CN105385665A - H9亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株的构建及其应用 - Google Patents

H9亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及H9亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株的构建及其应用。本发明设计构建了一株重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9，该毒株是表达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠炎病毒，可用于制备，制备成活疫苗，可预防鸭瘟和H9亚型禽流感；在构建过程中的缺失UL2基因、携带绿色荧光标记的重组鸭肠炎病毒载体(rDEVΔUL2-GFP)，可通过同源重组的方法，应用该载体表达外源基因，为鸭肠炎病毒作为载体构建抗鸭瘟和其他病原的新型重组疫苗打下基础。

Description

H9亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株的构建及其应用
技术领域
本发明涉及H9亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株的构建及其应用，属于病毒学和兽用生物制品领域。
背景技术
鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)，又名鸭瘟病毒(DuckPlaguevirus)，可感染鸭、鹅及其它雁形目禽类，引起血管损伤、组织出血、消化道粘膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变的一种急性、接触性、败血性传染病——鸭病毒性肠炎(Duckviralenteritis,DVE)，或称鸭瘟(Duckplague,DP)(SandhuandMetwally,2008)。自1923年被首次发现以来(Baudet,1923)，本病相继发生于法国、印度、比利时、英国、泰国和加拿大等国家(殷震和刘景华,1997)，流行范围、感染禽类的种类有逐步扩大的趋势，至少48种雁形目中的禽类对DEV易感(Kaletaetal.,2007)。鸭瘟是一种广泛嗜全身性感染的传染病，发病率和死亡率都很高，给水禽养殖业带来巨大损失。免疫接种是预防和控制该病暴发的重要措施，目前我国用于鸭瘟预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚弱化活疫苗。DEV具有良好的免疫原性，免疫力产生快速，免疫后3天便可抵抗鸭瘟强毒攻击；免疫期长，可达一年。
DEV属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、马立克病毒属、鸭疱疹病毒1型(http://www.ictvonline.org)。李玉峰应用Shot-gun方法首次完成了DEV——我国鸭瘟商品化疫苗(DEVVAC)的全基因组测序。DEVVAC基因组全长为158,089bp，G+C含量为44.91％，由长独特区(UniqueLong,UL)和短独特区(UniqueShort,US)组成，US区两端为一对反向重复序列，分别称为内部重复序列(InternalRepeat,IR)和末端重复序列(TerminalRepeat,TR)。基因组结构为UL-IR-US-TR，呈典型的D型疱疹病毒基因组结构(Lietal.,2009)。我们完成了我国鸭肠炎病毒强毒参考株全基因组序列测定，该毒株基因组全长为162,131bp，共78个ORF，编码76个蛋白(Yangetal.,2014)。与DEVCSC相比，鸡胚连续传代致弱株DEVKp63基因组短4040bp，在UL区的5’端连续缺失3,513bp导致UL56移框突变，以及3’端连续缺失528bp导致UL2缺失176个氨基酸。DEVCSCUL2编码了一个HSV-1同源物——尿嘧啶DNA糖基化酶(uracilDNAglycosylase，UNG)。UNG是一个普遍存在的极保守的DNA修复酶。与DEVCSC相比，DEVKp63UL2在65位氨基酸后缺失176aa，导致缺少前3个结构基序而不能形成HSV-1UL2相似的3D结构(Savvaetal.,1995)和活性中心(Arnoldetal.,2006；Bordolietal.,2009；GuexandPeitsch,1997；Guexetal.,2009；Schwedeetal.,2003)。研究表明，UL2对HSV-1在细胞培养中的正常复制是非必需的，但对病毒在神经元中的复制具有重要作用。通过同源重组的方法，构建了缺失UL2的HSV-1突变体，小鼠颅内直接接种后，其神经毒力比亲本毒低10倍，而外周途径接种后神经毒力低100,000倍(PylesandThompson,1994)。DEVUL2基因是否具有HSV-1相似的功能，有待进一步研究。
自1994年在我国广东某鸡场分离到H9N2亚型禽流感病毒以来，该亚型病毒在我国的鸡、鸭、鹅等禽类中广泛流行，一直呈上升趋势，对鸭致病性逐渐增强，可引起蛋鸭产蛋量下降，沙壳蛋增多，使雏鸭出现呼吸道症状和亚临床症状，此外，还可引起免疫抑制，造成鸭群继发大肠杆菌等疾病，对养鸭也造成重大经济损失。
随着基因工程技术的发展，重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗研究的热点。利用基因工程技术，将外源DNA插入到病毒基因重组，利用病毒表达外源DNA蛋白，制备成一种活载体疫苗。这种疫苗可以同时启动机体细胞和体液免疫，可以通过一次免疫预防多种疾病，降低了生产成本，简化了免疫程序，还能克服不同病毒弱毒疫苗之间的干扰现象。
本发明通过同源重组技术，构建了一株缺失UL2基因196-723位核苷酸、带有GFP标记的重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-GFP株，然后应用绿色荧光蛋白负筛选技术，获得了表达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株。该重组病毒免疫鸭后，能抵抗DEV强毒株的攻击，还能诱导较高的H9HI抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠炎病毒，即本发明先构建了一株缺失UL2基因、携带绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-GFP株，然后应用绿色荧光蛋白负筛选技术，获得了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株。将重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株制备成活疫苗，可预防鸭瘟和H9亚型禽流感。
本发明的技术方案
1.一株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该毒株为鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)rDEVΔUL2-H9株，该病毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11497
2.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株的UL2基因内插入了H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因。
3.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于该毒株作为疫苗生产毒株用于制备H9亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗，预防H9亚型禽流感和鸭瘟。
4.如权利要求3所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于是将该株病毒接种长满单层的无特定病原鸡的鸡胚成纤维细胞，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成所述H9亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗。
5.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于该株病毒缺失了UL2基因196-723位核苷酸，可在此区域插入H5亚型禽流感病毒或/和鸭肝炎病毒或/和鸭黄病毒保护基因并获得稳定、高效表达，制备成鸭肠炎病毒为载体的联合活疫苗。
具体实施方式
1.重组病毒构建
本发明所述的重组病毒为表达H9亚型禽流感病毒HA基因的鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株，该病毒构建方法如下：
(1)载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有CMV启动子、polyA的GFP报告基因载体pT-GFP-gpt(见图1)，由本发明人所在实验室构建、保存。
(2)引物设计
根据GenBank上发表的DEV序列设计合成以下引物：
表1本发明构建所涉及的相关引物信息
(3)含GFP标记的鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-GFP的构建
1)转移载体pT-UL2-GFP-gpt的构建
以鸭肠炎病毒基因组DNA(AV1221)为PCR扩增模板，以引物UL2-uF、UL2-uR扩增UL2基因的左端1185bp片段。以引物UL2-d、UL2-dR扩增UL2基因的右端1302bp片段。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒pT-UL2u和pT-UL2d。用SalI和HindIII双酶切上述重组质粒，分别回收3800bp和1302bp片段，获得重组质粒pT-UL2ud。将重组质粒pT-UL2ud用SalI酶切，电泳回收后去磷酸化；pT-GFP-gpt用SalI酶切，电泳回收2.1kb片段，将GFP-gpt表达盒插入到pT-UL2ud中，获得转移载体pT-UL2-GFP-gpt。
2)同源重组
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书，将转移载体pT-UL2-GFP-gpt与DEV进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：
六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的DEV，吸附1～4小时；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μLLipofectamine2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μLLipofectamine2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μLLipofectamine2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d，每天观察，直至出现重组病毒荧光斑。
3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于0.5mlM199营养液中，冻融1次后接种6孔板CEF细胞，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rDEVΔUL2-GFP。
4)重组病毒rDEVΔUL2-GFP的鉴定
采用ORFC17F、ORFC17R引物进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，重组病毒缺失了UL2基因，并成功插入了GFP标记基因(见图2)。
5)重组病毒rDEVΔUL2-GFP的应用
该株病毒缺失了UL2基因196-723位核苷酸，可在此区域插入H5亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒等的保护基因并获得稳定、高效表达，制备成鸭肠炎病毒为载体的联合活疫苗。
(4)H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H9)的构建
重组病毒rDEVΔUL2-GFP缺失了UL2基因196-723位核苷酸，可在此区域插入H5亚型禽流感病毒HA基因(序列9)获得重组病毒。
1)转移载体pT-UL2-H9的构建
根据GenBank公布的鸭源H9亚型禽流感病毒HA基因序列(序列10)，人工合成HA基因，以H9NheI-F和H9BHI-R引物RT-PCR扩增HA基因。将目的片段连接pMD-18T载体，构建重组质粒pT-H9NBH。分别用NheI和BamHI双酶切重组质粒pT-UL2-GFP-gpt和pT-H9NBH，分别回收6.0kb片段和1.6kb片段，并将两片段连接，获得重组转移载体pT-UL2-H9。
2)同源重组
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-UL2-H9与rDEVΔUL2-GFP病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：
六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的rDEVΔUL2-GFP，吸附1～4小时；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μLLipofectamine2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μLLipofectamine2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μLLipofectamine2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d。
3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察无绿色荧光的蚀斑，挑选单个无荧光蚀斑于0.5mlM199营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，获得重组病毒并将该病毒命名为鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)rDEVΔUL2-H9株，该病毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11497。
4)重组病毒rDEVΔUL2-H9的鉴定
采用ORFC17F、ORFC17R引物进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，HA基因成功插入到UL2基因内(见图3)。
5)重组病毒rDEVΔUL2-H9间接免疫荧光鉴定
将重组病毒rDEVΔUL2-H9及其亲本毒分别接种CEF，当细胞病变达80％时，用间接免疫荧光法检测HA基因的表达情况。
间接免疫荧光步骤：弃去细胞培养液，用PBS(pH7.2)轻洗细胞表面1次，然后每孔加入冷甲醇，置室温固定10～15分钟，弃去甲醇，自然晾干；用PBS(pH7.2)洗细胞面1次，然后分别加入适当稀释的鸡抗DEV单特异性抗体、鸡抗H9单特异性抗体(均由本发明人所在实验室制备、保存)，置37℃作用1小时；弃去鸡抗REV单特异性抗体，用含0.05％吐温-20的PBS(pH7.2)洗3次；每孔加入适当稀释的FITC标记的兔抗鸡IgG(购自SIGMA公司)，置37℃作用1小时；用含0.05％吐温-20的PBS(pH7.2)洗3次；在荧光倒置显微镜下观察。鸡抗DEV单特异性抗体染色后，重组病毒rDEVΔUL2-H9及其亲本毒均出现了特异性荧光；鸡抗H9单特异性抗体染色后，重组病毒rDEVΔUL2-H9出现了特异性荧光，而亲本毒无荧光。结果表明，重组病毒在CEF中表达了HA蛋白。
6)重组病毒rDEVΔUL2-H9病毒含量测定
重组病毒rDEVΔUL2-H9接种CEF，细胞病变达70％-80％时收获，冻融1次后用CEF测定病毒含量，为105.2TCID50/0.1ml。
7)重组病毒rDEVΔUL2-H9遗传稳定性试验
重组病毒rDEVΔUL2-H9病毒在CEF细胞上传代20代，取其第5代、第10代、第15代和第20代毒应用PCR、间接免疫荧光检测，结果表明所获得的重组病毒rDEVΔUL2-H9在CEF中稳定遗传、正确表达HA蛋白(见图4)。
(5)动物试验
将15只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射rDEVΔUL2-H9，每只1000TCID50，第2组肌肉注射DEV亲本毒，每只1000TCID50，第3组不免疫，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后21天，翅静脉采血后，腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCCAV1221)，每只1000MLD。观察14d，每天记录发病死亡情况。攻毒对照组100％死亡，免疫100％保护(表2)，血清中H9HI抗体效价几何平均值为1:64(表3)，说明rDEVΔUL2-H9具有良好的免疫原性。
表2DEV攻毒结果
表3H9HI抗体检测结果
2.疫苗制备及检验
(1)疫苗制备
1)细胞制备选择发育良好的9～11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培养24小时左右长成单层备用。
2)病毒液的制备按体积比0.01％～0.5％的接毒量将生产种毒rDEVΔUL2-H9株接种CEF细胞单层，37～38℃培养36～72小时，当病变率达75％以上收获病毒液，-20℃结冻保存。
3)半成品的检验
①无菌检验每组分别取样，按《中国兽药典》二〇一〇年版三部进行，应无菌生长。
②病毒含量测定每0.1ml病毒含量应≥105.0TCID50。
4)配苗及分装将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装。
5)冻干分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版，化学工业出版社，2001，437页以下称《规程》)附录中的方法迅速进行冷冻真空干燥。
(2)疫苗检验
本发明涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版(三部).中国农业出版社，2011，本发明称《中国兽药典》)的方法进行。
1)性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
2)无菌检验按《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。
3)支原体检验按《中国兽药典》进行检验，应无支原体生长。
4)外源病毒检验按《中国兽药典》进行检验，应无外源病毒污染。
5)鉴别检验将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合，置室温作用60分钟后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔(48孔细胞板)，每孔0.2ml,同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组应全部出现病变，中和组应不出现细胞病变。
6)安全检验用2～4周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽份，观察14日，应全部健活。
7)效力检验
①鸭肠炎病毒部分下列方法任择其一。
病毒含量测定按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔(96孔细胞培养板)，每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed-Muench法计算TCID50。每羽份病毒含量应≥103.5TCID50。
用鸭检验用2～8周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1羽份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注射1000MLD鸭瘟病毒强毒(CVCCAV1221)，观察14日。对照鸭应至少4只死亡，免疫鸭应至少8只保护。
②H9亚型禽流感病毒HA蛋白部分下列方法任择其一。
病毒含量测定按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔(96孔细胞培养板)，每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察96小时。用间接免疫荧光染色方法检测重组鸭肠炎病毒表达的H9亚型禽流感病毒HA蛋白。对照鸡胚成纤维细胞应无特异性荧光，根据每孔绿色荧光情况，按Reed-Muench法计算FAID50。每羽份病毒含量应≥103.5FAID50。
用鸭检验用2～8周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1羽份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。21-28日后，每只鸭静脉注射0.1-0.2mlH9亚型禽流感病毒(含108EID50)。攻毒后第1日和第2日，采集每只鸭的喉拭子于1mlPBS溶液(含1万单位双抗)，将同一只鸭两日的喉拭子混合作为1个样品，每个样品经尿囊腔接种10-11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，在37℃培养5日。每日照蛋1次，及时取出死胚置2-8℃。培养结束时测定死胚、活胚尿囊液的血凝(HA)价,5枚胚中至少1枚鸡胚的胚液的HA价不低于1:16时，判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再判定。免疫鸭应至少由8只病毒分离为阴性，对照鸭应至少有4只病毒分离为阳性。
8)剩余水分测定按《兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。
9)真空度测定按《兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。
附图说明
图1载体pT-GFP-gpt示意图
图2重组病毒rDEVΔUL2-GFP的鉴定
图3重组病毒rDEVΔUL2-H9的鉴定
图4重组病毒rDEVΔUL2-H9遗传稳定性试验
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的微生物为：鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)CVCCAV1221株，又名鸭瘟病毒(中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p138)保存于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心；经分子生物技术，将H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因插入到DEVUL2基因内，获得的重组缺失病毒，命名为H9亚型禽流感病毒重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H9)，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11497。
本发明的积极意义
本发明构建了表达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H9)，将该重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株制备成活疫苗，可预防鸭瘟和H9亚型禽流感；在构建过程中的缺失UL2基因、携带绿色荧光标记的重组鸭肠炎病毒载体(rDEVΔUL2-GFP)，可通过同源重组的方法，应用该载体表达外源基因，为鸭肠炎病毒作为载体构建抗鸭瘟和其他病原的新型重组疫苗打下基础。
实施例
以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。
实施例1
——重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H9株)的构建
本发明所述鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H9株)的构建方法如下：
(1)载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有CMV启动子、polyA的GFP报告基因载体pT-GFP-gpt(见图1)，由本发明人所在实验室构建、保存。
(2)引物设计
根据GenBank上发表的DEV序列设计合成以下引物：见表1。
(3)含GFP标记的鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-GFP的构建
1)转移载体pT-UL2-GFP-gpt的构建
以鸭肠炎病毒基因组DNA为PCR扩增模板，以引物UL2-uF、UL2-uR扩增UL2基因的左端1185bp片段。以引物UL2-d、UL2-dR扩增UL2基因的右端1302bp片段。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒pT-UL2u和pT-UL2d。用SalI和HindIII双酶切上述重组质粒，分别回收3800bp和1302bp片段，获得重组质粒pT-UL2ud。将重组质粒pT-UL2ud用SalI酶切，电泳回收后去磷酸化；pT-GFP-gpt用SalI酶切，电泳回收2.1kb片段，将GFP-gpt表达盒插入到pT-UL2ud中，获得转移载体pT-UL2-GFP-gpt。
2)同源重组
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书，将转移载体pT-UL2-GFP-gpt与DEV进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：
六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的DEV，吸附1～4小时；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μLLipofectamine2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μLLipofectamine2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μLLipofectamine2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d，每天观察，直至出现重组病毒荧光斑。
3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于0.5mlM199营养液中，冻融1次后接种6孔板CEF细胞，如此进行蚀斑纯化3～4次，获得的重组病毒命名为rDEVΔUL2-GFP株。
4)重组病毒rDEVΔUL2-GFP的鉴定
采用ORFC17F、ORFC17R引物进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，重组病毒缺失了UL2基因，并成功插入了GFP标记基因(见图2)。
(4)H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H9)的构建
1)转移载体pT-UL2-H9的构建
根据GenBank公布的鸭源H9亚型禽流感病毒HA基因序列(序列10)，人工合成HA基因，以H9NheI-F和H9BHI-R引物RT-PCR扩增HA基因。将目的片段连接pMD-18T载体，构建重组质粒pT-H9NBH。分别用NheI和BamHI双酶切重组质粒pT-UL2-GFP-gpt和pT-H9NBH，分别回收6.0kb片段和1.6kb片段，并将两片段连接，获得重组转移载体pT-UL2-H9。
2)同源重组
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-UL2-H9与rDEVΔUL2-GFP病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：
六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的rDEVΔUL2-GFP，吸附1～4小时；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μLLipofectamine2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μLLipofectamine2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μLLipofectamine2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d。
3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察无绿色荧光的蚀斑，挑选单个无荧光蚀斑于0.5mlM199营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，获得重组病毒并将该病毒命名为鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)rDEVΔUL2-H9株，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11497。
实施例2
——鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9的鉴定
1.采用ORFC17F、ORFC17R引物(见表1)进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，HA基因成功插入到UL2基因内(见图3)。
2.重组病毒rDEVΔUL2-H9间接免疫荧光鉴定
将重组病毒rDEVΔUL2-H9及其亲本毒分别接种CEF，当细胞病变达80％时，用间接免疫荧光法检测HA基因的表达情况。
间接免疫荧光步骤：弃去细胞培养液，用PBS(pH7.2)轻洗细胞表面1次，然后每孔加入冷甲醇，置室温固定10～15分钟，弃去甲醇，自然晾干；用PBS(pH7.2)洗细胞面1次，然后分别加入适当稀释的鸡抗DEV单特异性抗体、鸡抗H9单特异性抗体(均由本发明人所在实验室制备、保存)，置37℃作用1小时；弃去鸡抗REV单特异性抗体，用含0.05％吐温-20的PBS(pH7.2)洗3次；每孔加入适当稀释的FITC标记的兔抗鸡IgG(购自SIGMA公司)，置37℃作用1小时；用含0.05％吐温-20的PBS(pH7.2)洗3次；在荧光倒置显微镜下观察。鸡抗DEV单特异性抗体染色后，重组病毒rDEVΔUL2-H9及其亲本毒均出现了特异性荧光；鸡抗H9单特异性抗体染色后，重组病毒rDEVΔUL2-H9出现了特异性荧光，而亲本毒无荧光。结果表明，重组病毒在CEF中表达了HA蛋白。
3.重组病毒rDEVΔUL2-H9病毒含量测定
重组病毒rDEVΔUL2-H9接种CEF，细胞病变达70％-80％时收获，冻融1次后用CEF测定病毒含量，为105.2TCID50/0.1ml。
4.重组病毒rDEVΔUL2-H9遗传稳定性试验
重组病毒rDEVΔUL2-H9病毒在CEF细胞上传代20代，取其第5代、第10代、第15代和第20代毒应用PCR、间接免疫荧光检测，结果表明所获得的重组病毒rDEVΔUL2-H9在CEF中稳定遗传、正确表达HA蛋白(见图4)。
5.动物试验
将15只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射rDEVΔUL2-H9，每只1000TCID50，第2组肌肉注射DEV亲本毒，每只1000TCID50，第3组不免疫，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后21天，翅静脉采血后，腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCCAV1221)，每只1000MLD。观察14d，每天记录发病死亡情况。攻毒对照组100％死亡，免疫100％保护(表2)，血清中H9HI抗体效价几何平均值为1:64(表3)，说明rDEVΔUL2-H9具有良好的免疫原性。
实施例3
——疫苗的制备
本发明所提供的制备疫苗的方法，是将重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H9)接种长满单层的无特异性病原鸡的鸡胚成纤维细胞(SPFCEF)，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
1.细胞制备选择发育良好的9～11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培养24小时左右长成单层备用。
2.病毒液的制备按体积比0.01％～0.5％的接毒量将生产种毒重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H9)接种CEF细胞单层，37～38℃培养36～72小时，当病变率达75％以上收获病毒液，-20℃结冻保存。
3.半成品的检验
(1)无菌检验每组分别取样，按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版(三部).中国农业出版社，2011，本发明称《中国兽药典》)的方法进行，应无菌生长。
(2)病毒含量测定每0.1ml病毒含量≥105.0TCID50。
4.配苗及分装将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装。
5.冻干分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)附录437页迅速进行冷冻真空干燥。
实施例4
——疫苗检验
本发明涉及到的相关检验方法按《中国兽药典》)的方法进行。
(1)性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)无菌检验按《中国兽药典》进行检验，均无菌生长。
(3)支原体检验按《中国兽药典》进行检验，均无支原体生长。
(4)外源病毒检验按《中国兽药典》进行检验，均无外源病毒污染。
(5)鉴别检验将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合，置室温作用60min后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔(48孔细胞板)，每孔0.2ml,同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组全部出现病变，中和组未出现细胞病变。
(6)安全检验用21日龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽份，观察14日，均全部健活。
(7)效力检验
1)鸭肠炎病毒部分
病毒含量测定每羽份病毒含量为104.4TCID50。
用鸭检验对照鸭5/5死亡，免疫鸭10/10保护。
2)H9亚型禽流感病毒HA蛋白部分
病毒含量测定每羽份病毒含量为104.4FAID50。
用鸭检验免疫鸭10/10病毒分离为阴性，对照鸭5/5病毒分离为阳性。
(8)剩余水分测定按《兽药典》规定方法进行测定，剩余水分为3.1％、3.0％、2.9％、3.0％，符合规定。
(9)真空度测定按《兽药典》规定方法进行测定，均出现紫色辉光，符合规定。
实施例5
——重组病毒rDEVΔUL2-GFP的应用
根据GenBank公布的鸭H5亚型禽流感病毒HA基因序列，人工合成HA基因(序列9)，通过NheI和BamHI插入到质粒pT-UL2-GFP-gpt中，获得重组转移载体pT-UL2-H5。
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-UL2-H5与rDEVΔUL2-GFP病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。经蚀斑纯化，获得的重组病毒rDEVΔUL2-H5株。
鸭源H5亚型禽流感病毒HA基因序列(序列9)
鸭源H9亚型禽流感病毒HA基因序列(序列10)

Claims (5)

1.一株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该毒株为鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)rDEVΔUL2-H9株，该病毒株已于2015年11月日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11497。
2.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株的UL2基因内插入了H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因。
3.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于该毒株作为疫苗生产毒株用于制备H9亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗，预防H9亚型禽流感和鸭瘟。
4.如权利要求3所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于是将该株病毒接种长满单层的无特定病原鸡的鸡胚成纤维细胞，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成所述H9亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗。
5.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于该株病毒缺失了UL2基因196-723位核苷酸，在此区域插入H5亚型禽流感病毒或/和鸭肝炎病毒或/和鸭黄病毒保护基因并获得稳定、高效表达，制备成鸭肠炎病毒为载体的联合活疫苗。
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