CN105384752A

CN105384752A - 一种新的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法和医药用途

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Publication number: CN105384752A
Application number: CN201510887646.0A
Authority: CN
Inventors: 杨辉
Original assignee: XINING YIGE INTELLECTUAL PROPERTY ADVISORY SERVICES Co Ltd
Current assignee: XINING YIGE INTELLECTUAL PROPERTY ADVISORY SERVICES Co Ltd
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2016-03-09

Abstract

本发明公开了一种新的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法和医药用途，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的克罗烷型二萜类化合物，可以从小豆蔻的干燥成熟果实中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物可直接抑制K562细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和作用时间的延长而增强。同时，该化合物可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的效应随着浓度和时间的增加而增加。化合物(Ⅰ)可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在的手段，可以用来开发成治疗慢性粒细胞白血病的药物。

Description

一种新的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及从小豆蔻的干燥成熟果实中分离得到的一种具有治疗慢性粒细胞白血病作用的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法。

背景技术

植物小豆蔻为多年生草本。根茎粗壮，棕红色。叶两列，叶片狭长披针状，叶鞘具棕黄色柔毛。穗状花序由茎基部抽出。花序显著伸长，花排列稀疏，花冠白色。果实长卵圆形，果皮质韧，不易开裂。种子团分3瓣，每瓣种子5～9枚，种子气味芳香而峻烈。主产越南、斯里兰卡和印度南部的马拉巴(Malabar)海岸。实成熟时收采，除去残留的果柄，晒干。使用部分为姜科植物小豆蔻的干燥果实。

药材小豆蔻为姜科植物小豆蔻Elettariacardamomum(L.)Maton的干燥成熟果实，是藏医与维吾尔医用药，以“加素”之名始载于《四部医典》，现被多国药典收载。小豆蔻是世界著名的植物药与香料，被称为“香料之后”，原产于印度南部、斯里兰卡及瓜地马拉等地，在印度传统医学中使用历史超过两千年，具有祛风、健胃的功效。目前中医很少使用，小豆蔻曾以“豆蔻”之名收载于1953年版中国药典。

小豆蔻已报道的成分主要为挥发油，以及多糖与蛋白质，推测还含有黄酮类化合物，但目前尚未见黄酮类成分单体的分离与鉴定。挥发油是小豆蔻中重要的活性成分，含量高达7％，超声提取得到的挥发油以α-乙酸松油脂、桉油精、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯为主，与超临界CO₂提取所得成分类似；如以正己烷提取，挥发油组分有所不同，为柠檬烯、桉油精、萜品油烯、月桂烯。此外，还含有麝香草醇、橙花基醋酸酯、蒎烯、橙花叔醇、香桧烯等。

小豆蔻药理活性多样，尤以抗肿瘤活性报道最多，涉及皮肤、肺、结肠等多个部位的肿瘤，对胃肠道也有较好的保护作用，此外，还具有抗菌、抗氧化、抗炎、镇痛等作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种从小豆蔻的干燥成熟果实中分离得到的一种具有治疗慢性粒细胞白血病作用的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将小豆蔻的干燥成熟果实粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、40:1、20:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

进一步地，步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。

所述的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。

该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

附图说明

图1为化合物(Ⅰ)结构式；

图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证

试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

制备方法：(a)小豆蔻的干燥成熟果实(10kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(163g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(8个柱体积)、40:1(8个柱体积)、20:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(25g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶ODS-C18分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(244mg)。

结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]⁺为m/z411.1120，结合核磁特征可得分子式为C₂₀H₂₀O₈，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，500MHz)：H-1(2.92，m)，H-1(2.81，m)，H-3(7.01，br，s)，H-6(4.64，br，s)，H-10(1.91，m)，H-11(2.92，dd，J＝13.2，7.8)，H-11(1.89，m)，H-12(5.24，t，J＝8.4)，H-14(6.41，br，s)，H-15(7.28，br，s)，H-16(7.35，br，s)，H-17(1.21，s)，H-19(1.25，s)，H-20(5.41，s)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，125MHz)：34.7(CH₂，1-C)，197.8(C，2-C)，137.6(CH，3-C)，132.2(C，4-C)，38.8(C，5-C)，94.4(CH，6-C)，201.1(C，7-C)，72.2(C，8-C)，58.7(C，9-C)，45.2(CH，10-C)，37.2(CH₂，11-C)，74.1(CH，12-C)，128.3(C，13-C)，109.1(CH，14-C)，143.2(CH，15-C)，139.9(CH，16-C)，24.1(CH₃，17-C)，169.9(C，18-C)，29.4(CH₃，19-C)，103.7(CH，20-C)；碳原子标记参见图1。IR光谱显示该化合物含有羟基和内酯基团(3477cm^-1和1768cm^-1)。NMR谱数据表明该化合物含有一个典型的β-单取代呋喃环[δH6.41(br，s，H-14)，7.28(br，s，H-15)和7.35(br，s，H-16)；δC128.3(C-13)，109.1(C-14)，143.2(C-15)和139.9(C-16)〕，一个酯羰基[δC169.9(C-18)]，两个酮羰基[δC197.8(C-2)，201.1(C-7)]，一个三取代双键[δH7.01(br，s，H-3)；δC137.6(C-3)和132.2(C-4)]，三个含氧次甲基[δC94.4(C-6)，74.1(C-12)和103.7(C-20)]，含氧季碳[δC72.2(C-8)]，以及两个甲基[δH1.21(3H，s，H₃-17)和1.25(3H，s，H₃-19)]。根据它的分子式和NMR数据，该化合物鉴定为高含氧二萜类化合物。HMBC谱中，H₃-19与C-4，C-5，C-6和C-10，以及H₃-17与C-7，C-8和C-9的相关性表明化合物为含有5,8-二甲基双萜化合物。HMBC谱中H-6与C-18，以及H-3与C-18的相关性，表明存在一个γ-内酯环。此外根据HMBC谱中，H-12与C-13，C-14和C-16的相关性，可推断呋喃环位于C-12位上。NOESY谱中，H₃-19与H-6，H-6与H₃-17，H₃-17与H-10，以及H-10与H₃-19的相关性表明这些质子均为α-构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。

实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验

一、材料和仪器

K562细胞由中科院上海生物细胞所提供。化合物(Ⅰ)为自制，HPLC归一化纯度大于98％。RPMI-1640干粉培养基购于Gibco公司。小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究所。青霉素、链霉素购于华北制药厂。Glutamine、MTT、DMSO购于AMRESCO。Annexinv-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。MOPS，Rnasin、琼脂糖、嗅乙锭、溴酚兰华美生物工程公司华美生物工程公司。

CO₂孵箱(美国Thermo公司)，超净工作台(苏州净化设备厂)，磁力搅拌器(上海南汇电讯器材厂)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)，水平式离心机(上海安亭科学仪器厂)，电子分析天平(德国Sartorius公司)，自动酶标仪(德国Humareader公司)，U-3010型紫外分光光度计(日本HITACHI公司)，流式细胞仪(美国BECKMAN公司)，EppendorfCentrifuge5417R离心机(德国Eppendorf公司)。

二、试验方法

1、K562细胞的培养

将新购买的细胞株的培养瓶表面用75％酒精擦拭3遍。将细胞悬液吸入离心管，1000rpm离心10min。弃去上清，滴加含10％NBS的RPMI-1640完全培养基，轻轻吹打制备成细胞悬液。接种于培养瓶中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每天换液传代。

2、实验分组

正常对照组：10％NBS的RPMI-1640；实验组：D1：10％NBS的RPMI-1640+终浓度100mg/L化合物(Ⅰ)；D2：10％NBS的即RPMI-1640+终浓度200mg/L化合物(Ⅰ)；D3：10％NBS的即RPMI-1640+终浓度400mg/L化合物(Ⅰ)；D4：10％NBS的即RPMI-1640+终浓度800mg/L化合物(Ⅰ)。

3、MTT法检测化合物(Ⅰ)对K562细胞增殖的影响

(l)取生长状态良好的细胞，用含10％NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞悬液，以5×10³细胞/孔接种于无菌96孔培养板中。(2)依实验分组，每组加入不同浓度的药物50μL，设无细胞孔为空白对照组，每组设8个复孔，将96孔培养板放入CO₂培养箱中培养；(3)24、48和72h后取出96孔培养板，每孔加入20μLMTT(5mg/mL)，放入CO₂培养箱中孵育4h，即有紫蓝色结晶物生成，在一定细胞数范围内，结晶物的生成量与细胞数成正比。(4)每孔加入酸化的SDS100μL放入CO₂培养箱中过夜。(5)用酶标仪测定OD，比色时以空白孔调零。

4、AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

(1)取生长状态好的细胞，用含10％NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞悬液，并调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于无菌6孔培养板，每孔2mL细胞。(2)依实验分组加入不同浓度药物，2mL/孔，将6孔培养板放入CO₂培养箱中培养。(3)48h和72h后收集各孔细胞于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。(4)用4℃预冷的PBS洗涤细胞两次，(1500rpm，离心5min)，弃上清，用200μLBindingBuffer悬浮细胞，并移入流式管中。(5)每管加入5μLAnnexinv-FITC混合后，加入5μLPI，混匀。(6)室温，避光反应10min，用流式细胞仪检测。

5、统计学处理

实验组和对照组均重复3次操作，结果用(x±s表示，P<0.05示有显著性差异。组间比较采用单因素方差分析。所有数据用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。

三、结果及结论

1、MTT法检测化合物(Ⅰ)对K562细胞的增殖抑制作用

化合物(Ⅰ)作用K562细胞24h、48h、72h后，用酶标仪检测OD₄₉₀显示：作用24h后D1和D2实验组对细胞K562细胞抑制作用不明显(P>0.05，P>0.05)，D3和D4可明显抑制562结果(P<0.05，P<0.01)，作用48h和72h后，不同浓度的化合物(Ⅰ)均可抑制K562细胞增殖，且随剂量和时间的增加抑制细胞增殖的作用增强。结果见表1(*：和对照比P<0.05；**：和对照比P<0.01)。

2、Annexinv-FITC/PI双染流式细胞仪分析结果

磷脂酞丝氨酸(PhosphotidylSerine，PS)外翻是细胞凋亡的早期事件。AnnexinV是一种Ca2⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。先后标记了FITC和PI(PropidiumIodide)的双染细胞，可通过流式细胞仪将活细胞、早期凋亡细胞(双参数散点图右下象限)、晚期凋亡细胞及坏死细胞区分开。结果表明不同浓度的化合物(Ⅰ)作用K562细胞48h和72h均可明显诱导K562细胞早期凋亡，这种效应随化合物(Ⅰ)的浓度增加和作用时间延长而明显增强。结果见表2(*：和对照比P<0.05；**：和对照比P<0.01)。

结论，化合物(Ⅰ)可直接抑制K562细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和作用时间的延长而增强。同时，化合物(Ⅰ)可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的效应随着浓度和时间的增加而增加。研究结果显示，化合物(Ⅰ)可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在的手段。

表1不同浓度的化合物(Ⅰ)作用K562细胞后的MTT值(x±s，N＝8)

表2不同浓度化合物(Ⅰ)作用K562细胞后早期凋亡率(x±s，N＝3)

实施例3

片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例4

口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例5

胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例6

注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例7

无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将小豆蔻的干燥成熟果实粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、40:1、20:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

5.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。

7.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。