CN107006368A - 澳洲坚果的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种澳洲坚果的组织培养方法，包括以下步骤：步骤一、剪取澳洲坚果成年结果树的结果枝当年抽生枝条，切下梢基部的发育未完全的叶，取叶腋里带芽的叶作外植体；步骤二、接入第一固体培养基进行初代培养10天；步骤三、接入第二固体培养基进行继代培养60天；步骤四、接入第三固体培养基进行生根培养30天；步骤五、接入第四固体培养基再次进行生根培养30天；组培箱中设置黄光灯管与紫光灯管，期间喷布雾化的液体培养基。本发明从结果枝当年抽生枝条带芽的叶作外植体进行组织培养，在培养基中添加不同浓度的激素和营养物质，配合适当的LED光源照射，提高澳洲坚果外植体的萌芽率、增殖率、芽苗伸长长度以及生根率。
Description
技术领域
本发明涉及澳洲坚果的组培领域。更具体地说，本发明涉及一种澳洲坚果的组织培养方法。
背景技术
澳洲坚果，又名昆士兰栗、夏威夷果。其种仁富含不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素等，营养价值高，风味十分独特，素有“干果之王”之称。澳洲坚果市场前景看好，生态效益、经济效益具佳，是一种含油量高、营养丰富、风味独特的食用坚果，在国际市场上一直处于供不应求状态。
组织培养繁殖已应用于许多林木、木本果树和观赏性作物的快速繁殖。同时，由于采用组织培养进行繁殖可产生无污染的植物，可有效降低植物疫病传播风险，因此，组织培养也提高了种质交换的安全性。在山龙眼科其他植物，如多花银叶树、红花银桦、高氏白澳山龙眼、极美泰洛泊等已有相关的研究报道。目前,建立适合于澳洲坚果的组织培养方法较少,主要是由于澳洲坚果的外植体在生根培养中生根胶南,因此，开展澳洲坚果组织培养技术的研究，建立一套适合于澳洲坚果的组织培养体系，对加快澳洲坚果的良种繁育进程具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种澳洲坚果的组织培养方法，其从结果枝当年抽生枝条带芽的叶作外植体进行组织培养，在培养基中添加不同浓度的激素和营养物质，配合适当的LED光源照射，提高澳洲坚果外植体的萌芽率、增殖率、芽苗伸长长度以及生根率。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种澳洲坚果的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一、剪取澳洲坚果成年结果树的结果枝当年抽生枝条，切下梢基部的发育未完全的叶，取叶腋里带芽的叶作外植体，用1g/L升汞浸泡3min后用无菌水冲洗，重复5次；
步骤二、接入第一固体培养基进行初代培养10天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照6h、光照强度2000lux，人工光照6h、光通量密度为80μmol/m2·s，第一固体培养基为1/2MS、7g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、2g/L的碳粉、15g/L的糖蜜发酵液、15mg/L的蛋白胨，pH为5.8；
步骤三、接入第二固体培养基进行继代培养60天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照5h、光照强度2000lux，人工光照7h、光通量密度为80μmol/m2·s，第二固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10mg/L的赤霉素、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2g/L的肌醇、1mg/L的烟酸、5mg/L的多效唑，pH为5.8；
步骤四、接入第三固体培养基进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照4h、光照强度2000lux，人工光照8h、光通量密度为80μmol/m2·s，第三固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、1mg/L的盐酸硫胺素、2g/L的肌醇、1mg/L的钼酸钠、5mg/L的硼酸，pH为5.8；
步骤五、接入第四固体培养基再次进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照3h、光照强度2000lux，人工光照9h、光通量密度为80μmol/m2·s，第四固体培养基为1/2QL、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、5mg/L的萘乙酸、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2mg/L的盐酸吡哆醇、80mg/L的乙二胺四乙酸二钠，pH为5.8；
其中，步骤二～五均在组培箱中进行，组培箱中设置等数量的黄光灯管与紫光灯管，黄光灯管的波长为580nm，紫光灯管的波长为410nm，步骤二的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:1，期间喷布雾化的液体培养基，喷布10min、暂停5min，重复4次，步骤三的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为5:7，期间喷布雾化的液体培养基，喷布15min、暂停5min，重复6次，步骤四的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:2，期间喷布雾化的液体培养基，喷布20min、暂停10min，重复6次，步骤五的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:3，期间喷布雾化的液体培养基，喷布30min、暂停10min，重复6次，所述液体培养基为1/2MS、20g/L的蔗糖。
优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养方法，还包括：
步骤六、将生根幼苗置于25℃下炼苗7天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的砂床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔5天掀开聚乙烯膜通风5h。
优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养方法，所述组培箱包括：
箱体，其包括四根立柱与八根横柱形成的横截面为方形的框架结构；
盖体，其铰接在所述箱体的一根横柱上，形成可封闭或敞开的盖，所述盖体朝向所述箱体内部的表面上设有联通的雾化喷嘴与储液盒，所述储液盒内储存有液体培养基；
四个培养盘，其自上而下铰接在所述箱体的同一根立柱上，所述培养盘的高度与所述立柱的高度比为1:4，所述培养盘的横截面与所述箱体的横截面投影重合，所述培养盘的侧壁上均匀分布有黄光灯管与紫光灯管，且其中一对侧壁上相对设有长条形散热孔，所述培养盘的底部以多个行和列的形式设有多个培养皿，位于上方的三个培养盘的行与列之间均设有透气孔，且自上至下尺寸依次减小。
优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养方法，所述培养盘上设有3×3的培养皿，所述透气孔为井字形，位于上方的三个培养盘透气孔的宽度自上至下的比例为3:2:1。
优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养方法，所述散热孔的上边缘的外侧向下延伸出一挡板，所述挡板的竖向投影覆盖所述散热孔的竖向投影。
优选的是，所述的澳洲坚果的组织培养方法，所述培养皿为上大下小的结构。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明通过选择结果枝当年抽生枝条带芽的叶作外植体，初代培养、继代培养采用改良的1/2MS培养基，生根培养利用诱导生根和大量生根两步法培养，采用改良的1/2MS培养基与1/2QL培养基，配合LED光源光照条件，短时间内获得大量的无菌苗，增殖率和生根率显著提高，平均根长和平均根数显著增加，打破了气候和土壤对澳洲坚果繁殖的限制，移栽后成活率高，有效解决扦插根系不发达、嫁接成活率低的问题；
第二、本发明的第一固体培养基加入碳粉提供碳源、糖蜜发酵液补充糖和蛋白胨补充有机氮，形成密实的不定芽愈伤组织，第二固体培养基加入肌醇、烟酸补充有机物，少量多效唑与赤霉素配合，促进对愈伤组织的诱导、生长、分化，在小苗基部愈伤组织萌发丛生小苗，第三固体培养基加入盐酸硫胺素、肌醇补充有机物，钼酸钠、硼酸补充微量元素，小苗基部形成根原基，第四固体培养基加入盐酸吡哆醇补充有机物、乙二胺四乙酸二钠补充大量元素，根原基上长出白色根系；
第三、本发明打破常规使用610～720nm光照辐射，采用适合于澳洲坚果生长的可吸收光即黄光与紫光，通过调节数量比进而调节光照强度，冷光源不产生热量，降低基质蒸发干燥速度，促进不同阶段的分化速度、促进长势；
第四、本发明提供一种适用于澳洲坚果组织培养的组培箱，结合其对光照的特殊需求设置黄光灯管与紫光灯管，光照过程中通过在盖体上增加雾化喷嘴、培养盘上设置透气孔供液体培养基的喷雾气氛穿过，自然光照阶段将四个培养箱转动至完全互不覆盖的位置进行培养，人工光照阶段将四个培养箱转动至上下覆盖的位置进行相对封闭培养，散热孔进行空气对流，促进各阶段的分化与生长。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的结构示意图；
图2为本发明进行自然光照时的组培箱的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“设置”应做广义理解，例如，可以是固定相连、设置，也可以是可拆卸连接、设置，或一体地连接、设置。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
<实施例1>
一种澳洲坚果的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一、剪取澳洲坚果成年结果树的结果枝当年抽生枝条，切下梢基部的发育未完全的叶，取叶腋里带芽的叶作外植体，用1g/L升汞浸泡3min后用无菌水冲洗，重复5次；
步骤二、接入第一固体培养基进行初代培养10天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照6h、光照强度2000lux，人工光照6h、光通量密度为80μmol/m2·s，第一固体培养基为1/2MS、7g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、2g/L的碳粉、15g/L的糖蜜发酵液、15mg/L的蛋白胨，pH为5.8；
步骤三、接入第二固体培养基进行继代培养60天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照5h、光照强度2000lux，人工光照7h、光通量密度为80μmol/m2·s，第二固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10mg/L的赤霉素、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2g/L的肌醇、1mg/L的烟酸、5mg/L的多效唑，pH为5.8；
步骤四、接入第三固体培养基进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照4h、光照强度2000lux，人工光照8h、光通量密度为80μmol/m2·s，第三固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、1mg/L的盐酸硫胺素、2g/L的肌醇、1mg/L的钼酸钠、5mg/L的硼酸，pH为5.8；
步骤五、接入第四固体培养基再次进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照3h、光照强度2000lux，人工光照9h、光通量密度为80μmol/m2·s，第四固体培养基为1/2QL、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、5mg/L的萘乙酸、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2mg/L的盐酸吡哆醇、80mg/L的乙二胺四乙酸二钠，pH为5.8；
其中，步骤二～五均在组培箱中进行，组培箱中设置等数量的黄光灯管与紫光灯管，黄光灯管的波长为580nm，紫光灯管的波长为410nm，步骤二的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:1，期间喷布雾化的液体培养基，喷布10min、暂停5min，重复4次，步骤三的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为5:7，期间喷布雾化的液体培养基，喷布15min、暂停5min，重复6次，步骤四的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:2，期间喷布雾化的液体培养基，喷布20min、暂停10min，重复6次，步骤五的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:3，期间喷布雾化的液体培养基，喷布30min、暂停10min，重复6次，所述液体培养基为1/2MS、20g/L的蔗糖；
如图1、2所示，所述组培箱包括：
箱体1，其包括四根立柱与八根横柱形成的横截面为方形的框架结构；
盖体2，其铰接在所述箱体1的一根横柱上，形成可封闭或敞开的盖，所述盖体2朝向所述箱体1内部的表面上设有联通的雾化喷嘴21与储液盒，所述储液盒内储存有液体培养基；
四个培养盘3，其自上而下铰接在所述箱体1的同一根立柱上，所述培养盘3的高度与所述立柱的高度比为1:4，所述培养盘3的横截面与所述箱体1的横截面投影重合，所述培养盘3的侧壁上均匀分布有黄光灯管31与紫光灯管32，且其中一对侧壁上相对设有长条形散热孔33，所述培养盘3的底部以多个行和列的形式设有多个培养皿34，位于上方的三个培养盘3的行与列之间均设有透气孔35，且自上至下尺寸依次减小；
其中，所述培养盘3上设有3×3的培养皿34，所述透气孔35为井字形，位于上方的三个培养盘3透气孔35的宽度自上至下的比例为3:2:1；所述散热孔33的上边缘的外侧向下延伸出一挡板，所述挡板的竖向投影覆盖所述散热孔33的竖向投影；所述培养皿34为上大下小的结构；
步骤六、将生根幼苗置于25℃下炼苗7天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的砂床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔5天掀开聚乙烯膜通风5h。
<对比例1>
一种澳洲坚果的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一、剪取澳洲坚果成年结果树的结果枝当年抽生枝条，切下梢基部的发育未完全的叶，取叶腋里带芽的叶作外植体，用1g/L升汞浸泡3min后用无菌水冲洗，重复5次；
步骤二、接入第一固体培养基进行初代培养10天，培养温度为25℃、光照12h/天，第一固体培养基为1/2MS、7g/L的琼脂、30g/L的蔗糖，pH为5.8；
步骤三、接入第二固体培养基进行继代培养60天，培养温度为25℃、光照12h/天，第二固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10mg/L的赤霉素、15g/L的琼脂、30g/L的蔗糖，pH为5.8；
步骤四、接入第三固体培养基进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，第三固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、15g/L的琼脂、30g/L的蔗糖，pH为5.8；
步骤五、接入第四固体培养基再次进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，第四固体培养基为1/2QL、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、5mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖，pH为5.8；
步骤六、将生根幼苗置于25℃下炼苗7天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的砂床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔5天掀开聚乙烯膜通风5h。
移栽初期要特别注意保持砂床基质和空气湿度，一般需全封闭管理一周左右，根据情况在20天左右可以逐步通风，并除去覆盖物，在春秋季节移栽时，需遮荫10天左右；冬季移栽时，遮荫20天左右，但关键是控制苗床温度在15～25℃之间才有利于成活，一般过渡移栽两个月以后，小苗就可换盆移栽。
<对比例2>
一种澳洲坚果的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一、剪取澳洲坚果成年结果树的结果枝当年抽生枝条，切下梢基部的发育未完全的叶，取叶腋里带芽的叶作外植体，用1g/L升汞浸泡3min后用无菌水冲洗，重复5次；
步骤二、接入第一固体培养基进行初代培养10天，培养温度为25℃、光照12h/天，第一固体培养基为1/2MS、7g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、2g/L的碳粉、15g/L的糖蜜发酵液、15mg/L的蛋白胨，pH为5.8；
步骤三、接入第二固体培养基进行继代培养60天，培养温度为25℃、光照12h/天，第二固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10mg/L的赤霉素、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2g/L的肌醇、1mg/L的烟酸、5mg/L的多效唑，pH为5.8；
步骤四、接入第三固体培养基进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，第三固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、1mg/L的盐酸硫胺素、2g/L的肌醇、1mg/L的钼酸钠、5mg/L的硼酸，pH为5.8；
步骤五、接入第四固体培养基再次进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，第四固体培养基为1/2QL、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、5mg/L的萘乙酸、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2mg/L的盐酸吡哆醇、80mg/L的乙二胺四乙酸二钠，pH为5.8；
步骤六、将生根幼苗置于25℃下炼苗7天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的砂床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔5天掀开聚乙烯膜通风5h。
<对比例3>
一种澳洲坚果的组织培养方法，同实施例1，不同的是，步骤一中截取2cm长含有芽的茎段为外植体。
各组织培养方法的萌芽率、每个外植体产生的平均芽苗数、芽苗的平均长度、生根率、平均生根数、平均根长、苗高等数据如表1所示。
表1
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (6)
1.一种澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、剪取澳洲坚果成年结果树的结果枝当年抽生枝条，切下梢基部的发育未完全的叶，取叶腋里带芽的叶作外植体，用1g/L升汞浸泡3min后用无菌水冲洗，重复5次；
步骤二、接入第一固体培养基进行初代培养10天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照6h、光照强度2000lux，人工光照6h、光通量密度为80μmol/m2·s，第一固体培养基为1/2MS、7g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、2g/L的碳粉、15g/L的糖蜜发酵液、15mg/L的蛋白胨，pH为5.8；
步骤三、接入第二固体培养基进行继代培养60天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照5h、光照强度2000lux，人工光照7h、光通量密度为80μmol/m2·s，第二固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10mg/L的赤霉素、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2g/L的肌醇、1mg/L的烟酸、5mg/L的多效唑，pH为5.8；
步骤四、接入第三固体培养基进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照4h、光照强度2000lux，人工光照8h、光通量密度为80μmol/m2·s，第三固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、1mg/L的盐酸硫胺素、2g/L的肌醇、1mg/L的钼酸钠、5mg/L的硼酸，pH为5.8；
步骤五、接入第四固体培养基再次进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照3h、光照强度2000lux，人工光照9h、光通量密度为80μmol/m2·s，第四固体培养基为1/2QL、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、5mg/L的萘乙酸、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2mg/L的盐酸吡哆醇、80mg/L的乙二胺四乙酸二钠，pH为5.8；
其中，步骤二～五均在组培箱中进行，组培箱中设置等数量的黄光灯管与紫光灯管，黄光灯管的波长为580nm，紫光灯管的波长为410nm，步骤二的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:1，期间喷布雾化的液体培养基，喷布10min、暂停5min，重复4次，步骤三的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为5:7，期间喷布雾化的液体培养基，喷布15min、暂停5min，重复6次，步骤四的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:2，期间喷布雾化的液体培养基，喷布20min、暂停10min，重复6次，步骤五的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:3，期间喷布雾化的液体培养基，喷布30min、暂停10min，重复6次，所述液体培养基为1/2MS、20g/L的蔗糖。
2.如权利要求1所述的澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，还包括：
步骤六、将生根幼苗置于25℃下炼苗7天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的砂床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔5天掀开聚乙烯膜通风5h。
3.如权利要求1所述的澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，所述组培箱包括：
箱体，其包括四根立柱与八根横柱形成的横截面为方形的框架结构；
盖体，其铰接在所述箱体的一根横柱上，形成可封闭或敞开的盖，所述盖体朝向所述箱体内部的表面上设有联通的雾化喷嘴与储液盒，所述储液盒内储存有液体培养基；
四个培养盘，其自上而下铰接在所述箱体的同一根立柱上，所述培养盘的高度与所述立柱的高度比为1:4，所述培养盘的横截面与所述箱体的横截面投影重合，所述培养盘的侧壁上均匀分布有黄光灯管与紫光灯管，且其中一对侧壁上相对设有长条形散热孔，所述培养盘的底部以多个行和列的形式设有多个培养皿，位于上方的三个培养盘的行与列之间均设有透气孔，且自上至下尺寸依次减小。
4.如权利要求3所述的澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，所述培养盘上设有3×3的培养皿，所述透气孔为井字形，位于上方的三个培养盘透气孔的宽度自上至下的比例为3:2:1。
5.如权利要求3所述的澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，所述散热孔的上边缘的外侧向下延伸出一挡板，所述挡板的竖向投影覆盖所述散热孔的竖向投影。
6.如权利要求3所述的澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，所述培养皿为上大下小的结构。
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