氨基酸，如1、2、3或4个氨基酸中，或化学衍生一个至几个氨基酸，如1、2、3或4个氨基酸，或以上的组合，优选非邻接的点突变。氨基酸残基的替换可以是保守替换，例如，将一个疏水氨基酸替换成另一个疏水氨基酸。
保守替换是那些在其侧链和化学性质方面相关的氨基酸家族内发生的替换。这些家族的实例有具有碱性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有非极性芳香族铡链的氨基酸、具有不带电的极性侧链的氨基酸、具有小侧链的氨基酸及具有大侧链的氨基酸等。
优选的点突变指的是相同极性与/或电荷的氨基酸的交换。在此方面，氨基酸指的是六十四个三联体密码子编码的20种天然氨基酸。这20种氨基酸可以分成具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
下面给出了“中性”氨基酸及其各自的三字母和单字母的代码和极性：
丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；
天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；
半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；
谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；
甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；
异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；
亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；
蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；
脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；
丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；
苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；
色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；
酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；
缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；及
组氨酸：(His，H)极性，带正电荷(10％)，中性(90％)。
带“正”电荷的氨基酸有：
精氨酸：(Arg，R)极性，带正电荷；及
赖氨酸：(Lys，K)极性，带正电荷。
带“负”电荷的氨基酸有：
天冬氨酸：(Asp，D)极性，带负电荷；及
谷氨酸：(Glu，E)极性，带负电荷。
此处相对于所述肽序列描述的“氨基酸序列一致性的百分数(％)”定义为在比对序列和引入缺口(如果需要的话)，以实现最大的序列一致性百分比，并且任何保守取代并不视为序列一致性的一部分时，候选序列中与特定肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。熟悉本领域的技术人员能够确定衡量比对的合适参数，包括相对于待比较序列的全长实现最大比对所需的任何算法。
可以采用人们熟悉的任何突变方法，包括在要求位置处的点突变，如通过随机化方法，得到功能活性变体。在某些情况下，随机选择位置，例如，采用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化肽序列。在这方面，词语“突变”指的是本技术领域认可的改变多核苷酸或多肽序列的任何技术。
此处使用的词语“免疫原”或“肽免疫原”应指的是肽结构的抗原或免疫原，特别是，包括特定氨基酸序列的肽或由特定氨基酸序列的肽组成的免疫原，肽作为线性肽或支化肽提供，包括天然氨基酸残基或修饰氨基酸残基，例如，通过修饰或化学衍化，如通过磷酸化、甲基化、乙酰化、酰胺化、形成吡咯烷酮羧酸、异构化、羟基化、硫酸盐化、黄
素-结合、半胱氨酸氧化和亚硝基化得到的衍生物。
肽免疫原特别设计用于在患者体内触发免疫响应，并特别地包括一个或多个可被抗体的结合位点识别或能够与HLAI类或II类分子或其它抗原呈递分子(如CD1)的肽槽结合的抗原决定簇，从而，可作为特异性T细胞的刺激剂。靶抗原作为整个靶分子或作为这种分子的片段被识别，特别是子结构，如靶的多肽或碳水化合物结构，通常被称为“表位”，例如，B-细胞表位、T-细胞表位，这些都是免疫学相关的，即也可以被天然或单克隆抗体识别。在本发明中，优选使用B细胞表位。
本发明所用的词语“表位”应特别指的是完全构成抗体结合位点特异性结合伴侣或特异性结合伴侣一部分的分子结构。从化学上来说，本发明的肽免疫原的表位可以是通常包括至少3个氨基酸残基，优选4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸的肽表位。肽的长度不存在任何临界上限，甚至可以包括蛋白质的全长氨基酸序列。
根据本发明，可以使用相同抗原或不同抗原的一个或多个表位。
本发明的肽免疫原特别理解为自身抗原。本发明使用的词语“自身抗原”指的是不引发这种免疫响应的健康正常的主体产生的任何抗原，特别是多肽或肽。在某些疾病(包括癌症)状态中，这些自身抗原的水平异常或很高，所以称为肿瘤相关抗原(TAA)。在本发明中，人胃泌素或人G17理解为人主体的自身抗原，特别是患有胃泌素依赖性肿瘤的主体中的TAA。
应该理解的是，本发明使用的自身抗原可以是天然的、重组的或合成的。还应该理解的是，自身抗原不必与天然产生的抗原相同，而是可以包括具有一定序列一致性、类似性或同源性的变体。
本发明疫苗中使用的肽免疫原或免疫原性组合物通常以有效量包括在疫苗中，在本发明中，有效量特别理解为“免疫学有效量”。“免疫学有效量”指的是向主体施用此量，不管是单一剂量或作为系列剂量的一部分施用，对于治疗或预防目标是有效的。这个量将随待处理患者的健康和体质状况、年龄、主体的免疫系统合成抗体的能力、期望的免疫响应程度、疫苗配方及其它条件而异。
本发明还提供一种处理主体或提高主体免疫响应的方法，包括施用免疫学有效量的本发明的肽免疫原、免疫原性组合物或疫苗。
向需要的主体施用例如，成人主体施用的免疫原性组合物的有效量或剂量可以是0.0001至2mg，例如，0.001至2mg。例如，在免疫接种后1-3个月，有效剂量的免疫原性组合物能够在患者体内引起结合和中和内源性成熟和前体G17的有效抗体滴度水平的免疫响应。疗法的有效性可通过主体血液样本中的抗-胃泌素抗体滴度来测定。
本发明中使用的词语“TLR9配体”应按下述方式理解。
Toll-样受体9(TLR9)识别未甲基化的细菌CpGDNA并引发信号级联，导致产生促炎细胞因子。有许多结构或序列已经证明可充当TLR9的配体，即与此受体结合，从而激活(刺激、上调、TLR9激动剂)TLR9或使TLR9失活(下调、TLR拮抗剂)。例如，微生物DNA或合成DNA，例如，合成CpGODN可以通过CpG二聚体数量和位置变化，以及CpG二聚体旁侧精确的碱基序列刺激TLR9。合成CpGODN与微生物DNA的不同之处在于，它们具有部分或完全磷硫酰化骨架而非典型的磷酸二酯骨架，而且在3'端、5'端或这两端可能具有或不具有聚G(polyG)尾。本发明中与TLR9配体一起使用的词语“激动剂”应特别指的是在基于细胞的试验中TLR9的结合和活化。
由核苷酸序列组成的TLR9配体通常通过化学偶合，例如，采用商业上可购买的Solulink的KIT，与本发明的免疫原性组合物的定向佐剂组分偶合。肽TLR9配体可采用标准肽化学偶合或可采用重组DNA技术整合。
示范性TLR9配体有ODN221628(1组)、ODN2006/ODN200721(2组)和CpG-M36219(3组)。
其它示范性TLR9配体是模拟CpGTLR9激动剂的作用的肽，即被肽文库鉴定或从肽文库得到的肽，其因结合TLR9的亲和力及证明的激动活性而被选出，或TLR9配体是蛋白质配体，包括特异性抗体。
TLR9配体或激动剂的作用可以通过合适的试验确定，例如，按照下述方式确定：按照Tel等人29所描述，从健康捐献者的血中纯化pDC，然后，采用合适浓度的TLR9配体进行培养。24小时后，采用标准ELISA方案，测定上清液中的IFNa。为了确定细胞的成熟状态，采用标准FACS程序，利用商业上可购买的特异性抗体，在采用TLR9配体培养之前和之后，对pDC染色，确定CD80、CD83或CD86的表达。
暴露于本发明疫苗时活化的反应性T细胞的数量可采用多种方法测定，包括ELISPOT、FACS分析、细胞因子释放，或T细胞增殖试验。
此处使用的词语“特异性”或“特异性结合”指的是分子异质群体中目标同源配体的决定性结合反应。因此，在指定条件下(例如，免疫试验条件下)，一个或多个抗原被结合物的各结合位点特异性结合，不以显著的量与样本中存在的其它分子结合。特异性结合指的是就靶本身而言，结合是选择性的，根据选择，具有高、中或低的结合亲和力或亲合力。如果结合常数或结合动力学相差至少10倍，优选相差至少100倍，更优选相差至少1000倍，通常达到选择性结合。很好理解的是，该词语还应指的是特异性识别一个或多个不同抗原的交叉反应性或多特异性结合物。
本发明使用的词语“处理”应总是指的是处理主体，用于预防(即防止感染与/或疾病状态)或治疗(即治疗疾病，不管其发病机理)目的。在癌症疾病状况，包括胃泌素依赖性肿瘤或胃泌素依赖性癌症情况下，处理主体通常指的是治疗。但是，在患者患原发病，处于疾病进展风险或发展为继发病症或副反应的风险时，例如，依赖于与胃泌素效应的内源性胃泌素产生时，处理可能是预防性的。
采用本发明的免疫原性组合物或疫苗作为唯一预防或治疗试剂，或者与其它任何合适的手段，例如，包括化学疗法或使用解酸剂一起使用，可以使处理有效。
在癌症疗法中，其它治疗处理包括，例如，手术切除、放射疗法、化学疗法、激素疗法、抗-肿瘤疫苗、基于抗体的疗法、全身照射、骨髓移植、外周血干细胞移植和施用化学治疗剂。
在此方面，词语“组合”，例如，相对于化合物或处理的组合使用时，特别指的是伴随、同时、平行或相继处理主体。
为了进行处理，本发明的免疫原性组合物或疫苗可以施用一次，或者分为单独的组分与/或多个较小的剂量，按时间间隔施用。疫苗通常以浓度0.1至500μg/mL施用，例如，皮下、皮内、肌肉内、静脉内、经口、吸入或鼻内施用，可以配合或不配合其它佐剂，如ALUM一起施用。应该理解的是，精确的剂量和处理持续时间是待处理疾病的函数，可以利用已知的测试方案根据经验确定或从体内或体外测试数据外推确定。
本发明的免疫原性组合物或疫苗可以采用任何合适的手段和各配方施用，包括但不限于，例如，任何之一：肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)注射，或局部注射到受影响部位，如关节或注射到肿瘤内或周围。在优选的实施例中，疫苗以肌肉内、皮下或皮内注射的配方提供。
本发明还提供给药装置，如预装本发明疫苗的注射器。
一般说来，在首次向主体注射本发明疫苗初免后，可在一段时间内，通过相同或不同的给药途径执行一次或多次加强注射。采用多次注射时，在前次注射的1至52周内，或甚至更长时间内进行后续注射。
疫苗通常可包含稀释剂，如水、盐水、甘油、乙醇等。此外，在赋形剂中，还可以存在如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等作为辅助性物质。一般说来，本发明的疫苗制备为可以注射的形式，可以是液体溶液或悬浮液的形式，或适合施用前溶解、悬浮在液体媒介中的固体形式。制剂还可以乳化或装在脂质体内。
本发明疫苗的施用可适合地及另外地与任何TLR9激动剂与/或其它辅助措施一起组合施用，例如，作为同一配方中的独立实体或作为独立配方，以增强免疫响应。
增强的Th1免疫响应可包括与Th1免疫响应有关的一种或多种细胞因子(如IFNγ)增加，及活化巨噬细胞增加。
增强的Th1免疫响应可包括一种或多种抗原特异性IgG抗体，特别是lgG1抗体增加。
例如，本发明的免疫原性组合物或疫苗可与一种或多种佐剂与/或药学上可接受的赋形剂结合使用(例如，化学或重组连接，通过亲和力结合或单独组分的混合物结合)。本发明的疫苗可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或媒介，如水、盐水、甘油、乙醇等。此外，在这些媒介中，可以存在辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。佐剂可特别用于增强疫苗的效果。佐剂可直接加入到疫苗组合物中或可以单独施用，与疫苗同时施用或在疫苗施用后不久施用。
合适的佐剂包括细胞因子和有助于协调对免疫原的免疫响应的类似化合物。本发明中使用的词语“细胞因子”是纳摩尔至皮摩尔浓度时可作为体液调节剂，以及在正常或病理状态时，调节单个细胞和组织的功能活动的各种可溶蛋白质和肽的总称。这些蛋白质还直接介导细胞间的相互作用和调节细胞外环境中发生的过程。
细胞因子的实例包括IL-1、IL-4、TNFα、IFNα、INFγ、GM-CSF、G-CSF。
CpG寡核苷酸也可用作佐剂，与各表位呈递结合。其它佐剂包括明矾、(不)完全弗氏佐剂、B.百日咳或其毒素IC31等。
免疫原性组合物的组分，即定向佐剂组分，例如与TLR9配体和第一肽α-螺旋连接的抗-CD32部分，及免疫原组分，如包括与第一肽α-螺旋匹配的第二肽α-螺旋连接的肽免疫原，以及免疫原性组合物或疫苗，或任何它的结合部分或配体和带或不带螺旋重复序列的免疫原，可以采用本领域熟悉的各种方法得到，例如，通过细胞培养物纯化或分离、重组技术或化学合成得到。
根据一个具体实施例，免疫原性组合物与/或定向佐剂组分与/或其免疫原组分，是作为重组多肽，例如，通过重组DNA技术产生的。本发明使用的词语“重组”指的是并非宿主细胞中天然存在的分子或构建体。在一些实施例中，重组核酸分子包含两个或多个非天然方式连接在一起的天然序列。重组蛋白质指的是重组核酸编码与/或表达的蛋白质。在一些实施例中，“重组细胞”表达细胞天然(即非重组)形式内未发现相同形式的基因与/或表达人为故意干预时异常过表达、低表达与/或完全不表达的天然基因。重组细胞包含至少一个重组多核苷酸或多肽。“重组”、“重组中”和产生“重组的”核酸通常包括组装至少两个核酸片段。在一些实施例中，重组蛋白质和重组核酸保留功能，即保留其宿主细胞内的活性或显示增强活性。
因此，本发明进一步涉及免疫原性组合物或其组分的制备，及这种制备的重组手段，包括编码氨基酸序列的核酸、表达盒、包括待表达的编码氨基酸序列的核酸的载体或质粒，及包括任何这些手段的宿主细胞。合适的标准重组DNA技术是本领域熟悉的，并且特别是在Sambrook等人的《MolecularCloning：ALaboratoryManual″(1989)，2ndEdition(ColdSpringHarborLaboratorypress)》中进行了描述。
本发明使用的词语“主体”理解为包括人类或哺乳动物主体，包括家畜动物、宠物和实验室动物，特别是人类，可以是患有特定疾病状况的患者或健康主体。
本发明进一步提供用于制备本发明免疫原性组合物的组分试剂盒，即包括一个或多个装有各组分的容器的药物试剂盒。该试剂盒可在上述方法中使用。在具体的实施例中，试剂盒进一步包括说明书用于使用本发明免疫原性组合物各组分或制备的免疫原性组合物或疫苗。
根据具体的实例，本发明的疫苗包括以下的重组多肽：
SEQID40：
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTYT GESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYWGQ GTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSALEKEVSALEKEVSALE KEVSALEKEVSALEK
N-末端带下划线：与CD32a特异性结合的ScFV序列；
斜线：接头；可以使用scFv制剂中常用的任何替代接头。
粗体：StrepTagII，用于纯化，可以采用任何替代标记，例如，旗标或HIS标记或没有标记，其中纯化可利用七个重复的α螺旋。
C-末端双下划线：七个重复的α螺旋(pepE)，以形成卷曲螺旋，其中免疫原中有相反的七个重复α螺旋(pepK)。
在此实施例(SEQID40)中，采用5个重复序列；较多重复序列可导致自动-聚集，较少重复序列可降低亲和力，在这种情况下，使用4个重复序列。螺旋使用的重复序列的优选最低功能数是3，优选最高功能数是522-24，但是，根据采用的α螺旋的类型，采用更多重复序列也是可行的。限制因素将是开始诱导同源二聚的重复序列的数量。因此，同源二聚是特别排除的。
类似的多肽可包括前导序列，特定抗-CD32部分的氨基酸序列，例如，其是重组scFv、接头、用于纯化目的的标记及肽α-螺旋pepE序列。这种带或不带TLR9配体的构建体亦称为“弹头”，然后，通过与相反α-螺旋pepK连接的免疫原组合，可用于构建疫苗。
根据另一个具体实例，抗-CD32部分是具有SEQID41序列的抗-CD32a肽：ADGAWAWVWLTETAVGAAK30，作为ScFv的替代。
根据另一个实例，在弹头scFv和免疫原之间建立稳定的卷曲螺旋。
已经证明，采用这种免疫原或疫苗可以有效地刺激PBMC。
在另一个实例中，可以表明，弹头介导抗原呈递的增加。当带螺旋(pepK螺旋)的免疫原与含对应部分的螺旋(pepE螺旋)的弹头相互作用时，有效地刺激了T细胞。
在其它实例中，描述了处理小鼠模型和恒河猴模型的胰腺癌，其采用一弹头，该弹头利用通过卷曲螺旋与G12肽免疫原连接的抗-CD32scFv或抗-CD32a肽。恒河猴模型中描述了食欲下降和食欲控制。
因此，本发明提供了一种独特的免疫原性组合物和疫苗，及它们各自的应用。
参照下述实例将更充分地理解前述说明。但是，这些实例只是实施本发明一个或多个实施例的方法代表，不应视为限制本发明的范围。
实例
实例1：示范性结合物
CD32结合区，在此亦称为抗-CD32部分或CD32结合物：
CD32a结合物：与CD32a特异性结合的抗体：mAbIV.331ScFV，来源于mAbIV3(VH-接头-VL)：(SEQID42)
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTYTGE SIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYWGQGTSV TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHTNGNTYLHWFLQRPQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSI
下划线：VH域
粗体：HL域
正常类型设置：灵活接头(可以是任何接头)
抗-CD32a肽：30
(SEQID43)：ADGAWAWVWLTETAVGAAK
CD32a+b结合物组：
与CD32a和CD32b特异性结合的抗体：mAbAT-10(AbDSerotec)
ScFV，源自mAbAT-10(VH-接头-VL)：(SEQID44)
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSYYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNY ATHYAESVKGRFTISRDDSKNNVYLQMNNLRAEDTGIYYCNRRDEYYAMDYWGQGTSV SVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPGSLAVSLGQRATISCRASESVDNFGISFMNWFQQKPGQPRLLIYGASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDAAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKGSI
下划线：VH域
粗体：HL域
正常类型设置：灵活接头(可以是任何接头)
lgG1Fc片段(CH2-CH3域)：(SEQID45)
(PKSCDKTHTCPPCP)PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
()之间是铰链区，可以省略
下划线：CH2域
粗体：CH3域
TLR9结合区或部分，在此亦称为TLR9结合物或TLR9配体
CpGA类
CpG-A组：
ODN2216：(SEQID46)：GGGGGACGATCGTCGGGGGG
CpGB类
CpG-B组：
天然配体：
ODN2006：(SEQID47)：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT
CpGC类
CpG-C组：
ODNM362：(SEQID48)：TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT
示范性带螺旋的CD32结合产物
ScFV-螺旋1(IV.3)：(SEQID49)
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTYTGE SIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYWGQGTSV TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHTNGNTYLHWFLQRPQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK
下划线：VH域
粗体：HL域
正常类型设置：灵活接头(可以是任何接头)
斜体：pepE螺旋加C’StrepTagII序列及“GP”接头可以是任何灵活接头(StrepTagII可以删除或用HIS标记或任何其它标记代替)
ScFV-螺旋2(AT10)：(SEQID50)
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSYYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNY ATHYAESVKGRFTISRDDSKNNVYLQMNNLRAEDTGIYYCNRRDEYYAMDYWGQGTSV SVSSGGGGSGGGSGGGGSDIVLTQSPGSLAVSLGQRATISCRASESVDNFGISFMNWFQQKPGQPPRLLIYGASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDAAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKGSISAWSHPFEKGPEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK
下划线：VH域
粗体：HL域
正常类型设置：灵活接头(可以是任何接头)
斜体：pepE螺旋加C’StrepTagII序列及“GP”接头可以是任何灵活接头(StrepTagII可以删除或用HIS标记或任何其它标记代替)
肽-螺旋：(SEQID51)
ADGAWAWVWLTETAVGAAKGPEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK
斜体：pepE螺旋加“GP”接头可以是任何灵活接头。
lgG1Fc片段-螺旋：(SEQID52)
(PKSCDKTHTCPPCP)PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGPEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK
()之间是铰链区，可以省略
下划线：CH2域
粗体：CH3域
斜体：pepE螺旋加“GP”接头可以是任何灵活接头
示范性带SH基团的TLR9结合产物，用于与CD32结合物化学交联
CpG-A组：
ODN2216_SH：(SEQID46)：GGGGGACGATCGTCGGGGGG-SH
粗体，带SH基团的灵活接头，用于与ScFV-螺旋化学交联(可以是任何接头和化学反应性基团，如适合化学交联的NH2)
CpG-B组：
天然配体：
ODN2006_SH：(SEQID47)：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-SH
粗体，带SH基团的灵活接头，用于与ScFV-螺旋化学交联(可以是任何接头和化学反应性基团，如适合化学交联的NH2)
CpG-C组：
ODNM362_SH：(SEQID48)：TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT-SH
粗体，带SH基团的灵活接头，用于与ScFV-螺旋化学交联(可以是任何接头和化学反应性基团，如适合化学交联的NH2)
示范性弹头，即包括CD32结合物和TLR9结合物的结构
CD32结合物组的任何代表，通过任何方法与TLR9结合物组的任何代表化学连接，其中优选TLR9结合物与CD32结合物中可利用的赖氨酸(K)偶合。例如，不同TLR9结合物的混合物可以偶合，例如，CpG-B天然或肽结合物。
ScFV-螺旋1(IV.3)(SEQID49)
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTYTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHQFEKGPEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK
优选螺旋结构(斜体)中的赖氨酸。
或
肽-螺旋：(SEQID51)
ADGAWAWVWLTETAVGAAKGPEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK
优选螺旋结构(斜体)中的赖氨酸。
实例2：使用肿瘤学技术平台
基于ScFV-螺旋1(IV.3)+ODNM362的弹头，及来自恒河猴和食蟹猴的免疫原G17(G17RM)。在下文中，pE理解为焦谷氨酸(pyroGlu)。
人免疫原小胃泌素的序列(G17H，1st13AA，SEQID9)：
pEGPWLEEEEEAYG
恒河猴和食蟹猴的免疫原小胃泌素序列
(G17RM，1st13AA，SEQID53：
pEGPWMEEEEAAYG
小鼠免疫原小胃泌素序列(G17M，1st13AA，SEQID54)
pERPRMEEEEEAYG
与G17RM的区别用粗体表示
终产品免疫原G17RM1-螺旋和G17H1-螺旋：
G17RM_1-螺旋，SEQID55：
pEGPWMEEEEAAYGGGSGGKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE
G17H_1-螺旋，SEQID56
pEGPWLEEEEEAYGGGSGGKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE
粗体：接头(可以是任何接头)
斜体：pepK螺旋，与弹头相互作用
即用型(终产品)TYG1001RM和TYG1001H
将上文描述的弹头(基于ScFV-螺旋1IV.3)与G17RM_1-螺旋或G17H_1-螺旋按比例混合，该比例表明100％弹头与G17RM_1-螺旋或G17H_1-螺旋复合，不存在G17游离免疫原(摩尔比～1∶1)和在明矾上配置。从而制备TYG100_1RM和TYG100_1H。
实例3TYG1001RM用于治疗胃泌素依赖性癌症，如胰腺癌：
用含恒河猴G17(58.4μg/每次，0.5m1)的TYG100_1RM或G17_1RM(没有弹头)在0天、14天和35天给6只Balb/c小鼠免疫接种。最后一次免疫接种后两周，采集血清，并分析抗G17RM、G17H和G17M(＝来自小鼠的G17)的抗体的存在。
表1
表1表明，所有小鼠均有针对疫苗2种组分(弹头和G17RM)的IgG响应。重要的是，所有小鼠均产生与人G17交叉反应及与小鼠G17(G17M)反应程度较低的IgG。后者是非常引人注意的，因为小鼠G17的前13个氨基酸(pERPRMEEEEEAYG，SEQID9)与G17RM有3个AA不同(不同之处以粗体和下划线表示)，G17M对小鼠来说是自体抗原。因此，识别G17M的抗体是自身抗体，表明TYG100_1RM能够破坏针对自体抗原G17M的天然耐受性。当G17-肽没有弹头免疫时，没有任何抗G17的响应。
疫苗诱导自身免疫响应的能力是抗癌疫苗的前提条件，其中所有肿瘤相关抗原(TAA)是过表达(如肿瘤细胞上过表达的)自体抗原。因此，由TYG100_1RM弹头结合人G17作为免疫原的疫苗可用作处理胃泌素依赖性肿瘤，如胰腺癌的疫苗。
实例4：包括肽免疫原二聚体的示范性产品
终产品免疫原G17RM2-螺旋和G17H2-螺旋：
采用特定的灵活接头将2个肽与一个pepK螺旋连接，化学合成G17RM(小胃泌素的前13AA)的二聚体。
G17RM2-螺旋：(SEQID57：本发明的免疫原性组合物的一部分，包括两个SEQID53的恒河猴胃泌素肽，一支化接头序列和一肽α-螺旋(TYG100_2RM)。这部分可通过卷曲螺旋连接与合适的定向佐剂连接)
粗体是特殊的灵活接头(可以是连接三个肽的任何接头)
斜体是与弹头相互作用的pepK螺旋
G17H2-螺旋：(SEQID11：本发明的免疫原性组合物的一部分，包括两个SEQID9的人胃泌素肽，一支化接头序列和一肽α-螺旋(TYG100_2H)。这部分可通过卷曲螺旋连接与合适的定向佐剂连接。
粗体是特殊的灵活接头(flexiblelinker)(可以是连接三个肽的任何接头)
斜体是与弹头相互作用的pepK螺旋
终产品TYG1002RM和TYG1002H
将上文所描述的弹头(基于ScFV-螺旋1；IV.3)与G17RM_2-螺旋或G17H_2-螺旋按比例混合，该比例表明100％弹头与G17RM_2-螺旋或G17H_2-螺旋免疫原复合，不存在G17游离免疫原(摩尔比～1:1)并在明矾上配制。从而制备TYG100_2RM和TYG100_2H。
实例5：TYG1002RM用于处理胃泌素依赖性癌症，如胰腺癌：
用含恒河猴G17(66.8μg/每次注射，0.5ml)的TYG100_2RM在0天、14天和35天给6只Balb/c小鼠免疫接种3次。最后一次免疫接种后两周，采集血清，并分析抗G17RM、G17H和G17M(＝来自小鼠的G17)的IgG抗体的存在。
表2
表2表明，所有小鼠均有针对疫苗2种组分(弹头和G17RM)的IgG响应。重要的是，所有小鼠均产生与人G17交叉反应及与小鼠G17(G17M)反应程度较低的IgG。后者是非常引人注意的，因为小鼠G17的前13个氨基酸(pERPRMEEEEEAYG，SEQID9)与G17RM有3个AA不同(不同之处以粗体和下划线表示)，G17M对小鼠来说是自体抗原。因此，识别G17M的抗体是自身抗体，表明TYG100_2RM能够破坏抗自体抗原G17M的天然耐受性。当G17肽没有弹头免疫时，没有任何抗G17的响应。
疫苗诱导自身免疫响应的能力是抗癌疫苗的前提条件，其中所有肿瘤相关抗原(TAA)是过表达(如肿瘤细胞上过表达的)自体抗原。因此，由TYG100_2RM弹头结合人G17作为免疫原的疫苗可用作处理胃泌素依赖性肿瘤，如胰腺癌的疫苗。对TYG100_2RM诱导的抗全部3种类型的G17的响应比TYG100_1RM诱导的那些强(表1)，表明在疫苗中优选使用二聚体。
实例6TYG1002RM用于处理胃泌素依赖性癌症，如胰腺癌：
在0天、14天和28天采用TYG100_2RM给6只食蟹猴免疫接种，采用G17RM_2-螺旋给6只食蟹猴免疫接种。在0天、14天、28天、42天和56天分析血清，采用MesoScaleDiscovery(MSD)的多路ELISA系统，按照MSD手册分析抗自身小胃泌素(G17RM)、人小胃泌素(G17H)、与胃泌素类似MW的不相关对照肽(对照肽)的IgG抗体的存在或抗弹头(ScFV-螺旋1)的IgG抗体的存在。
在图1中可以看出，所有6只动物均表现出强烈的对弹头(ScFV-螺旋1)和G17RM和G17H的时间依赖性IgG响应，但针对对照肽没有看到任何响应。三次免疫接种后，抗G17RM的响应是抗ScFV-螺旋1响应的75％。这是相当值得注意的，因为G17RM是仅～1.2kDa的100％自体蛋白，而ScFV-螺旋1是>30kDa的100％同种异体(allogeneic)蛋白。抗G17RM抗体与G17H发生剧烈的交叉反应。当采用G17RM_2-螺旋肽但不使用弹头时，不存在任何抗G17RM的响应。42天和56天之间IgG滴度的下降程度G17RM比ScFV强烈，表明部分IgG抗体被内
源性G17中和。重要的是，内源性G17的存在并不增强对G17RM的响应。
图1的数据表明，该疫苗能够诱导可逆的真正的(bonavide)自身抗体响应。这是抗癌疫苗的前提条件，因为肿瘤相关抗原(TAA)是过表达的自体抗原，例如，在肿瘤细胞上过表达，而且在正常健康细胞上也存在较低的表达水平。因此，TYG100_2RM或TYG100_2H等疫苗可用于处理胰腺癌等胃泌素依赖性肿瘤。一旦癌症已经完全治愈，处理可停止，诱导的抗G17抗体将从循环中清除干净。为了(在处理期间)保持稳定状态，需要反复注射疫苗，增强自身免疫响应。采用这种疫苗并不会诱导任何不可逆的自身免疫疾病。
实例7：TYG1002RM用于处理肥胖病：
对实例3的动物的食欲进行监测，并在0天、14天、28天、42天和56天测量其体重。注射两次TYG100_2RM后，6只动物中有4只对其每日小吃(饼干)失去了兴趣，而基本的食物摄入保持正常。这种情况伴随着明显的体重减轻(图2)，但是，未记录到任何不想看到的副作用。到目前为止，采用除胃泌素免疫原以外的其它基于弹头和卷曲螺旋相互作用的疫苗(如靶向免疫原)接种从未观察到这种现象(数据未示出)。
这些数据表明，TYG100_2RM降低了对(食物之间)小吃的渴望，但并不影响健康生活需要的基本食物摄入。这些动物保持正常活力和高兴状态。因此，TYG100_2RM可用于处理肥胖病。
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Claims (15)

1.一种免疫原性组合物，包括：
a.定向佐剂，其包括至少一种与TLR9配体和第一肽α-螺旋连接的抗-CD32部分；及
b.胃泌素-17肽免疫原，其与卷曲到第一肽α-螺旋的第二肽α-螺旋连接，其中肽免疫原是以下任一种：
(i)人胃泌素-17，包括SEQID1的氨基酸序列，或其包括SEQID2氨基酸序列的片段，或SEQID2的至少4个N-末端氨基酸；
(ii)(i)的类似物，优选恒河猴或鼠科动物来源；与/或
(iii)(i)或(ii)任一项的功能活性变体，在SEQID2的氨基酸序列中存在一个、两个、三个或四个点突变。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述肽免疫原是线性肽，包括以下序列或由以下序列组成：
(i)SEQID3氨基酸序列，优选是SEQID4；
(ii)SEQID5氨基酸序列，优选是SEQID6；
(iii)SEQID7氨基酸序列，优选是SEQID8；或
(iv)SEQID2或9氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包括至少两个与第二肽α-螺旋连接的肽免疫原，优选2、3或4个肽免疫原。
4.根据权利要求1至3任一项所述的免疫原性组合物，其中所述第一α-螺旋和第二α-螺旋中的每个螺旋包括氨基酸基序的3-5个氨基酸重复序列，彼此特异性结合，Kd小于10-6M。
5.根据权利要求1至4任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗-CD32部分选自抗-CD32抗体、抗体片段和肽，优选靶向CD32a。
6.根据权利要求1至5任一项所述的免疫原性组合物，其中所述TLR9配体是TLR9激动剂，选自A、B和C类CpG寡脱氧核苷酸或模拟任何CpG寡脱氧核苷酸的免疫刺激肽。
7.根据权利要求1至6任一项所述的免疫原性组合物，包括一个或多个接头序列，优选由甘氨酸与/或丝氨酸与/或赖氨酸残基组成，优选SEQID12或13氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7任一项所述的免疫原性组合物，包括SEQID10或SEQID11氨基酸序列。
9.包括权利要求1至8任一项所述免疫原性组合物及药学上可接受的载体的疫苗。
10.用于制备权利要求1至8任一项所述免疫原性组合物的试剂盒，包括以下组分：
a.定向佐剂，其包括至少一种与TLR9配体和第一肽α-螺旋连接的抗-CD32部分；及
b.胃泌素-17肽免疫原，其连接与第一肽α-螺旋匹配的第二肽α-螺旋，其中肽免疫原是以下任一种：
(i)人胃泌素-17，包括SEQID1的氨基酸序列，或其包括SEQID2氨基酸序列的片段，或SEQID2的至少4个N-末端氨基酸；
(ii)(i)的类似物，优选恒河猴或鼠科动物来源；与/或
(iii)(i)或(ii)任一项的功能活性变体，在SEQID2的氨基酸序列中存在一个、两个、三个或四个点突变。
11.权利要求1至8任一项所的述免疫原性组合物，其用于处理患胃泌素依赖性疾病的主体，如处理胃泌素依赖性肿瘤或胃泌素依赖性癌症，如胰腺癌、胃溃疡、胃食管返流疾病(GERD)、终末期肾功能衰竭(ESRF)或肥胖病。
12.根据权利要求11使用的免疫原性组合物，其中采用初免-加强策略，向主体施用有效量的所述组合物。
13.根据权利要求11或12使用的免疫原性组合物，其中每次向主体施用所述组合物的有效量是0.0001-2mg。
14.根据权利要求11至12任一项使用的免疫原性组合物，其中所述主体进一步接受化学疗法处理。
15.根据权利要求11至14任一项使用的免疫原性组合物，其在主体内触发保护性免疫响应，优选抗人胃泌素-17的血清IgG滴度是至少1/1000。
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