CN105385769A - 一种用于鉴别谷子品种的ssr分子标记方法及应用 - Google Patents

一种用于鉴别谷子品种的ssr分子标记方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别谷子品种的SSR分子标记方法及应用，属于植物品种鉴别技术领域。本发明所提供的方法提取谷子DNA，利用谷子DNA和5对SSR核心引物进行PCR扩增反应，电泳检测后根据电泳检测结果鉴别谷子品种；所述5对SSR核心引物的核苷酸序列如SEQID？NO.1-10所示。本发明所提供的方法能有效的区分谷子品种，为进一步鉴别大量谷子品种提供了重要途径。

Description

一种用于鉴别谷子品种的SSR分子标记方法及应用
技术领域
本发明涉及一种用于鉴别谷子品种的SSR分子标记方法及应用，属于植物品种鉴别技术领域。
背景技术
谷子属禾木科狗尾草属作物，具有生育期短、耐旱、耐瘠等生理特性，广泛分布于亚欧大陆的温带和热带，是中国黄河中上游地区主要栽培作物之一。同时，谷子营养价值极高，含有丰富的氨基酸、蛋白质、维生素以及钙、铜、铁、锌、硒、碘、镁等微量元素，营养保健作用也非常显著。多年来，品种鉴定是以形态学标记为依据的。这种方法虽然简单经济，但周期长，花费大，受季节限制，而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子影响，从而制约了鉴定的准确性。DNA分子标记技术则具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单等优点，已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究。SSR标记是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记。由于SSR分子标记具有数量丰富、多态性高、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，已应用于作物遗传学研究。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于鉴别谷子品种的SSR分子标记方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种用于鉴别谷子品种的SSR分子标记方法，该方法是提取谷子DNA，利用谷子DNA和5对SSR核心引物进行PCR扩增反应，电泳检测后根据电泳检测结果鉴别谷子；所述5对SSR核心引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-10所示。
优选地，所述方法步骤如下：
1)提取谷子DNA；
2)利用步骤1)所得谷子DNA和5对SSR核心引物进行PCR扩增反应，然后进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；所述SSR核心引物，每对包括一个正向引物和一个反向引物，5对SSR核心引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-10所示；所述PCR扩增反应，包括10×PCRbuffer，25mMMgCl2，10mMdNTP，10mM正向引物，10mM反向引物，5U/μLTaq酶，50ng/μL模板DNA和ddH2O；
3)观察步骤2)的电泳结果，统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有差异性条带时赋值为1，无差异性条带时赋值为0，根据记录结果计算遗传相似系数，鉴别谷子品种。
优选地，步骤1)所述提取谷子DNA，是取谷子幼芽，液氮冷冻后于-80℃保存备用，然后利用植物基因组试剂盒提取谷子DNA。
更优选地，所述谷子幼芽，为谷子发芽后10d-15d的幼芽。
优选地，步骤1)所述谷子，品种为勾根红、龙爪、小白谷、钱串、刀把齐、大粒黄、白沙谷、气死风、老来变、小金苗、大斗黄、老头背、黄粘谷、大粒黄、水红根、盖州红、鸭子嘴、大头黄、大白毛、糜子亮、友谊谷、黑粘谷、五爪黄粘谷、四玉红、嘎嘎青、钻头白、紫根白、昌平谷、双桥富兴庄、小旱谷、耧狸秀、小黄谷、大叶黄谷、紫梗刀把齐、钱串紧谷、四寸红根、红根绳子头、细皮白谷、母鸡嘴、大满谷、干尖糙、六十天还仓、缰绳头、金苗黄、磨里谷。
优选地，步骤3)所述PCR扩增反应，包括10×PCRbuffer，25mMMgCl2，10mMdNTP，10mM正向引物，10mM反向引物，5U/μLTaq酶，50ng/μL模板DNA和ddH2O。
更优选地，步骤3)所述PCR扩增反应，体系总体积为25μL，其中包括10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl23μL，10mMdNTP1.25μL，10mM正向引物1μL，10mM反向引物1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，50ng/μL模板DNA1μL，ddH2O16.5μL。
优选地，步骤3)所述PCR扩增反应，程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
优选地，所述方法具体步骤为：
1)谷子DNA的提取：取发芽后10d-15d的谷子幼芽，液氮冷冻后于-80℃保存备用，利用植物基因组试剂盒提取谷子幼芽的DNA，获得谷子DNA；
2)PCR扩增和电泳检测：利用步骤1)所得谷子DNA和5对核苷酸序列如SEQIDNO.1-10所示的SSR核心引物进行PCR扩增反应；然后对PCR产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；
所述SSR核心引物，每对包括一个正向引物和一个反向引物；所述PCR扩增反应，体系总体积为25μL，其中包括10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl23μL，10mMdNTP1.25μL，10mM正向引物1μL，10mM反向引物1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，50ng/μL模板DNA1μL，ddH2O16.5μL；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
3)观察步骤2)的电泳结果，统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有差异性条带时赋值为1，无差异性条带时赋值为0，根据记录结果计算遗传相似系数，鉴别谷子品种。
以上所述任一方法在鉴别谷子品种中的应用。本发明有益效果：
1、本发明利用SSR分子标记对45个谷子品种进行鉴别，结果表明：5对谷子SSR引物共扩增出33个等位基因，平均每对引物6.6个等位基因；各引物的多态信息指数为0.665～0.830，平均值为0.761；通过NTsys-pc2.11进行各品种间遗传相似系数的计算，各品种间遗传相似系数在0.5758～0.9394之间，45个谷子品种的平均遗传相似系数为0.7368；选用的5对谷子引物均有良好的多态性及鉴别能来，能有效将45个谷子品种区分，为进一步鉴别大量谷子品种提供了重要途径。
2、本发明仅利用5对谷子引物就能够将谷子品种有效鉴别开，鉴别准确率高达100％，在进一步鉴别大量谷子品种方面具有很大潜力，与现有专利相比，效果更佳，更节约时间、成本等。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中谷子品种名称及资源库号均来自于中国作物种质信息网。
实施例1：方法的建立
1、准备谷子材料：将狼尾巴、白流沙、押死车1、白沁州黄、老来变、红粘谷、刀把齐、勾根红、钱串子、大青苗、黄粘谷、红谷子、黄谷、鸭子嘴、大粒黄、红苗谷这15种谷子材料种植于温室；取发芽后10d-15d左右的谷子幼芽，液氮冷冻后放入-80℃超低温冰箱中保存备用；15种谷子品种的信息如表1所示。
表115种谷子品种信息
序号 资源库号 实验编号 名称 序号 资源库号 实验编号 名称
1 00005894 CS01 狼尾巴 9 00000090 FS05 大青苗
2 00005897 CS02 白流沙 10 00000098 FS06 黄粘谷
3 00014308 CS03 押死车1 11 00000122 FS07 红谷子
4 00014321 CS04 白沁州黄 12 00000136 FS08 黄谷
5 00000011 FS01 老来变 13 00000198 FS09 鸭子嘴
6 00000053 FS02 红粘谷 14 00000523 FS10 大粒黄
7 00000058 FS03 刀把齐 15 00000529 FS11 红苗谷
8 00000070 FS04 钱串子
2、谷子DNA的提取：用植物基因组试剂盒提取各种谷子材料的DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度；将各材料的DNA浓度稀释至50ng/μL后，置于-20℃冰箱中备用；
3、PCR扩增反应、电泳检测：PCR反应总体积为25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTP(10mM)1.25μL，正向引物(10mM)1μL，反向引物(10mM)1μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA(50ng/μL)1μL，ddH2O16.5μL；PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR扩增产物中加入6倍的Loadingbuffer4μL，取1.5μL上样，用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。
4、选用4个来源于不同基因组谷子的参比种质(CS01～CS04)，对本实验中合成的130对SSR引物进行初筛，根据扩增产物多态性，选出45对在不同基因组谷子之间都有差异的引物；然后再用11个参比种质材料(FS01～FS11)对这些多态性引物进行复筛，谷子SSR复筛引物多态性信息见表2；最后选出了条带清晰、便于统计，且在不同谷子质间有良好多态性的5对引物作为SSR核心引物。谷子SSR核心引物扩增的结果参见表3。非核心引物信息见表4。
表2谷子SSR复筛引物扩增结果
引物名称 Na PIC 引物名称 Na PIC
SiG01 4 0.656 SiG24 3 0.144
SiG02 6 0.768 SiG25 2 0.369
SiG03 6 0.724 SiG26 2 0.306
SiG04 6 0.792 SiG27 3 0.132
SiG05 4 0.627 SiG28 3 0.192
SiG06 2 0.365 SiG29 2 0.391
SiG07 2 0.156 SiG30 2 0.264
SiG08 2 0.365 SiG31 2 0.111
SiG09 3 0.405 SiG32 2 0.426
SiG10 2 0.205 SiG33 2 0.283
SiG11 3 0.221 SiG34 2 0.190
SiG12 3 0.123 SiG35 2 0.261
SiG13 2 0.259 SiG36 2 0.132
SiG14 1 0 SiG37 3 0.459
SiG15 3 0.403 SiG38 2 0.351
SiG16 3 0.480 SiG39 3 0.398
SiG17 2 0.348 SiG40 1 0
SiG18 2 0.215 SiG41 2 0.222
SiG19 3 0.342 SiG42 3 0.366
SiG20 3 0.144 SiG43 2 0.140
SiG21 3 0.115 SiG44 2 0.258
SiG22 3 0.295 SiG45 2 0.364
SiG23 2 0.187
表3谷子SSR核心引物扩增结果
表4非核心引物信息
5、统计分析：观察PCR产物电泳结果，Gel-Proanalyzer软件统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有此带时赋值为“1”，无此带时赋值为“0”，构建各品种相应0、1字符；记录结果利用NTsys-pc2.11计算遗传相似系数。
6、结果与分析：
6A、采用试剂盒提取的谷子DNA条带清晰明亮，无降解现象，DNA完整性好，分光光度计检测发现A260/280比值在1.8～2.0之内，均能满足PCR的要求。
6B、在所用的130对引物中有效扩增引物有104对，占总扩增引物的77.0％；在不同基因组谷子间具有多态性的引物为45对，占有效扩增引物的43.3％。根据11个谷子品种扩增结果(表2)，SiG01～SiG05的等位基因数较高、多态性良好、PIC值均大于0.6；SiG06～SiG45的多态信息含量偏低，对参比种质材料的鉴别效果不理想，利用SiG06～SiG45不能有效鉴别谷子品种。因此，选择SiG01～SiG05作为谷子种质资源鉴别的SSR核心引物，且仅有这5对引物可以有效鉴别，其他引物鉴别效果均不理想。
6C、根据扩增结果，5对谷子SSR引物共得到26个等位基因，平均每对引物5.2个等位基因；11个谷子品种0、1字符见表5；各引物的多态信息指数为0.627～0.792，平均值为0.713，其中扩增多态性最好的引物为SiG04；结果表明，选用的引物均有良好的多态性。
表511个谷子品种0、1字符
实验编号 名称 0、1字符
FS01 老来变 01000001000010000000011000
FS02 红粘谷 00100001000100010010000001
FS03 刀把齐 00100000010100000100000100
FS04 钱串子 10000100001000001000001000
FS05 大青苗 01000001000100000100000100
FS06 黄粘谷 10000010001000101001001000
FS07 红谷子 01010000010100000001010100
FS08 黄谷 10001000001000000000100001
FS09 鸭子嘴 01010000100001000000010011
FS10 大粒黄 00101000001000000010000100
FS11 红苗谷 00101000010010010100100001
表611个谷子品种间的遗传相似系数
FS01 FS02 FS03 FS04 FS05 FS06 FS07 FS08 FS09 FS10 FS11
FS01 1.0000
FS02 0.6538 1.0000
FS03 0.6154 0.7308 1.0000
FS04 0.6923 0.5769 0.6154 1.0000
FS05 0.7692 0.7308 0.8462 0.6154 1.0000
FS06 0.6154 0.5000 0.5385 0.8462 0.5385 1.0000
FS07 0.6923 0.5769 0.7692 0.5385 0.7692 0.5385 1.0000
FS08 0.6154 0.6538 0.6154 0.7692 0.6154 0.6923 0.5385 1.0000
FS09 0.6923 0.5769 0.5385 0.5385 0.6154 0.4615 0.6923 0.6154 1.0000
FS10 0.6154 0.7308 0.7692 0.6923 0.6923 0.6154 0.6154 0.7692 0.5385 1.0000
FS11 0.5769 0.6923 0.7308 0.5000 0.5769 0.4231 0.5000 0.7308 0.5000 0.6538 1.0000
6D、根据SSR分析得到的个品种0、1字符，利用NTsys-pc2.11计算出11个谷子品种间的遗传相似系数(表6)，遗传相似系数为1，则为同一个品种，遗传相似系数不为1，则不是一个品种。各品种间遗传相似系数在0.4231～0.8462之间，FS06与FS11之间的遗传相似系数最小，FS03与FS05、FS04与FS06遗传相似系数最大，11个品种的平均遗传相似系数为0.6350；由此可以看出，这5对引物能有效区分11个谷子品种。
实施例2
本实施例提供了一种采用SSR分子标记技术鉴别谷子品种方法，包括如下步骤：
1、准备谷子材料：将勾根红、龙爪、小白谷、钱串、刀把齐、大粒黄、白沙谷等45种谷子材料种植于温室；取发芽后10d-12d左右的谷子幼芽，液氮冷冻后放入-80℃超低温冰箱中保存备用；45种谷子品种的信息如表7所示。
表745种谷子品种信息
2、谷子DNA的提取：用植物基因组试剂盒提取各种谷子材料的DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度；将各材料的DNA浓度稀释至50ng/μL后，置于-20℃冰箱中备用；
3、SSR引物：实例1中复筛选出的5对适合谷子品种鉴定的SSR核心引物；
4、PCR扩增反应、电泳检测：PCR反应总体积为25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTP(10mM)1.25μL，正向引物(10mM)1μL，反向引物(10mM)1μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA(50ng/μL)1μL，ddH2O16.5μL；PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR扩增产物中加入6倍的Loadingbuffer4μL，取1.5μL上样，用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。
5、统计分析：观察PCR产物电泳结果，Gel-Proanalyzer软件统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有此带时赋值为“1”，无此带时赋值为“0”，构建各品种相应0、1字符；记录结果利用NTsys-pc2.11计算遗传相似系数；记录结果利用POPGENE32计算多态信息含量(PIC)、Shannon’s指数(I)、有效等为基因数(Ne)等遗传多样性数据。
6、结果与分析：
6A、采用试剂盒提取的谷子DNA条带清晰明亮，无降解现象，DNA完整性好，分光光度计检测发现A260/280比值在1.8～2.0之内，均能满足PCR的要求；
6B、根据SSR结果，5对谷子SSR引物共得到33个等位基因，平均每对引物6.6个等位基因；45个谷子品种0、1字符见表8；各引物的多态信息指数为0.665～0.830，平均值为0.761，其中扩增多态性最好的引物为SiG02，见表9。所选用的核心引物多态信息指数均大于0.65，由此可以看出，这些引物均有良好的多态性且能有效鉴别45个谷子品种。
表845个谷子品种0、1字符
表9谷子品种鉴定核心引物扩增结果
6C、根据SSR分析得到的个品种0、1字符，利用NTsys-pc2.11计算出45个谷子品种间的遗传相似系数(表10)，各品种间遗传相似系数在0.5758～0.9394之间，45个谷子品种的平均遗传相似系数为0.7368；由此可以看出，选用的引物均有良好的多态性及鉴别能来，能有效将45个谷子品种区分。鉴别准确率高达100％。
表1045个谷子品种间的遗传相似系数
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种用于鉴别谷子品种的SSR分子标记方法，其特征在于，提取谷子DNA，利用谷子DNA和5对SSR核心引物进行PCR扩增反应，电泳检测后根据电泳检测结果鉴别谷子品种；所述5对SSR核心引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-10所示。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)提取谷子DNA；
2)利用步骤1)所得谷子DNA和5对SSR核心引物进行PCR扩增反应，然后进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；所述SSR核心引物，每对包括一个正向引物和一个反向引物，5对SSR核心引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-10所示；所述PCR扩增反应，包括10×PCRbuffer，25mMMgCl2，10mMdNTP，10mM正向引物，10mM反向引物，5U/μLTaq酶，50ng/μL模板DNA和ddH2O；
3)观察步骤2)的电泳结果，统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有差异性条带时赋值为1，无差异性条带时赋值为0，根据记录结果计算遗传相似系数，鉴别谷子是否为同一品种。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述提取谷子DNA，是取谷子幼芽，液氮冷冻后于-80℃保存备用，然后利用植物基因组试剂盒提取谷子DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述谷子幼芽，为谷子发芽后10d-15d的幼芽。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述谷子，品种为勾根红、龙爪、小白谷、钱串、刀把齐、大粒黄、白沙谷、气死风、老来变、小金苗、大斗黄、老头背、黄粘谷、大粒黄、水红根、盖州红、鸭子嘴、大头黄、大白毛、糜子亮、友谊谷、黑粘谷、五爪黄粘谷、四玉红、嘎嘎青、钻头白、紫根白、昌平谷、双桥富兴庄、小旱谷、耧狸秀、小黄谷、大叶黄谷、紫梗刀把齐、钱串紧谷、四寸红根、红根绳子头、细皮白谷、母鸡嘴、大满谷、干尖糙、六十天还仓、缰绳头、金苗黄或磨里谷。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述PCR扩增反应，包括10×PCRbuffer，25mMMgCl2，10mMdNTP，10mM正向引物，10mM反向引物，5U/μLTaq酶，50ng/μL模板DNA和ddH2O。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)所述PCR扩增反应，体系总体积为25μL，其中包括10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl23μL，10mMdNTP1.25μL，10mM正向引物1μL，10mM反向引物1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，50ng/μL模板DNA1μL，ddH2O16.5μL。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述PCR扩增反应，程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤为：
1)谷子DNA的提取：取发芽后10d-15d的谷子幼芽，液氮冷冻后于-80℃保存备用，利用植物基因组试剂盒提取谷子幼芽的DNA，获得谷子DNA；
2)PCR扩增和电泳检测：利用步骤1)所得谷子DNA和5对核苷酸序列如SEQIDNO.1-10所示的SSR核心引物进行PCR扩增反应；然后对PCR产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；
所述SSR核心引物，每对包括一个正向引物和一个反向引物；所述PCR扩增反应，体系总体积为25μL，其中包括10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl23μL，10mMdNTP1.25μL，10mM正向引物1μL，10mM反向引物1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，50ng/μL模板DNA1μL，ddH2O16.5μL；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
3)观察步骤2)的电泳结果，统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统记录，有差异性条带时赋值为1，无差异性条带时赋值为0，根据记录结果计算遗传相似系数，鉴别谷子。
10.根据权利要求1-9所述任一方法在鉴别谷子品种中的应用。
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