CN105385758A

CN105385758A - 可用于检测与喉癌相关的esrrg基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN105385758A
Application number: CN201510851493.4A
Authority: CN
Inventors: 沈志森; 周重昌
Original assignee: LI HUILI HOSPITAL NINGBO CITY MEDICAL CENTER
Current assignee: LI HUILI HOSPITAL NINGBO CITY MEDICAL CENTER
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2035-11-30
Also published as: CN105385758B

Abstract

本发明公开了可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对ESRRG基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ？ID？NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ？ID？NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对喉癌的检测，检测效率高，针对性强，同时，以ESRRG基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为喉癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

Description

可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种辅助诊断喉癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。

背景技术

喉癌(Laryngealcarcinoma，LC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国北方地区位于头颈部恶性肿瘤的第一位，在我国南方地区，仅次于鼻咽癌居于第二位：在世界范围内，居于全身恶性肿瘤的第十一位，约占全球每年新发恶性肿瘤的1-2.5%，其中喉鳞状细胞癌约占90％。目前研究表明喉癌的发生发展与生活习惯、环境因素、遗传和表观遗传学等多种复杂的因素相关。近年来，随着人们生活水平的提高，环境因素恶化等影响，我国喉癌的发病率和死亡率增长迅速，而且发病年龄明显提前。由于喉癌的早期症状不明显，病理学活检是其诊断的金标准，确诊时患者多数已进入中、晚期，许多患者在疾病发生的早期没有得到及时的诊断和治疗，对喉癌的治疗和预后带来了极差的影响。尽管近几十年来外科技术和辅助治疗得到不同程度的提高，但是目前喉癌的五年生存率仍未明显增长，原因之一就是目前喉癌发病的分子学机制仍不清楚，早期诊断及治疗不理想。因此，有必要探索具有高敏感性和特异性的分子检测指标，对喉癌患者做到早发现，早诊断，早治疗，提高喉癌患者总体生存率。

雌激素相关受体伽马（estrogen-relatedreceptorgamma，ESRRG)是雌激素相关受体(Estrogen-relatedreceptors，ERRs)家族中的一员，定位于染色体1q41（chr1:216676588-217311097），cDNA全长3.0kb，编码一条长458氨基酸多肽链。因其尚未发现天然配体，故也称为孤核受体。雌激素相关受体可通过两个锌指结构组成的DNA结合域，和其它转录因子之间相互作用或结合DNA序列上的反应元件，调控多种基因的转录，参与细胞增殖、分化、凋亡、胞内信号传导、核内信号信息的交流等过程。最近国内外的一些研究表明，通过上调雌激素相关受体伽马的表达可增加E-钙黏蛋白表达，继而促进间质向上皮转化，并在体内抑制乳腺癌的生长。同样，将雌激素相关受体伽马基因前体进转染入前列腺癌细胞系LnCaP和DU145，可在体外显著抑制肿瘤增殖和在体内抑制肿瘤形成，表明雌激素相关受体伽马（estrogen-relatedreceptorgamma，ESRRG)在多种肿瘤中起到抑癌基因的作用。但是目前，国内外还没有公开任何关于在喉癌中用于检测雌激素相关受体伽马基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因ESRRG甲基化水平与喉癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断喉癌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括ESRRG基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：

5’-TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG-3’；

所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：

5’-Biotin-TCTTTTCAAATCCATCACTAA-3’；

所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：

5’-GGGAGATGAATTGGG-3’。

上述可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于喉癌辅助检测、诊断或药物治疗中。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含雌激素相关受体伽马基因启动子区的甲基化特异性上游引物、甲基化特异性下游引物及其甲基化特异性测序引物。雌激素相关受体伽马基因启动子区域的高甲基化，影响转录因子与DNA间的相互作用，或改变染色质结构从而导致雌激素相关受体伽马基因的低表达，从而影响喉癌的发生和发展。因此，雌激素相关受体伽马基因启动子区甲基化水平与喉癌的患病率呈正相关，通过检测雌激素相关受体伽马基因启动子区甲基化程度辅助诊断喉癌，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于喉癌的早期发现和及时治疗。

综上所述，以基因ESRRG启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对喉癌的检测，同时，以ESRRG基因启动子区域DNA甲基化为靶点的药物有望成为喉癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

附图说明

图1为被检测序列所在区域（具体位置为chr1:217311596-217311629），以及所检测的6个CpG点之间的关联性分析结果（例如CpG1与CpG2的相关系数为0.891，CpG2与CpG3的相关系数为0.942）；

图2为DNA甲基化水平检测结果示意图（如图示CpG1到CpG6的甲基化程度分别为66%，64%，61%，61%，65%，66%）；图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平（即阴影框对应的上方数字）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例

1、研究对象的收集

本研究选取宁波市某三甲医院手术切除的喉癌患者93例手术标本作为研究对象。所有病例诊断，依据患者的临床资料、影像学和纤维喉镜镜检查等，并得到术后病理诊断确认。手术切除喉癌组织和癌旁组织（距离癌组织至少5cm以上的正常组织）立即保存于-80度液氮，用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研究对象都签署知情同意书。

2、基因组DNA的提取

采用QIAampDNAMiniKit(Qiagen,Hilden,德国)DNA提取试剂盒提取组织全基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，ThermoFisherScientific)检测所得DNA的浓度，以供ESRRG基因启动子区DNA甲基化水平的检测。

3、DNA甲基化水平测定

本实验采用焦磷酸测序技术对ESRRG基因启动子区的6个CpG位点(如图1)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMarkAssayDesign软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：

甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如下：

5’-TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG-3’；

甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如下：

5’-Biotin-TCTTTTCAAATCCATCACTAA-3’；

甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如下：

5’-GGGAGATGAATTGGG-3’。

DNA甲基化水平测定的具体步骤：

第一步：采用EZDNA甲基化试剂盒-Gold(EZDNAMethylation-Gold^TMKit；ZYMORESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；

第二步：取第一步中转化过的DNA样本20ng加入到ZymoTaq^TMPreMix酶(ZymoTaq^TMPreMix，ZYMORESEARCH)，并加入上述趋化素样因子超家族成员3基因启动子区甲基化特异性扩增上游引物和下游引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃10min的变性；接着95℃30s，Tm40s，72℃1min，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃7min(注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)；

第三步：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ24板中预先加入40μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMarkAnnealingBuffer；Qiagen)；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量(每样本3μl)转移到一个微量离心管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液(PyroMarkBindingBuffer；Qiagen)，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物(50μl反应体积)中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入50ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液(PyroMarkWashBuffer；Qiagen)和50ml的变性缓冲液(PyroMarkDenaturationSolution；Qiagen)；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具(PyroMarkVacuumPrepFilterProbes；Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作)；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入)；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃3分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应；

第四步：焦磷酸测序：在PyroMarkQ24焦磷酸测序仪上，采用PyromarkGoldQ24试剂盒(PyromarkGoldQ24Reagents；Qiagen)对第三步中的PSQ24板中的样本进行测序，然后应用PyroMarkCpG软件对结果进行甲基化分析(甲基化水平检测结果示例见图2)。图2中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图2所示CpG1到CpG6的甲基化程度分别为66%，64%，61%，61%，65%，66%。

4、数据分析

本次实验采用SPSS16.0对数据进行整理分析，我们发现：被检测的6个CpG位点间存在显著关联(相关系数r>0.85，p<0.0001，有统计学意义，见图1)(注：p<0.05时表示有统计学意义，下同)，所以我们把CpG1-CpG6求平均值后参与到后续的分析中，发现病例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异(p=1.16×10^-9，见表1)。

表1病例组与对照组间的比较(n=93)

注：n表示样本个数，p值小于0.05，具有统计学意义。

与其他传统的喉癌检测技术相比，此试剂盒技术具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对ESRRG基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为喉癌的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于包括ESRRG基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：

5’-TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG-3’；

5’-Biotin-TCTTTTCAAATCCATCACTAA-3’；

所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：

5’-GGGAGATGAATTGGG-3’。

2.一种权利要求1所述的可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于：该试剂盒可用于喉癌辅助检测、诊断或药物治疗中。