CN105393918A - 澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，包括：从澳洲坚果成年树上截取4cm长含有芽的茎段为外植体，将外植体进行消毒处理；将得到的外植体进行诱导培养20-24天，温度为23-25℃，光照强度为2000-2200Lux，每天光照13-15h；将培养出的新长腋芽苗在无菌条件下切成只带一个腋芽的茎段，接入生根培养基在温度为25-27℃培养，依次包括三个阶段：第一阶段，置于2200-2400Lux每天光照14-16h培养12-14天；第二阶段，置于黑暗下培养8-10天；第三阶段，置于2800-3000Lux每天光照18h培养直至生根。本发明解决了澳洲坚果组织培养生根难、生根率低的问题。

Description

澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及澳洲坚果的组培领域。更具体地说，本发明涉及一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

澳洲坚果，又名昆士兰栗、夏威夷果。其种仁富含不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素等，营养价值高，风味十分独特，素有“干果之王”之称。澳洲坚果市场前景看好，生态效益、经济效益具佳，是一种含油量高、营养丰富、风味独特的食用坚果，在国际市场上一直处于供不应求状态。

澳洲坚果育苗方法有种子育苗、扦插育苗、嫁接育苗和植物组织培养育苗法。由于澳洲坚果种子繁育遗传稳定性差，很少采用单独种子繁殖的方式育苗。扦插育苗繁殖出的根系不发达，植株生长慢。嫁接育苗的成活率低，且培育时间很长。而植物组织培养在许多林木、木本果树和观赏性作物上广泛应用，组织培养可以产生无污染的植物，降低植物疫病传播风险，提高了种质交换的安全性，目前，澳洲坚果的组织培养方法较少，主要是由于澳洲坚果的外植体在生根培养中生根较难，因此，建立适合于澳洲坚果的组织培养方法，对加快澳洲坚果的良种繁育进程具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种澳洲坚果的组织培养方法，通过将增殖与生根合并为一步，采用固体培养基以及与液体培养基结合进行分段培养的方式，促进只带一个腋芽的茎段生根，提高生根率，从而提高成活率。

本发明还有一个目的是提供一种液体培养基，通过本发明的培养床将其雾化，通过固体培养基底部的2层亚麻纤维布吸收液体培养基中的水分和营养，从而诱发生根，并提高生根率，从而解决澳洲坚果的外植体生根困难的问题。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，包括：

步骤A、从澳洲坚果成年树上截取4cm长含有芽的茎段为外植体，每一个茎段上含有一个腋芽，将外植体进行消毒处理；

步骤B、将步骤A中得到的外植体接入诱导培养基中进行诱导培养20-24天，培养温度为23-25℃，光照强度为2000-2200Lux，每天光照13-15h，所述诱导培养基的配方为：1/2MS，6-苄基腺嘌呤0.2-0.4mg/L，赤霉素0.2-0.3mg/L，维生素B₁0.45-0.55mg/L，琼脂7g/L和蔗糖25g/L；

步骤C、将步骤B中培养出的新长腋芽苗在无菌条件下切成只带一个腋芽的茎段，接入生根培养基在培养温度为25-27℃条件下进行培养，依次包括三个阶段：第一阶段，先置于光照强度为2200-2400Lux，每天光照14-16h培养12-14天；第二阶段，置于黑暗条件下培养8-10天；第三阶段，置于光照强度为2800-3000Lux，每天光照18h培养直至生根；

其中，所述生根培养基包括固体培养基和液体培养基，所述固体培养基的配方为：1/4MS，维生素B₆0.65-0.75mg/L，6-苄基腺嘌呤0.1-2.0mg/L，赤霉素0.5-1.0mg/L，乙烯醇0.01-0.5mg/L，鱼骨粉1.2-1.5g/L，竹醋液22-26mg/L，杜仲提取物0.5-0.7g/L，吲哚丁酸0.8-1.0mg/L，α-萘乙酸3-6mg/L，琼脂4g/L和蔗糖25g/L；所述液体培养基的配方为：α-萘乙酸1.5-1.7mg/L，木醋液30-35mg/L，海藻提取液55-60mg/L，桑葚酵素40-44g/L和粪肥提取液30-36g/L；所述粪肥提取液由海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:1-2:1-2混合后，加入其重量的6-10倍的淘米水，发酵后过滤得到的提取液；

其中第一阶段和第二阶段采用固体培养基培养，第三阶段采用固体培养基和液体培养基置于培养床中结合培养，所述培养床包括：

床体，其为上部开口的长方体结构，所述床体的底部为格栅结构，其上部铺设有2层亚麻纤维布，所述固体培养基置于2层亚麻纤维布上，所述床体的其中三个侧壁的下部沿其外边缘向下延伸出一定长度形成第一扣板，一插板从床体的另一侧壁处可拆卸地插接于所述床体的下部以使所述床体的下部可封闭，当加入固体培养基时，插入插板，待固体培养基凝固后取下插板；

盖体，其为长方形板体，所述盖体的边长均大于所述床体上部开口的边长，以使所述盖体可拆卸地盖接于所述床体上，所述盖体上设有多个均匀分布的圆形通孔，对于任意一个圆形通孔，沿其边缘向下延伸出一定长度形成中空的圆柱形限位片，所述圆柱形限位片的下部与所述床体连通，所述圆柱形限位片的侧壁上设有多个均匀分布的通孔，将第二阶段取出的幼苗接入所述圆柱形限位片中的固体培养基中，每一个所述圆柱形限位片中接入一棵幼苗；

储液槽，其为上部开口的长方体结构，所述储液槽设置在所述床体的下部，所述储液槽的其中三个侧壁的上部沿其内边缘向上延伸出一定长度形成与所述第一扣板相配合的第二扣板，储液槽的另一个侧壁的上部向上延伸出一定长度以使所述储液槽与所述床体卡接后使所述储液槽与所述床体的底部形成与外部不连通的封闭结构，所述储液槽的侧壁上部开设有可关闭或开启的进液口以便于注入液体培养基，储液槽内部的底部设有至少一个超声波雾化片，所述储液槽的一个侧壁上设有控制开关，其连接所述至少一个超声波雾化片，所述储液槽内装载所述液体培养基，所述控制开关控制所述至少一个超声波雾化片将储液槽内的液体培养基雾化。

优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，将步骤C中得到的生根幼苗置于温度为25-27℃下炼苗5-7天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的沙床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔3-5天掀开聚乙烯膜通风4-6h。

优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述步骤A中将外植体进行消毒处理具体是指将外植体先用75％酒精消毒处理30s，再用消毒液浸泡6-8分钟，所述消毒液由质量分数为0.05％的石竹内酯、0.02％的胡桃醌和0.2％的氯化汞组成，最后用无菌水冲洗4-6次。

优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述沙床基质包括两层，上层由粗河沙和经完全腐熟的坚果壳按照质量比为3:1组成，上层厚度为12-15cm，下层为泥炭藓、细河沙和经完全腐熟的口蘑菌渣按照质量比为6:2:3组成，下层厚度为18-24cm。

优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述粪肥提取液的制备方法如下：

将海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:1-2:1-2混合后得到混合肥，加入混合肥重量的5％的酸奶和10％的米酒醪，再加入混合肥重量的8倍的淘米水，置于无氧条件下于36-38℃发酵20-25天，然后将其先通过60目过滤后，再通过石棉滤菌器过滤，即得所述粪肥提取液。

优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述圆柱形限位片的轴向长度与所述床体的高度比为3-4:5。

优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述第一阶段和第二阶段中所用的固体培养基中6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，乙烯醇0.2-0.5mg/L；所述第三阶段中所用的固体培养基中6-苄基腺嘌呤0.1-0.8mg/L，乙烯醇0.01-0.1mg/L。

本发明的方法简单、遗传稳定性好，至少包括以下有益效果：

1)本发明将只带一个腋芽的茎段通过第一阶段的分裂增殖培养，第二阶段在黑暗条件下诱导根原基生成，第三个阶段采用固体培养基与雾化的液体培养基结合培养外植体，极大地促进了根的生成，并且本发明的方法所用的时间短，根质量好，生根率高，易于移栽成活，解决了澳洲坚果组培生根难的问题，同时缩短了组培的时间，为解决市场上供不应求的状况提供了新途径；

2)本发明的固体培养基中的维生素B₆具有促进根生长的作用，鱼骨粉中含有丰富的磷，对澳洲坚果外植体的生根具有促进作用，竹醋液对外植体具有很好的渗透性和吸收性，可以促进其生根、发芽和生长，还具有一定的抗菌性，杜仲提取物中含有丰富的绿原酸，可以抗菌、抗病毒，降低外部污染，促进组培苗的成活，提升组培苗的品种品质；在生根培养第一个阶段，可以适当增加1/6-苄基腺嘌呤的含量提高增殖能力，并通过适量的乙烯醇控制并防止外植体出现玻璃花现象，而致使外植体不易生根；

本发明的液体培养基中含有α-萘乙酸具有促进外植体的新陈代谢、促进细胞分裂与扩大，诱导形成不稳定根的作用；木醋液具有抗菌活性，还能促进外植体根部的活力，提高生根成活率；海藻提取液具有促进外植体新陈代谢和生长，以及抑菌的作用；桑葚酵素能促进细胞复原作用，促进新陈代谢，增强外植体生根的生命力，提高成活率；粪肥提取液中磷质含量高，具有丰富的营养物质，可以供第三阶段的外植体充分吸收营养，提高诱导生根率；

3)本发明的培养方法不受季节限制，可实现工厂化育苗，可常年连续生产，克服了常规的嫁接苗受季节限制的缺点；

4)本发明采用的消毒液由石竹内酯、胡桃醌和氯化汞组成，可以杀灭真菌和细菌，外植体的菌污染率控制在5％以下。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的培养床的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1：

本发明提供一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，包括：

步骤A、从澳洲坚果成年树上截取4cm长含有芽的茎段为外植体，每一个茎段上含有一个腋芽，将外植体进行消毒处理；

步骤B、将步骤A中得到的外植体接入诱导培养基中进行诱导培养20天，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，每天光照13h，所述诱导培养基的配方为：1/2MS，6-苄基腺嘌呤0.2mg/L，赤霉素0.2mg/L，维生素B₁0.45mg/L，琼脂7g/L和蔗糖25g/L；

步骤C、将步骤B中培养出的新长腋芽苗在无菌条件下切成只带一个腋芽的茎段，接入生根培养基在培养温度为25℃条件下进行培养，依次包括三个阶段：第一阶段，先置于光照强度为2200Lux，每天光照14h培养12天；第二阶段，置于黑暗条件下培养8天；第三阶段，置于光照强度为2800Lux，每天光照18h培养直至生根；

其中，所述生根培养基包括固体培养基和液体培养基，所述固体培养基的配方为：1/4MS，维生素B₆0.65mg/L，6-苄基腺嘌呤0.1-2.0mg/L，赤霉素0.5mg/L，乙烯醇0.01-0.5mg/L，鱼骨粉1.2g/L，竹醋液22mg/L，杜仲提取物0.5g/L，吲哚丁酸0.8mg/L，α-萘乙酸3mg/L，琼脂4g/L和蔗糖25g/L；所述液体培养基的配方为：α-萘乙酸1.5mg/L，木醋液30mg/L，海藻提取液55mg/L，桑葚酵素40g/L和粪肥提取液30g/L；所述粪肥提取液由海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:1:1混合后，加入其重量的6倍的淘米水，发酵后过滤得到的提取液；

其中第一阶段和第二阶段采用同样的固体培养基培养，其中第一阶段和第二阶段中6-苄基腺嘌呤为1.0mg/L、乙烯醇为0.2mg/L，第三阶段中6-苄基腺嘌呤为0.1mg/L、乙烯醇为0.01mg/L，其余组分与第一阶段的相同。这样是为了在生根培养的第一阶段充分增殖，第三阶段促进生根，减少增殖，相比三个阶段都用高浓度的6-苄基腺嘌呤或低浓度的6-苄基腺嘌呤效果更好，如果都用高浓度的6-苄基腺嘌呤，生根时间会延长，增殖倍率相对较高，但是都用低浓度的6-苄基腺嘌呤，增殖倍率很低，生根时间相对缩短。

第三阶段采用固体培养基和液体培养基置于培养床中结合培养，如图1所示，所述培养床包括：

床体2，其为上部开口的长方体结构，所述床体2的底部为格栅结构，其上部铺设有2层亚麻纤维布，所述固体培养基置于2层亚麻纤维布上，所述床体2的其中三个侧壁的下部沿其外边缘向下延伸出一定长度形成第一扣板，一插板从床体2的另一侧壁处可拆卸地插接于所述床体2的下部以使所述床体2的下部可封闭，当加入固体培养基时，插入插板，待固体培养基凝固后取下插板，以使床体与下面所述的储液槽之间通过床体的底部可通过雾化的液体培养基；

盖体3，其为长方形板体，所述盖体3的边长均大于所述床体上部开口的边长，以使所述盖体3可拆卸地盖接于所述床体2上，所述盖体3上设有多个均匀分布的圆形通孔，对于任意一个圆形通孔，沿其边缘向下延伸出一定长度形成中空的圆柱形限位片31，所述圆柱形限位片31的下部与所述床体3连通，所述圆柱形限位片3的侧壁上设有多个均匀分布的通孔，将第二阶段取出的幼苗接入所述圆柱形限位片中的固体培养基中，每一个所述圆柱形限位片中接入一棵幼苗；

储液槽1，其为上部开口的长方体结构，所述储液槽1设置在所述床体的下部，所述储液槽1的其中三个侧壁的上部沿其内边缘向上延伸出一定长度形成与所述第一扣板相配合的第二扣板，储液槽的另一个侧壁的上部向上延伸出一定长度以使所述储液槽1与所述床体2卡接后使所述储液槽与所述床体的底部形成与外部不连通的封闭结构，所述储液槽1的侧壁上部开设有可关闭或开启的进液口以便于注入液体培养基，储液槽1内部的底部设有至少一个超声波雾化片4，所述储液槽的一个侧壁上设有控制开关11，其连接所述至少一个超声波雾化片4，所述储液槽1内装载所述液体培养基，所述控制开关11控制所述至少一个超声波雾化片4将储液槽1内的液体培养基雾化。

图1中所示为培养床的结构示意图，确切的说是剖视图，这里做一个简答说明，第一扣板和第二扣板均由对应的床体或储液槽的三个侧壁延伸出的，为的就是让床体和储液槽之间可以卡合扣接上，由于固体培养基在装入床体中时，其为液体状态，故本发明搭配一个可插接的插板，待固体培养基凝固后便可拆下插板，将装有液体培养基的储液槽与床体卡接，为了防止液体培养基雾化后从储液槽和床体的第四个侧壁，也就是未形成扣板的那个侧壁处的出口逸出，故储液槽的另一个侧壁即第四个侧壁处向上延伸出一定长度使储液槽与床体的底部形成封闭的结构。液体培养基可以从进液口进入，减少了从储液槽上部进入的菌污染几率。

其中，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，将步骤C中得到的生根幼苗置于温度为25℃下炼苗5天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的沙床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔3天掀开聚乙烯膜通风4h。

其中，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述粪肥提取液的制备方法如下：

将海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:1:1混合后得到混合肥，加入混合肥重量的5％的酸奶和10％的米酒醪，再加入混合肥重量的8倍的淘米水，置于无氧条件下于36℃发酵20天，然后将其先通过60目过滤后，再通过石棉滤菌器过滤，即得所述粪肥提取液。

其中，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述圆柱形限位片的轴向长度与所述床体的高度比为3:5。

实施例2：

一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，包括：

步骤A、从澳洲坚果成年树上截取4cm长含有芽的茎段为外植体，每一个茎段上含有一个腋芽，将外植体进行消毒处理；

步骤B、将步骤A中得到的外植体接入诱导培养基中进行诱导培养20-24天，培养温度为24℃，光照强度为2100Lux，每天光照14h，所述诱导培养基的配方为：1/2MS，6-苄基腺嘌呤0.3mg/L，赤霉素0.25mg/L，维生素B₁0.50mg/L，琼脂7g/L和蔗糖25g/L；

步骤C、将步骤B中培养出的新长腋芽苗在无菌条件下切成只带一个腋芽的茎段，接入生根培养基在培养温度为26℃条件下进行培养，依次包括三个阶段：第一阶段，先置于光照强度为2300Lux，每天光照15h培养13天；第二阶段，置于黑暗条件下培养9天；第三阶段，置于光照强度为2900Lux，每天光照18h培养直至生根；

其中，所述生根培养基包括固体培养基和液体培养基，所述固体培养基的配方为：1/4MS，维生素B₆0.70mg/L，6-苄基腺嘌呤0.1-2.0mg/L，赤霉素0.75mg/L，乙烯醇0.01-0.5mg/L，鱼骨粉1.35g/L，竹醋液24mg/L，杜仲提取物0.6g/L，吲哚丁酸0.9mg/L，α-萘乙酸4.5mg/L，琼脂4g/L和蔗糖25g/L；所述液体培养基的配方为：α-萘乙酸1.6mg/L，木醋液33mg/L，海藻提取液58mg/L，桑葚酵素42g/L和粪肥提取液33g/L；所述粪肥提取液由海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:1.5:1.5混合后，加入其重量的8倍的淘米水，发酵后过滤得到的提取液；

其中第一阶段和第二阶段采用同样的固体培养基培养，其中第一阶段和第二阶段中6-苄基腺嘌呤为1.5mg/L、乙烯醇为0.35mg/L，第三阶段中6-苄基腺嘌呤为0.5mg/L、乙烯醇为0.05mg/L，其余组分与第一阶段的相同，第三阶段采用固体培养基和液体培养基置于培养床中结合培养，如图1所示，所述培养床包括：

床体2，其为上部开口的长方体结构，所述床体2的底部为格栅结构，其上部铺设有2层亚麻纤维布，所述固体培养基置于2层亚麻纤维布上，所述床体2的其中三个侧壁的下部沿其外边缘向下延伸出一定长度形成第一扣板，一插板从床体2的另一侧壁处可拆卸地插接于所述床体2的下部以使所述床体2的下部可封闭，当加入固体培养基时，插入插板，待固体培养基凝固后取下插板，以使床体与下面所述的储液槽之间通过床体的底部可通过雾化的液体培养基；

盖体3，其为长方形板体，所述盖体3的边长均大于所述床体上部开口的边长，以使所述盖体3可拆卸地盖接于所述床体2上，所述盖体3上设有多个均匀分布的圆形通孔，对于任意一个圆形通孔，沿其边缘向下延伸出一定长度形成中空的圆柱形限位片31，所述圆柱形限位片31的下部与所述床体3连通，所述圆柱形限位片3的侧壁上设有多个均匀分布的通孔，将第二阶段取出的幼苗接入所述圆柱形限位片中的固体培养基中，每一个所述圆柱形限位片中接入一棵幼苗；

储液槽1，其为上部开口的长方体结构，所述储液槽1设置在所述床体的下部，所述储液槽1的其中三个侧壁的上部沿其内边缘向上延伸出一定长度形成与所述第一扣板相配合的第二扣板，储液槽的另一个侧壁的上部向上延伸出一定长度以使所述储液槽1与所述床体2卡接后使所述储液槽与所述床体的底部形成与外部不连通的封闭结构，所述储液槽1的侧壁上部开设有可关闭或开启的进液口以便于注入液体培养基，储液槽1内部的底部设有至少一个超声波雾化片4，所述储液槽的一个侧壁上设有控制开关11，其连接所述至少一个超声波雾化片4，所述储液槽1内装载所述液体培养基，所述控制开关11控制所述至少一个超声波雾化片4将储液槽1内的液体培养基雾化。

图1中所示为培养床的结构示意图，确切的说是剖视图，这里做一个简答说明，第一扣板和第二扣板均由对应的床体或储液槽的三个侧壁延伸出的，为的就是让床体和储液槽之间可以卡合扣接上，由于固体培养基在装入床体中时，其为液体状态，故本发明搭配一个可插接的插板，待固体培养基凝固后便可拆下插板，将装有液体培养基的储液槽与床体卡接，为了防止液体培养基雾化后从储液槽和床体的第四个侧壁，也就是未形成扣板的那个侧壁处的出口逸出，故储液槽的另一个侧壁即第四个侧壁处向上延伸出一定长度使储液槽与床体的底部形成封闭的结构。液体培养基可以从进液口进入，减少了从储液槽上部进入的菌污染几率。

其中，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，将步骤C中得到的生根幼苗置于温度为26℃下炼苗6天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的沙床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔4天掀开聚乙烯膜通风5h。

其中，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述粪肥提取液的制备方法如下：

将海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:1.5:1.5混合后得到混合肥，加入混合肥重量的5％的酸奶和10％的米酒醪，再加入混合肥重量的8倍的淘米水，置于无氧条件下于37℃发酵23天，然后将其先通过60目过滤后，再通过石棉滤菌器过滤，即得所述粪肥提取液。

其中，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述圆柱形限位片的轴向长度与所述床体的高度比为3.5:5。

实施例3：

一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，包括：

步骤A、从澳洲坚果成年树上截取4cm长含有芽的茎段为外植体，每一个茎段上含有一个腋芽，将外植体进行消毒处理；

步骤B、将步骤A中得到的外植体接入诱导培养基中进行诱导培养24天，培养温度为25℃，光照强度为2200Lux，每天光照15h，所述诱导培养基的配方为：1/2MS，6-苄基腺嘌呤0.4mg/L，赤霉素0.3mg/L，维生素B₁0.55mg/L，琼脂7g/L和蔗糖25g/L；

步骤C、将步骤B中培养出的新长腋芽苗在无菌条件下切成只带一个腋芽的茎段，接入生根培养基在培养温度为27℃条件下进行培养，依次包括三个阶段：第一阶段，先置于光照强度为2400Lux，每天光照16h培养14天；第二阶段，置于黑暗条件下培养10天；第三阶段，置于光照强度为3000Lux，每天光照18h培养直至生根；

其中，所述生根培养基包括固体培养基和液体培养基，所述固体培养基的配方为：1/4MS，维生素B₆0.75mg/L，6-苄基腺嘌呤0.1-2.0mg/L，赤霉素1.0mg/L，乙烯醇0.01-0.5mg/L，鱼骨粉1.5g/L，竹醋液26mg/L，杜仲提取物0.7g/L，吲哚丁酸1.0mg/L，α-萘乙酸6mg/L，琼脂4g/L和蔗糖25g/L；所述液体培养基的配方为：α-萘乙酸1.7mg/L，木醋液35mg/L，海藻提取液60mg/L，桑葚酵素44g/L和粪肥提取液36g/L；所述粪肥提取液由海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:2:2混合后，加入其重量的10倍的淘米水，发酵后过滤得到的提取液；

其中第一阶段和第二阶段采用同样的固体培养基培养，其中第一阶段和第二阶段中6-苄基腺嘌呤为2.0mg/L、乙烯醇为0.5mg/L，第三阶段中6-苄基腺嘌呤为0.8mg/L、乙烯醇为0.1mg/L，其余组分与第一阶段的相同，第三阶段采用固体培养基和液体培养基置于培养床中结合培养，如图1所示，所述培养床包括：

床体2，其为上部开口的长方体结构，所述床体2的底部为格栅结构，其上部铺设有2层亚麻纤维布，所述固体培养基置于2层亚麻纤维布上，所述床体2的其中三个侧壁的下部沿其外边缘向下延伸出一定长度形成第一扣板，一插板从床体2的另一侧壁处可拆卸地插接于所述床体2的下部以使所述床体2的下部可封闭，当加入固体培养基时，插入插板，待固体培养基凝固后取下插板，以使床体与下面所述的储液槽之间通过床体的底部可通过雾化的液体培养基；

盖体3，其为长方形板体，所述盖体3的边长均大于所述床体上部开口的边长，以使所述盖体3可拆卸地盖接于所述床体2上，所述盖体3上设有多个均匀分布的圆形通孔，对于任意一个圆形通孔，沿其边缘向下延伸出一定长度形成中空的圆柱形限位片31，所述圆柱形限位片31的下部与所述床体3连通，所述圆柱形限位片3的侧壁上设有多个均匀分布的通孔，将第二阶段取出的幼苗接入所述圆柱形限位片中的固体培养基中，每一个所述圆柱形限位片中接入一棵幼苗；

储液槽1，其为上部开口的长方体结构，所述储液槽1设置在所述床体的下部，所述储液槽1的其中三个侧壁的上部沿其内边缘向上延伸出一定长度形成与所述第一扣板相配合的第二扣板，储液槽的另一个侧壁的上部向上延伸出一定长度以使所述储液槽1与所述床体2卡接后使所述储液槽与所述床体的底部形成与外部不连通的封闭结构，所述储液槽1的侧壁上部开设有可关闭或开启的进液口以便于注入液体培养基，储液槽1内部的底部设有至少一个超声波雾化片4，所述储液槽的一个侧壁上设有控制开关11，其连接所述至少一个超声波雾化片4，所述储液槽1内装载所述液体培养基，所述控制开关11控制所述至少一个超声波雾化片4将储液槽1内的液体培养基雾化。

图1中所示为培养床的结构示意图，确切的说是剖视图，这里做一个简答说明，第一扣板和第二扣板均由对应的床体或储液槽的三个侧壁延伸出的，为的就是让床体和储液槽之间可以卡合扣接上，由于固体培养基在装入床体中时，其为液体状态，故本发明搭配一个可插接的插板，待固体培养基凝固后便可拆下插板，将装有液体培养基的储液槽与床体卡接，为了防止液体培养基雾化后从储液槽和床体的第四个侧壁，也就是未形成扣板的那个侧壁处的出口逸出，故储液槽的另一个侧壁即第四个侧壁处向上延伸出一定长度使储液槽与床体的底部形成封闭的结构。液体培养基可以从进液口进入，减少了从储液槽上部进入的菌污染几率。

其中，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，将步骤C中得到的生根幼苗置于温度为27℃下炼苗7天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的沙床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔5天掀开聚乙烯膜通风6h。

其中，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述粪肥提取液的制备方法如下：

将海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:2:2混合后得到混合肥，加入混合肥重量的5％的酸奶和10％的米酒醪，再加入混合肥重量的8倍的淘米水，置于无氧条件下于38℃发酵25天，然后将其先通过60目过滤后，再通过石棉滤菌器过滤，即得所述粪肥提取液。

其中，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述圆柱形限位片的轴向长度与所述床体的高度比为4:5。

实施例4：

在实施例2的基础上，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述步骤A中将外植体进行消毒处理具体是指将外植体先用75％酒精消毒处理30s，再用消毒液浸泡6-8分钟，所述消毒液由质量分数为0.05％的石竹内酯、0.02％的胡桃醌和0.2％的氯化汞组成，最后用无菌水冲洗4-6次。相比实施例2，经过本方案的消毒液处理后，外植体的菌污染率从32％降到5％以内，本发明的申请人尝试用0.2％的氯化汞代替消毒液消毒处理，外植体的菌污染率仍有13.4％。

实施例5：

在实施例2的基础上，所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，所述沙床基质包括两层，上层由粗河沙和经完全腐熟的坚果壳按照质量比为3:1组成，上层厚度为12-15cm，下层为泥炭藓、细河沙和经完全腐熟的口蘑菌渣按照质量比为6:2:3组成，下层厚度为18-24cm。本发明的发明人采用粗沙河、市售的育苗土移栽，得出移栽成活率分别为52.5％、68.4％，采用本实施例的沙床基质移栽，得到的移栽成活率高达92.3％，其中，口蘑菌渣含磷高，可以提高澳洲坚果幼苗排根产生量和叶绿素含量，泥炭藓具有超强的储水性，从而能大大提高移栽苗的成活率。

为了进一步说明本发明的组织培养快速繁殖方法的有益效果，本发明针对实施例1-3的组培采集了以下数据，菌污染率5.2％以下，增殖倍数3-5倍，生根率达85.9％，生根培养时间为40-60天。现有的关于澳洲坚果组织培养的育苗方法，生根率不超过50％，远远低于本发明。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括：

步骤A、从澳洲坚果成年树上截取4cm长含有芽的茎段为外植体，每一个茎段上含有一个腋芽，将外植体进行消毒处理；

步骤B、将步骤A中得到的外植体接入诱导培养基中进行诱导培养20-24天，培养温度为23-25℃，光照强度为2000-2200Lux，每天光照13-15h，所述诱导培养基的配方为：1/2MS，6-苄基腺嘌呤0.2-0.4mg/L，赤霉素0.2-0.3mg/L，维生素B₁0.45-0.55mg/L，琼脂7g/L和蔗糖25g/L；

步骤C、将步骤B中培养出的新长腋芽苗在无菌条件下切成只带一个腋芽的茎段，接入生根培养基在培养温度为25-27℃条件下进行培养，依次包括三个阶段：第一阶段，先置于光照强度为2200-2400Lux，每天光照14-16h培养12-14天；第二阶段，置于黑暗条件下培养8-10天；第三阶段，置于光照强度为2800-3000Lux，每天光照18h培养直至生根；

其中，所述生根培养基包括固体培养基和液体培养基，所述固体培养基的配方为：

1/4MS，维生素B₆0.65-0.75mg/L，6-苄基腺嘌呤0.1-2.0mg/L，赤霉素0.5-1.0mg/L，乙烯醇0.01-0.5mg/L，鱼骨粉1.2-1.5g/L，竹醋液22-26mg/L，杜仲提取物0.5-0.7g/L，吲哚丁酸0.8-1.0mg/L，α-萘乙酸3-6mg/L，琼脂4g/L和蔗糖25g/L；所述液体培养基的配方为：α-萘乙酸1.5-1.7mg/L，木醋液30-35mg/L，海藻提取液55-60mg/L，桑葚酵素40-44g/L和粪肥提取液30-36g/L；所述粪肥提取液由海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:1-2:1-2混合后，加入其重量的6-10倍的淘米水，发酵后过滤得到的提取液；

其中第一阶段和第二阶段采用固体培养基培养，第三阶段采用固体培养基和液体培养基置于培养床中结合培养，所述培养床包括：

床体，其为上部开口的长方体结构，所述床体的底部为格栅结构，其上部铺设有2层亚麻纤维布，所述固体培养基置于2层亚麻纤维布上，所述床体的其中三个侧壁的下部沿其外边缘向下延伸出一定长度形成第一扣板，一插板从床体的另一侧壁处可拆卸地插接于所述床体的下部以使所述床体的下部可封闭，当加入固体培养基时，插入插板，待固体培养基凝固后取下插板；

盖体，其为长方形板体，所述盖体的边长均大于所述床体上部开口的边长，以使所述盖体可拆卸地盖接于所述床体上，所述盖体上设有多个均匀分布的圆形通孔，对于任意一个圆形通孔，沿其边缘向下延伸出一定长度形成中空的圆柱形限位片，所述圆柱形限位片的下部与所述床体连通，所述圆柱形限位片的侧壁上设有多个均匀分布的通孔，将第二阶段取出的幼苗接入所述圆柱形限位片中的固体培养基中，每一个所述圆柱形限位片中接入一棵幼苗；

储液槽，其为上部开口的长方体结构，所述储液槽设置在所述床体的下部，所述储液槽的其中三个侧壁的上部沿其内边缘向上延伸出一定长度形成与所述第一扣板相配合的第二扣板，储液槽的另一个侧壁的上部向上延伸出一定长度以使所述储液槽与所述床体卡接后使所述储液槽与所述床体的底部形成与外部不连通的封闭结构，所述储液槽的侧壁上部开设有可关闭或开启的进液口以便于注入液体培养基，储液槽内部的底部设有至少一个超声波雾化片，所述储液槽的一个侧壁上设有控制开关，其连接所述至少一个超声波雾化片，所述储液槽内装载所述液体培养基，所述控制开关控制所述至少一个超声波雾化片将储液槽内的液体培养基雾化。

2.如权利要求1所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，将步骤C中得到的生根幼苗置于温度为25-27℃下炼苗5-7天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的沙床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔3-5天掀开聚乙烯膜通风4-6h。

3.如权利要求2所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤A中将外植体进行消毒处理具体是指将外植体先用75％酒精消毒处理30s，再用消毒液浸泡6-8分钟，所述消毒液由质量分数为0.05％的石竹内酯、0.02％的胡桃醌和0.2％的氯化汞组成，最后用无菌水冲洗4-6次。

4.如权利要求3所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述沙床基质包括两层，上层由粗河沙和经完全腐熟的坚果壳按照质量比为3:1组成，上层厚度为12-15cm，下层为泥炭藓、细河沙和经完全腐熟的口蘑菌渣按照质量比为6:2:3组成，下层厚度为18-24cm。

5.如权利要求4所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述粪肥提取液的制备方法如下：

将海鸟粪、蚯蚓粪、秸秆和香菇菌渣按照质量比为4:6:1-2:1-2混合后得到混合肥，加入混合肥重量的5％的酸奶和10％的米酒醪，再加入混合肥重量的8倍的淘米水，置于无氧条件下于36-38℃发酵20-25天，然后将其先通过60目过滤后，再通过石棉滤菌器过滤，即得所述粪肥提取液。

6.如权利要求5所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述圆柱形限位片的轴向长度与所述床体的高度比为3-4:5。

7.如权利要求1所述的澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述第一阶段和第二阶段中所用的固体培养基中6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，乙烯醇0.2-0.5mg/L；所述第三阶段中所用的固体培养基中6-苄基腺嘌呤0.1-0.8mg/L，乙烯醇0.01-0.1mg/L。