CN105377896B - 抑制血管内皮脂肪酶的酶活性的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
提供了对动脉硬化、代谢综合征的治疗有效的选择性抑制血管内皮脂肪酶活性的单克隆抗体或其抗体片段，和包含所述单克隆抗体或其抗体片段作为有效成分的药物组合物。
Description
【技术领域】
本发明涉及抑制血管内皮脂肪酶(Endothelial Lipase，下文有时简称为EL))的活性的单克隆抗体和含有所述抗体的药物组合物。具体地，本发明涉及选择性抑制EL的酶活性的单克隆抗体或其部分、或含有所述抗体或其部分的药物组合物。
【背景技术】
EL是属于甘油三酯脂肪酶(下文称为TG)家族的磷脂酶(非专利文献1)。人EL由500个残基(NCBI登录号NP_006024.1，序列编号：1)的氨基酸组成。人以外的哺乳动物的EL已知例如兔EL(NCBI登录号NP_001182567.1)、食蟹猴EL(NCBI登录号EHH61805.1)、狒狒EL(NCBI登录号XP_003914420.1)、小鼠EL(NCBI登录号NP_034850.3)等。TG家族中包含脂蛋白脂肪酶(下文称为LPL)和肝脂酶(下文称为HL)。
根据EL敲除小鼠和EL转基因小鼠的分析表明，EL通过其强磷脂酶活性与HDL胆固醇(下文称为HDL-c)的代谢相关，且作为限定血中HDL-c量的因子受到关注(非专利文献2)。一直以来已知，冠状动脉疾病(下文称为CAD)与血中HDL-c量呈负相关关系。HDL-c通过抗氧化作用、抗炎症作用、胆固醇逆输送作用等显示抗动脉硬化作用，低HDL-c血症识别为CAD的风险因子之一。因此，EL抑制剂通过增加血中HDL-c成为CAD治疗药，实际上据报道，敲除了EL的病态小鼠中HDL-c升高且动脉硬化病变部位减少(非专利文献3)。
这些发现显示了，EL的选择性抑制剂作为脂质代谢异常和动脉硬化的治疗药的有用性。
选择性抑制EL作为脂质代谢异常和动脉硬化的治疗药是有用的，因此，抑制EL的酶活性的EL的抗体的制备是重要的途径之一。迄今报道了，制备从兔获得的抑制EL酶活性的多克隆抗体，通过向小鼠施用该抗体，升高血中HDL-c浓度(非专利文献4)。
但是，识别EL的多个部位的多克隆抗体对EL的抑制选择性不高。另外，与EL有关的诸如脂质代谢异常和动脉硬化的慢性疾病的治疗药需要长期施用，因此，使用对人抗原性高的兔多克隆抗体作为药品是不可能的。而且，多克隆抗体也难以改善抗原性。
由于这些情况，需要制备选择性抑制EL的酶活性的单克隆抗体。
【现有技术文献】
【非专利文献】
【非专利文献1】
Nature Genetics、1999年、第21卷、424页
【非专利文献2】
TCM、第14卷、第5号、2004年、p.202-206
【非专利文献3】
The Journal of Biological Chemistry Vol.279， No.43， 22， 45085-45092，2004
【非专利文献4】
J Clin Invest、2003年、第111卷第3号、357页。
【发明概述】
【发明要解决的课题】
本发明要解决的课题是，提供选择性抑制EL的酶活性的单克隆抗体或其抗体片段或含有它们的药物组合物。
【解决课题的手段】
本发明人进行努力研究，结果发现选择性抑制EL的酶活性的单克隆抗体，从而完成本发明。
即，本发明涉及：
(1)抑制血管内皮脂肪酶的酶活性的单克隆抗体或其抗体片段，其识别序列编号1所示氨基酸序列的1位至157位中的至少1个氨基酸，
(2)前述(1)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其识别序列编号1所示氨基酸序列的50位至100位中的至少1个氨基酸，
(3)前述(1)或(2)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其识别序列编号1所示氨基酸序列的50位的精氨酸、60位的谷氨酸、61位的组氨酸、65位的酪氨酸、100位的天冬酰胺中的至少1个氨基酸，
(4)前述(1)或(2)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其至少识别序列编号1所示氨基酸序列的65位的酪氨酸，
(5)前述(4)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其识别序列编号1所示氨基酸序列的50位的精氨酸、52位的天冬酰胺、54位的精氨酸、58位的天冬氨酸、60位的谷氨酸、61位的组氨酸、63位的甘氨酸、100位的天冬酰胺中的至少1个氨基酸，
(6)抑制血管内皮脂肪酶的酶活性的单克隆抗体或其抗体片段，其识别序列编号1所示氨基酸序列的202位至305位中的至少1个氨基酸，
(7)前述(6)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其识别序列编号1所示氨基酸序列的220位至273位中的至少1个氨基酸，
(8)前述(6)或(7)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其识别序列编号1所示氨基酸序列的220位的组氨酸、221位的苏氨酸、222位的酪氨酸、223位的苏氨酸、224位的精氨酸、226位的苯丙氨酸、227位的甘氨酸、231位的甘氨酸、232位的异亮氨酸、233位的谷氨酰胺、234位的蛋氨酸、240位的天冬氨酸、242位的酪氨酸、243位的脯氨酸、244位的天冬酰胺、246位的甘氨酸、249位的谷氨酰胺、250位的脯氨酸、251位的甘氨酸、254位的亮氨酸、258位的亮氨酸、263位的酪氨酸、269位的缬氨酸、273位的谷氨酸中的至少1个氨基酸，
(9)前述(6)或(7)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其识别序列编号1所示氨基酸序列的220位的组氨酸、221位的苏氨酸、240位的天冬氨酸、242位的酪氨酸、243位的脯氨酸、244位的天冬酰胺、246位的甘氨酸、249位的谷氨酰胺、250位的脯氨酸、251位的甘氨酸中的至少1个氨基酸，
(10)前述(6)或(7)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其识别序列编号1所示氨基酸序列的220位的组氨酸、221位的苏氨酸、240位的天冬氨酸、242位的酪氨酸、243位的脯氨酸、244位的天冬酰胺、246位的甘氨酸、249位的谷氨酰胺、250位的脯氨酸、251位的甘氨酸中的全部氨基酸，
(11)前述(1)至(10)任一项中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其以10nM以下的IC50抑制血管内皮脂肪酶，
(12)前述(11)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其以5nM以下的IC50抑制血管内皮脂肪酶，
(13)前述(11)中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其以2nM以下的IC50抑制血管内皮脂肪酶，
(14)抗体或其抗体片段，选自：
1)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号10、序列编号11和序列编号12的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号14、序列编号15和序列编号16的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
2)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号10、序列编号11和序列编号12的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号14、序列编号15和序列编号16的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
3)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号10、序列编号11和序列编号12的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，以及
包含具有序列编号14、序列编号15和序列编号16的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
4)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号10、序列编号11和序列编号12的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号14、序列编号15和序列编号16的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
5)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号18、序列编号19和序列编号20的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号22、序列编号23和序列编号24的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
6)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号18、序列编号19和序列编号20的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号22、序列编号23和序列编号24的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
7)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号18、序列编号19和序列编号20的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号22、序列编号23和序列编号24的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
8)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号18、序列编号19和序列编号20的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号22、序列编号23和序列编号24的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
9)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号26、序列编号27和序列编号28的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号30、序列编号31和序列编号32的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
10)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号26、序列编号27和序列编号28的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号30、序列编号31和序列编号32的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
11)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号26、序列编号27和序列编号28的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号30、序列编号31和序列编号32的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
12)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号26、序列编号27和序列编号28的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号30、序列编号31和序列编号32的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
13)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号34、序列编号35和序列编号36的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号38、序列编号39和序列编号40的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
14)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号34、序列编号35和序列编号36的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号38、序列编号39和序列编号40的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
15)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号34、序列编号35和序列编号36的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号38、序列编号39和序列编号40的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
16)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号34、序列编号35和序列编号36的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号38、序列编号39和序列编号40的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
17)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号42、序列编号43和序列编号44的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号46、序列编号47和序列编号48的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
18)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号42、序列编号43和序列编号44的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号46、序列编号47和序列编号48的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
19)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号42、序列编号43和序列编号44的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号46、序列编号47和序列编号48的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
20)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号42、序列编号43和序列编号44的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号46、序列编号47和序列编号48的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
21)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号50、序列编号51和序列编号52的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号54、序列编号55和序列编号56的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
22)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号50、序列编号51和序列编号52的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号54、序列编号55和序列编号56的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
23)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号50、序列编号51和序列编号52的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号54、序列编号55和序列编号56的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
24)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号50、序列编号51和序列编号52的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号54、序列编号55和序列编号56的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
25)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号58、序列编号59和序列编号60的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号62、序列编号63和序列编号64的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
26)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号58、序列编号59和序列编号60的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号62、序列编号63和序列编号64的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
27)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号58、序列编号59和序列编号60的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号62、序列编号63和序列编号64的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
28)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号58、序列编号59和序列编号60的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号62、序列编号63和序列编号64的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
29)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号66、序列编号67和序列编号68的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号70、序列编号71和序列编号72的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
30)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号66、序列编号67和序列编号68的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号70、序列编号71和序列编号72的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
31)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号66、序列编号67和序列编号68的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号70、序列编号71和序列编号72的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
32)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号66、序列编号67和序列编号68的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号70、序列编号71和序列编号72的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
33)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号74、序列编号75和序列编号76的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及、
包含具有序列编号78、序列编号79和序列编号80的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
34)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号74、序列编号75和序列编号76的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号78、序列编号79和序列编号80的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
35)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号74、序列编号75和序列编号76的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
具有序列编号78、序列编号79和序列编号80的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
36)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号74、序列编号75和序列编号76的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号78、序列编号79和序列编号80的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
37)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号82、序列编号83和序列编号84的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号86、序列编号87和序列编号88的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
38)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号82、序列编号83和序列编号84的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号86、序列编号87和序列编号88的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
39)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号82、序列编号83和序列编号84的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号86、序列编号87和序列编号88的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
40)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号82、序列编号83和序列编号84的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号86、序列编号87和序列编号88的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
41)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号90、序列编号91和序列编号92的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号94、序列编号95和序列编号96的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
42)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号90、序列编号91和序列编号92的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号94、序列编号95和序列编号96的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
43)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号90、序列编号91和序列编号92的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号94、序列编号95和序列编号96的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
44)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号90、序列编号91和序列编号92的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号94、序列编号95和序列编号96的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
45)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号100、序列编号101和序列编号102的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含具有序列编号104、序列编号105和序列编号106的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，
46)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含具有序列编号100、序列编号101和序列编号102的氨基酸序列的3个CDR的重链可变区、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号104、序列编号105和序列编号106的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
47)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号100、序列编号101和序列编号102的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含具有序列编号104、序列编号105和序列编号106的氨基酸序列的3个CDR的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，以及
48)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
包含3个CDR的重链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号100、序列编号101和序列编号102的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列、以及
包含3个CDR的轻链可变区，所述3个CDR由下列氨基酸序列组成：在具有序列编号104、序列编号105和序列编号106的氨基酸序列的3个CDR中的1个以上CDR中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸序列，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性。
(15)抗体或其抗体片段，选自：
1)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号9的氨基酸序列的重链可变区、和
具有序列编号13的氨基酸序列的轻链可变区，
2)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号9的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号13的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
3)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号9的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号13的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
4)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号9的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号13的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
5)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号17的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号21的氨基酸序列的轻链可变区，
6)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号17的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号21的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
7)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号17的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号21的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
8)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号17的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号21的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
9)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号25的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号29的氨基酸序列的轻链可变区，
10)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号25的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号29的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
11)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号25的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号29的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
12)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号25的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号29的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
13)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号33的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号37的氨基酸序列的轻链可变区，
14)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号33的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号37的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
15)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号33的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号37的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
16)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号33的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号37的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
17)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号41的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号45的氨基酸序列的轻链可变区，
18)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号41的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号45的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
19)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号41的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号45的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
20)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号41的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号45的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
21)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号49的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号53的氨基酸序列的轻链可变区，
22)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号49的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号53的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
23)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号49的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号53的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
24)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号49的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号53的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
25)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号57的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号61的氨基酸序列的轻链可变区，
26)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号57的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号61的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
27)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号57的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号61的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
28)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号57的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号61的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
29)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号65的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号69的氨基酸序列的轻链可变区，
30)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号65的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号69的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
31)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号65的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号69的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
32)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号65的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号69的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
33)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号73的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号77的氨基酸序列的轻链可变区，
34)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号73的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号77的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
35)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号73的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号77的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
36)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号73的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号77的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
37)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号81的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号85的氨基酸序列的轻链可变区，
38)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号81的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号85的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
39)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号81的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号85的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
40)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号81的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号85的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
41)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号89的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号93的氨基酸序列的轻链可变区，
42)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号89的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号93的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
43)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号89的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号93的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
44)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号89的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号93的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
45)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号99的氨基酸序列的重链可变区、和、
具有序列编号103的氨基酸序列的轻链可变区，
46)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有序列编号99的氨基酸序列的重链可变区、和
具有在序列编号103的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
47)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号99的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有序列编号103的氨基酸序列的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，以及
48)单克隆抗体或其抗体片段，其具有：
具有在序列编号99的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的重链可变区、和
具有在序列编号103的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、置换或添加而成的氨基酸的轻链可变区，和
其抑制血管内皮脂肪酶的酶活性，
(16)用于血管内皮脂肪酶相关疾病的治疗或预防的药物组合物，其含有前述(1)至(15)中任一项中记载的单克隆抗体或其抗体片段，
(17)(16)记载的药物组合物，其中血管内皮脂肪酶相关疾病是脂质代谢异常，
(18)前述(1)～(15)中任一项中记载的单克隆抗体或其抗体片段，其用于血管内皮脂肪酶相关疾病的治疗或预防，
(19)(18)记载的单克隆抗体或其抗体片段，其中血管内皮脂肪酶相关疾病是脂质代谢异常，
(20)血管内皮脂肪酶相关疾病的预防或治疗方法，其特征在于施用前述(1)～(15)中任一项中记载的单克隆抗体或其抗体片段，
(21)(20)记载的方法，其中血管内皮脂肪酶相关疾病是脂质代谢异常。
【发明效果】
本发明的单克隆抗体具有选择性抑制EL的酶活性的活性，因此，含有本发明的单克隆抗体的药物组合物作为药品、尤其是用于脂质代谢异常、高脂血症、动脉硬化、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、糖尿病、肥胖和/或X综合征的治疗和/或预防的药物是非常有用的。
【附图说明】
【图1A】图1A显示测定55A1抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1B】图1B显示测定7D4抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1C】图1C显示测定14A1抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1D】图1D显示测定2D5抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1E】图1E显示测定53A11抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1F】图1F显示测定13B3抗体对于食蟹猴、狒狒、兔、人(1-157)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1G】图1G显示测定23H8抗体对于食蟹猴、狒狒、兔和人(1-157)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1H】图1H显示测定16B3抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL和人(1-305)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1I】图1I显示测定16E7抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL和人(1-305)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1J】图1J显示测定14E1抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL和人(1-305)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图1K】图1K显示测定19E7抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL和人(1-305)小鼠嵌合体EL的酶活性抑制能力的结果。
【图2A】图2A显示测定55A1抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2B】图2B显示测定7D4抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2C】图2C显示测定14A1抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2D】图2D显示测定2D5抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2E】图2E显示测定53A11抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2F】图2F显示测定13B3抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2G】图2G显示测定23H8抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2H】图2H显示测定16B3抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2I】图2I显示测定16E7抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2J】图2J显示测定14E1抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2K】图2K显示测定19E7抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图2L】图2L显示测定16F6抗体对于人HL和人LPL的酶活性抑制能力的结果。
【图3A】图3A显示测定55A1抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3B】图3B显示测定7D4抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3C】图3C显示测定14A1抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3D】图3D显示测定2D5抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3E】图3E显示测定53A11抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3F】图3F显示测定13B3抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3G】图3G显示测定23H8抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3H】图3H显示测定16B3抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL和人(202-500)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3I】图3I显示测定16E7抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL和人(202-500)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3J】图3J显示测定14E1抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL和人(202-500)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3K】图3K显示测定19E7抗体对于食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL和人(202-500)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图3L】图3L显示测定16F6抗体对于狒狒EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL和人(187-500)小鼠嵌合体EL的结合性的结果。
【图4A】图4A显示55A1抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4B】图4B显示7D4抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4C】图4C显示14A1抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4D】图4D显示2D5抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4E】图4E显示53A11抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4F】图4F显示13B3抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4G】图4G显示23H8抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4H】图4H显示16B3抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4I】图4I显示16E7抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4J】图4J显示14E1抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4K】图4K显示19E7抗体的可变区的氨基酸序列。
【图4L】图4L显示16F6抗体的可变区的氨基酸序列。
【图5A】图5A显示55A1抗体、7D4抗体、14A1抗体和2D5抗体的重链可变区的氨基酸序列的比对。
【图5B】图5B显示55A1抗体、7D4抗体、14A1抗体和2D5抗体的轻链可变区的氨基酸序列的比对。
【图5C】图5C显示53A11抗体、13B3抗体和23H8抗体的重链可变区的氨基酸序列的比对。
【图5D】图5D显示53A11抗体、13B3抗体和23H8抗体的轻链可变区的氨基酸序列的比对。
【图6A】图6A显示16B3抗体和16E7抗体的重链可变区的氨基酸序列的比对。
【图6B】图6B显示16B3抗体和16E7抗体的轻链可变区的氨基酸序列的比对。
【图6C】图6C显示14E1抗体和19E1抗体的重链可变区的氨基酸序列的比对。
【图6D】图6D显示14E1抗体和19E1抗体的重链可变区的氨基酸序列的比对。
【图7A】图7A显示55A1抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7B】图7B显示7D4抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7C】图7C显示14A1抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7D】图7D显示2D5抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7E】图7E显示53A11抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7F】图7F显示13B3抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7G】图7G显示23H8抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7H】图7H显示16B3抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7I】图7I显示16E7抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7J】图7J显示14E1抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【图7K】图7K显示19E7抗体对于导入了突变的狒狒EL的结合性。
【实施发明的方式】
本发明提供以选择性抑制血管内皮脂肪酶的酶活性为特征的单克隆抗体。本发明的抗体具有选择性抑制血管内皮脂肪酶的酶活性的活性，因此作为动脉硬化、代谢综合征的预防、治疗药是有用的。
作为为了配制本发明的单克隆抗体而使用的抗原，具有包含序列编号1的1位至157位或202位至305位的氨基酸序列的连续氨基酸残基是重要的。其长度没有特别限定，但期望为具有免疫原性的6个残基以上长度。作为这种抗原的具体例子，可使用天然地或人工地高表达的细胞株、其膜级分、或其纯化物、与其它蛋白质或肽(例如，FLAG-标签、HIS-标签、GST-标签、C2标签等标签蛋白质，GFP、EGFP等荧光蛋白质等)的融合蛋白质、或化学地合成的肽等任何抗原(下文有时也将它们仅称为本发明的抗原)。另外，这些免疫原的配制方法都是本领域技术人员公知的。
本发明的单克隆抗体可以通过已知的一般制备方法配制。具体地，将本发明的抗原按照需要与弗氏佐剂共同通过哺乳动物，优选地小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或兔的皮下、肌肉内、静脉内、足垫内或腹腔内1至数次注射而实施免疫敏化。通常，从初次免疫起每约1～21日进行1～4次免疫，在从最终免疫起约1～10日后可从免疫敏化的哺乳动物取得抗体产生细胞。实施免疫的次数和时间间隔可根据使用的免疫原的性质等适当改变。
分泌单克隆抗体的杂交瘤的配制可按照Kohler and Milstein等的方法(Nature、1975、vol.256、p495～497)及基于其的方法进行。也即，通过使从如前述免疫敏化的哺乳动物取得的脾脏、淋巴结、骨髄或扁桃等、优选地脾脏中包含的抗体产生细胞，与优选地来自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人等哺乳动物、更优选地小鼠、大鼠或人的缺乏自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞进行细胞融合，可以配制杂交瘤。
细胞融合中应用的骨髓瘤细胞可使用一般从小鼠得到的株化细胞，例如P3-U1、NS-1、SP-2、653、X63、AP-1等。
产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选如下进行，将杂交瘤在例如微量滴定板中培养，通过RIA、ELISA、FACS等测定法测定观察到增殖的孔的培养上清对前述小鼠免疫敏化中应用的本发明的抗原的反应性，选择产生对该抗原或半抗原显示特异性结合的单克隆抗体的克隆。接着，通常应用将抗原固定化，将与其结合的培养上清中的抗体以用放射性物质、荧光物质、酶等标记的二次抗体检测的方法。另外，在应用表达抗原的细胞时，在该细胞中添加杂交瘤培养上清，随后与荧光标记的二次抗体反应，之后通过应用流式细胞仪等荧光检测装置测定该细胞的荧光强度，能够检测可与该细胞膜上的本发明的抗原结合的单克隆抗体。
从选择的杂交瘤制备单克隆抗体可如下进行，在体外培养杂交瘤，或在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等、优选地小鼠或大鼠、更优选地小鼠的腹水中等培养杂交瘤，并从得到的培养上清、或哺乳动物的腹水分离。在体外培养的情况下，取决于培养的细胞种类的特性、试验研究的目的和培养方法等各种条件，可应用已知营养培养基或从已知基本培养基诱导配制的所有营养培养基实施，其用于增殖、维持和保存杂交瘤，并在培养上清中产生单克隆抗体。
作为基本培养基，可列举例如，Ham’F12培养基、MCDB153培养基或低钙MEM培养基等低钙培养基，和MCDB104培养基、MEM培养基、D-MEM培养基、RPMI1640培养基、ASF104培养基或RD培养基等高钙培养基等，该基本培养基根据目的可包含例如血清、激素、细胞因子和/或各种无机或有机物质等。
单克隆抗体的分离、纯化可通过使上述培养上清或腹水进行饱和硫酸铵、离子交换层析(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱等亲和柱层析而进行。
另外，作为本发明的单克隆抗体，可应用将抗体基因从抗体产生细胞、例如杂交瘤中克隆，掺入适当载体中，将载体导入宿主中，利用基因重组技术产生的重组型抗体(例如，Carl等人，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES、1990年发行)。
具体地，从产生目的抗体的杂交瘤或产生抗体的免疫细胞、例如从通过癌基因等使敏化淋巴细胞等永生化而得到的细胞，分离编码抗体的可变区(V区)的mRNA。对于mRNA的分离，通过公知的方法、例如胍超速离心法(Chirgwin、J.M.等人、Biochemistry(1979) 18、5294-5299)等配制总RNA，使用mRNA Purification Kit(Pharmacia)等配制mRNA。
应用逆转录酶从得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可应用AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等进行。另外，在进行cDNA的合成和扩增中，可使用5’-Ampli FINDER RACEKit (Clonetech)和利用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等人、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988年、第85卷、 8998页等)。从得到的PCR产物纯化目的DNA片段，将其与载体DNA连接。进一步地，如此制备重组载体，导入大肠杆菌等中，选择克隆并配制期望的重组载体。目的DNA的碱基序列通过公知方法、例如脱氧法确认。
如果获得编码目的抗体的V区的DNA，将其与编码期望的抗体恒定区(C区)的DNA连接，并掺入表达载体。或者，也可以将编码抗体V区的DNA掺入含有抗体C区的DNA的表达载体。在制备本发明中使用的抗体中，将抗体基因掺入在表达控制区、例如增强子/启动子的控制下表达的表达载体中。随后，可用该表达载体转化宿主细胞并表达抗体。
抗体基因的表达可使抗体的重链(H链)或轻链(L链)分别掺入表达载体中而共转化宿主，或者也可使编码H链和L链的DNA掺入单一的表达载体中而转化宿主(参考WO94/11523)。
上述以外的本发明的单克隆抗体的制备方法也可应用所谓的噬菌体展示技术(Nature Biotechnology 23，1105(2005))。具体地，将以例如人、动物(例如兔、小鼠、大鼠、仓鼠等)的B淋巴细胞为材料、通过公知的方法制备的抗体基因文库，或从人、动物的种系序列选择和改变的完全合成的抗体基因文库，在噬菌体、大肠杆菌、酵母、动物细胞等的细胞表面和脂质体上等呈递。此时，在细胞表面呈递的抗体的形式可列举，IgG分子、IgM分子、Fab片段、单链Fv(scFv)片段等。
通过将如此得到的单克隆抗体片段基因以公知方法与IgG抗体基因的对应区重排，可得到抗体基因。然后，将如此得到的基因掺入适当载体中，将载体导入宿主，可利用基因重组技术产生抗体(例如，Carl等人、THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES、1990年发行)。
本发明的单克隆抗体的特征是，抑制血管内皮脂肪酶的酶活性。下文记载EL的酶活性抑制能力的测定顺序的一个例子。
将克隆了编码EL的DNA的pcDNA3.1(Invitrogen公司)转染到FreeStyle HEK293F细胞中，在37℃、8% CO2下培养2天。离心培养液，回收细胞，将其在含有20U/mL肝素的PBS中悬浮，在37℃温育45分钟，之后，将通过离心除去细胞得到的上清作为EL酶溶液，在抑制活性测定中使用。在由20mM tris盐酸缓冲液(pH7.5)、0.5％牛血清白蛋白、4mM 氯化钙、150mM 氯化钠、2mg/mL人HDL(Athens Research & Technology公司)构成的反应溶液中添加单克隆抗体，之后添加EL酶溶液。在37℃反应2小时后，利用NEFA C-test Wako(和光纯药业公司)测定通过EL酶从HDL生成的游离脂肪酸(NEFA)，其NEFA量作为酶活性指标。不添加抗体时的酶活性作为对照值，算出在抗体各浓度与对照值相比的比活性，可从该抑制曲线求出抗体的50％抑制浓度(IC50值)。
EL酶的抑制活性的抑制率显示50％的抗体的有效浓度(IC50)通常用作显示EL抑制活性的指标之一。
本发明中，以10nM以下的IC抑制血管内皮脂肪酶的单克隆抗体或其抗体片段意味着，以前述[0027]至[0029]的方法测定的IC50为10nM以下的单克隆抗体或其片段。测定中使用的EL为哺乳动物来源的EL即可，不论种类，如果应用任一种类EL时是10nM以下，则属于以10nM以下的IC抑制血管内皮脂肪酶的单克隆抗体或其抗体片段。
另外，本发明的单克隆抗体的特征是选择性抑制EL酶。下文示出选择性抑制EL酶、换言之不抑制LPL和HL的酶活性的确认过程的一个例子。
将克隆了编码EL的DNA的pcDNA3.1(Invitrogen公司)转染到FreeStale HEK293F细胞中，在37℃、8%CO2下培养2天。离心培养液，回收细胞，将其在含有20U/mL肝素的PBS中悬浮，在37℃温育45分钟，之后将通过离心除去细胞得到的上清作为EL酶溶液。通过同样的操作，配制LPL酶溶液。在由20mM tris盐酸缓冲液(pH7.5)、0.5％牛血清白蛋白、4mM氯化钙、150mM氯化钠、0.5mg/mL人VLDL(INTRACEL公司)构成的反应溶液中添加单克隆抗体后，添加HL或LPL酶溶液。在37℃反应2小时后，用NEFA C-test Wako(和光纯药业公司)测定通过HL或LPL酶从VLDL生成的游离脂肪酸(NEFA)，其NEFA量作为酶活性指标，不添加单克隆抗体时的酶活性作为对照值，算出相对于对照值的比活性。
对EL酶具有选择性抑制活性意味着，加入相当于对EL为IC50的量的单克隆抗体时，LPL和HL的酶活性抑制不超过3%的情况。本发明的单克隆抗体的特征是不抑制LPL和HL的酶活性、选择性抑制EL酶，因此，表位部位优选EL与LPL、HL没有同源性的区域。
本发明的单克隆抗体包含，以降低对人的异源抗原性等为目的人为改变的基因重组型单克隆抗体，例如嵌合体单克隆抗体、人源化单克隆抗体、人单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体也可为与聚乙二醇(PEG)、放射性物质、毒素等各种分子结合的偶联抗体。这样的偶联抗体可以通过对得到的抗体进行化学修饰而获得。另外，抗体的修饰方法是本领域已确立的。本发明中的单克隆抗体也包含这些偶联抗体。
另外，本发明的单克隆抗体也可以在其N末端或C末端与其它蛋白质融合(Clinical Cancer Research，2004，10，1274-1281)。融合的蛋白质是本领域技术人员能够适当选择的。
本发明中“单克隆抗体片段”意味着，前述本发明的单克隆抗体的一部分，与该单克隆抗体同样地具有与血管内皮脂肪酶特异性的结合性的片段，或与该单克隆抗体同样地具有与血管内皮脂肪酶特异性的结合性、并且具有抑制血管内皮脂肪酶的酶活性作用的片段。具有对血管内皮脂肪酶特异的结合性的片段可列举，具体地，Fab、F(ab')2、Fab'、单链抗体 (scFv)、二硫键抗体(dsFv)、2聚体V区片段(双抗体)、含有CDR的肽等(Expertopinion on therapeutic patents, vol. 6, No. 5, p. 441-456, 1996)。
本发明的单克隆抗体或其抗体片段作为药物组合物是有用的。因此，包含本发明的单克隆抗体和其抗体片段的药物组合物可经口或非经口地全身或局部施用。非经口施用可选择，例如，点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内施用、吸入等。
另外，本发明的单克隆抗体或其抗体片段具有对血管内皮脂肪酶特异的结合性，因此也可应用于脂质代谢异常、高脂血症、动脉硬化、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、糖尿病、肥胖和/或X综合征的诊断。
本发明的单克隆抗体或其抗体片段的特征是，识别序列编号1所示氨基酸序列的1位至157位中的至少1个氨基酸、或识别序列编号1所示氨基酸序列的202位至305位中的至少1个氨基酸中的任一项。识别序列编号1所示氨基酸序列的1位至157位中的至少1个氨基酸意味着，至少识别该区内的任一个氨基酸。
假定本发明的药物组合物的对象患者是动脉硬化和代谢综合征。有效施用量选自每次每1kg体重0.01mg至100mg的范围。或者，可以选择每位患者5～5000mg、优选地10～500mg的施用量。但是，含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段的药物组合物不限于这些施用量。另外，施用时期可根据患者的年龄、症状适当选择。本发明的药物组合物取决于施用途径也可共同包含药学上可接受的载体、添加剂。这种载体和添加剂的例子可列举，水、药学上可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠、水溶性葡聚糖、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、酪蛋白、二甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、作为药物添加剂可接受的表面活性剂等。使用的添加剂按照剂型从上述之中适当或组合选择，但不限于这些。
以下，示出实施例对本发明进行具体地说明，但本发明不限于下述实施例。另外，如果没有特别指出，抗体制备方法应用Immunochemistry in Practice (BlackwellScientific Publiations)中记载的方法。另外，如果没有特别指出，基因操作方法应用Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition(Cold Spring HarborLaboratory)记载的方法。
【实施例1】
表达狒狒EL的腺病毒的配制
通过利用PCR法、限制酶的手法，在pShuttle载体(Clontech公司)中克隆添加了C2标签的狒狒ELcDNA序列。将该亚克隆载体与具有腺病毒骨架基因的载体通过PI-SceI和I-CeuI酶消化(Adeno-x Accessory Kit, Clontech公司)。消化片段的连接反应在16℃进行3小时(ligation high, 东洋纺公司)，将连接产物转化到大肠杆菌菌株(OneShot stbl3Chemically Competent, Invitrogen公司)中。氨苄青霉素选择后，从得到的克隆纯化质粒(QIAprep spin Miniprep Kit, QIAGEN公司)，随后通过PacI酶(New England Biolabs公司)处理切掉大肠杆菌生长区。通过以上，得到用于制备腺病毒载体的质粒DNA。将得到的质粒DNA利用Lipofectamine2000(Invitrogen公司)转染到HEK293细胞(得自ATCC)中，在含有10％牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2下培养。转染后每5日更换培养基，继续培养直至确认到细胞变性效果(CPE)。CPE确认后，回收培养上清和细胞。回收的细胞应用干冰甲醇浴和温水浴反复进行5次左右冻融，之后在3000rpm离心15分钟，将得到的上清作为细胞提取液回收。混合该细胞提取液和培养上清，作为病毒载体含有液。通过将该病毒载体含有液添加到HEK293细胞中、重复同样的操作，进行病毒载体的扩增。扩增后，将最终得到的细胞提取液用Benzonase(Merck-Novagen公司)在37℃、30分钟处理后离心，得到的上清通过以下的密度梯度离心用于病毒载体纯化。在离心管内覆盖含有1.5、1.35、1.25g/cm3氯化铯的PBS(磷酸缓冲盐水)，随后覆盖上述上清。将其在35000rpm、16℃离心1小时，通过目测回收得到的病毒载体。回收的病毒载体针对含10％甘油的PBS透析，作为纯化腺病毒载体。病毒载体一部分用于滴度测定(Adeno-X rapid titer kit, Clontech公司)和自身增殖能力获得型出现判定，仅仅无异常的那些用于以下的免疫。附加了C2标签的狒狒EL的氨基酸序列在序列编号2中记载。
【实施例2】
EL肝素提取液的配制
将克隆了编码附加C2标签的狒狒EL的DNA的pcDNA3.1(Invitrogen公司)转染到FreeStyle HEK293F细胞中，在37℃、8% CO2下培养3日。离心培养液，回收细胞，在含有20U/mL肝素的PBS中悬浮，在37℃温育45分钟。随后，将通过离心除去细胞得到的上清作为狒狒EL肝素提取液。
利用同样的方法，配制附加C2标签的食蟹猴EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL、人(1-53)小鼠嵌合体EL、人(61-111)小鼠嵌合体EL、兔EL、小鼠EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL和人(202-500)小鼠嵌合体EL的肝素提取液。
附加C2标签的食蟹猴EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL、人(1-53)小鼠嵌合体EL、人(61-111)小鼠嵌合体EL、兔EL、小鼠EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL和人(202-500)小鼠嵌合体EL的氨基酸序列分别在序列编号2、3、4、5、6、7、96、97中记载。
【实施例3】
表达狒狒EL的腺病毒载体免疫
将相当于2×109i.f.u.纯化的表达狒狒EL的腺病毒载体施用于6周龄的雌性小鼠(A/J Jms Slc种、得自日本SLC)的静脉内、皮下、或后肢肌肉内。施用后，每7日从尾静脉采取血液，应用如此配制的血清测定抗体滴度。另外，除初次腺病毒载体施用之外，作为追加免疫将等量的腺病毒载体施用于静脉内、皮下、或后肢肌肉内。对显示抗体滴度升高的小鼠实施从尾静脉的加强免疫作为最终免疫。
【实施例4】
产生抗体的杂交瘤的制备
最终免疫3日后，对显示对狒狒EL的抗体滴度升高的个体进行开腹，摘出脾脏，回收脾脏细胞。将脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞(p3×63-Ag8.U1，东京肿瘤研究所)利用50％聚乙二醇4000融合，用含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基选择。
【实施例5】
产生与狒狒EL结合的抗体的杂交瘤的筛选
细胞融合10日后，筛选产生特异抗体的细胞。筛选中应用的ELSIA如下。在384孔微量滴定板(Nunc公司)的各孔中加入35μl含有0.35μg的抗小鼠IgG-Fc抗体(Jackson ImmunoResearch公司)的tris缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.5)，在4℃固定16小时。这些孔用90μl的洗涤液(含有0.01％ Tween20的生理盐水)洗涤1次后，加入Block-Ace(大日本制药公司)100μl，在室温放置2小时，进行封闭(抗小鼠IgG-Fc抗体固相化平板)。各孔用90μl的洗涤液洗涤1次后，加入15μl的杂交瘤培养上清，放置2小时。这些孔用90μl的洗涤液洗涤3次后，加入15μl的含有狒狒EL肝素提取液的分析缓冲液(含有4％Block-Ace、0.05％ Tween20、150mM NaCl的50mM tris缓冲液，pH7.4)，在4℃放置16小时。这些孔用90μl的洗涤液洗涤3次后，加入15μl的含有生物素标记抗C2标签抗体(Fab)和HRP标记链霉抗生物素(Thermoscientific公司)的分析缓冲液，在室温放置1小时。这些孔用90μl的洗涤液洗涤3次后，添加15μl的TMB＋-Substrate-Chromogen(DAKO公司)，在室温显色30分钟后，添加15μl的0.05M的硫酸停止反应，测定450nm的吸光度。
筛选的结果是，得到11个与狒狒EL结合的杂交瘤的克隆(55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3、23H8、16B3、16E7、14E1和19E7)。55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3、23H8、16B3、16E7、14E1和19E7的克隆产生的抗体分别命名为55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3、23H8、16B3、16E7、14E1和19E7抗体。应用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Isotyping Kit, BDBioscience)确定抗体的亚类。
抗体的亚类为，55A1抗体是IgG2a、7D4抗体是IgG1、14A1抗体是IgG1、2D5抗体是IgG2a、53A11抗体是IgG2a、13B3抗体是IgG2a、23H8抗体是IgG2a、16B3抗体是IgG2a、16E7抗体是IgG1、14E1抗体是IgG1、19E7抗体是IgG2a。
【实施例6】
各EL抗体的EL酶活性抑制能力的测定
对55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3、23H8、16B3、16E7、14E1和19E7各抗体，测定对实施例2配制的狒狒EL、食蟹猴EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL、人(1-53)小鼠嵌合体EL、人(61-111)小鼠嵌合体EL、兔EL、小鼠EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL或人(202-500)小鼠嵌合体EL的EL活性抑制能力。具体方法在下文示出。
在由20mM tris盐酸缓冲液(pH7.5)、0.5％牛血清白蛋白、4mM 氯化钙、150mM 氯化钠、2mg/mL人HDL(Athens Research & Technology公司)构成的反应溶液中添加EL抗体后，添加EL酶溶液(总量10μl)。在37℃反应90分钟后，用NEFA C-test Wako(和光纯药业公司)测定通过EL酶从HDL生成的游离脂肪酸(NEFA)，其NEFA量作为酶活性指标。不添加EL抗体时的酶活性作为对照值，算出抗体的各浓度下相对于对照值的比活性并绘图(图1A～图1K)。根据图1A～图1K的抑制曲线求出各抗体的50％抑制浓度(IC50值)。
【实施例7】
各EL抗体的HL和LPL酶活性抑制能力的测定
将克隆了编码人HL的DNA的pcDNA3.1(Invitrogen公司)转染到FreeStyleHEK293F细胞中，在37℃、8%CO2下培养2日。离心培养液，回收细胞，在含有20U/mL的肝素的PBS中悬浮，在37℃温育45分钟。之后，将通过离心除去细胞得到的上清作为人HL酶溶液。通过同样的操作，配制人LPL酶溶液。在由20mM tris盐酸缓冲液(pH7.5)、0.5％牛血清白蛋白、4mM 氯化钙、150mM 氯化钠、0.5mg/mL人VLDL(INTRACEL公司)构成的反应溶液中添加EL抗体溶液后，添加人HL、或人LPL酶溶液(总量10μl)。在37℃反应2小时后，用NEFA C-testWako(和光纯药业公司)测定通过HL或LPL酶从VLDL生成的游离脂肪酸(NEFA)，其NEFA量作为酶活性指标。不添加EL抗体时的酶活性作为对照值，算出相对于对照值的比活性。为了比较，将结果与食蟹猴EL的抑制曲线并列记载(图2A～图2K)。
其结果得知，55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3、23H8、16B3、16E7、14E1和19E7抗体都不抑制HL与LPL的酶活性。
【实施例8】
各EL抗体与EL的结合能力测定
在抗小鼠IgG-Fc抗体固相化平板中加入15μl的含有EL抗体(从1μg/mL连续稀释3倍)的分析缓冲液放置2小时。这些孔用90μl的洗涤液洗涤3次后，加入15μl的含有食蟹猴EL、狒狒EL、兔EL、小鼠EL、人(1-157)小鼠嵌合体EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL或人(202-500)小鼠嵌合体EL肝素提取液的分析缓冲液，在4℃放置16小时。这些孔用90μl的洗涤液洗涤3次后，加入15μl的含有生物素标记抗C2标签抗体(Fab)和HRP标记链霉抗生物素的分析缓冲液，在室温放置1小时。这些孔用90μl的洗涤液洗涤3次后，添加15μl的TMB＋-Substrate-Chromogen(DAKO公司)在室温显色30分钟后，添加15μl的0.05M的硫酸停止反应，测定450nm的吸光度。测定结果在图3A～图3K中显示。
显示55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3和23H8抗体与食蟹猴、狒狒、人(1-157)小鼠嵌合体EL结合，但不与小鼠EL结合。另外，显示13B3和23H8抗体与兔EL结合，但55A1、7D4、14A1、2D5和53A11抗体与兔EL不结合(图3A～图3G)。
另一方面，显示16B3、16E7、14E1和19E7抗体与食蟹猴EL、狒狒EL、人(1-305)小鼠嵌合体EL和人(202-500)小鼠嵌合体EL结合，但不与小鼠EL和人(1-157)小鼠嵌合体EL结合。另外，显示16B3、14E1和19E7抗体与兔EL结合，但16E7抗体与兔EL不结合(图3H～图3K)。
【实施例9】
各EL抗体的结合亲和性测定
各EL抗体的结合亲和性用Biacore测定。将抗C2标签抗体在传感器芯片CM5(GEHealthCare公司)上通过胺偶联法固定化，添加用HBS-P(GE HealthCare公司)稀释的狒狒EL肝素提取液、食蟹猴EL、或人(1-305)小鼠嵌合体EL肝素提取液，在传感器芯片上捕获EL。其后，添加用HBS-P稀释的EL抗体，用BIA评价软件通过二价拟合(Bivalent fitting)算出结合亲和性。各抗体对狒狒EL的结合亲和性在表1中示出，对食蟹猴EL的结合亲和性在表2中示出，对人(1-305)小鼠嵌合体EL的结合亲和性在表3中示出。
实施例6～9中判明的各EL抗体的特征总结于下述表4。
【实施例10】
与人EL和小鼠EL结合的抗体的制备
以与实施例1同样的方法配制表达小鼠EL的腺病毒，以与实施例3同样的方法免疫EL敲除小鼠。以与实施例4和5同样的方法获得与人和小鼠EL结合的抗体(16F6)。应用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Isotyping Kit，BD Bioscience)，确定抗体的亚类，16F6的亚类是IgG1。测定16F6的中和活性和结合亲和性，其结果示于表5和6。
【实施例11】
利用狒狒EL的突变体的促成EL抗体的结合的部位的作图
为了确定对EL抗体的结合重要的EL的氨基酸残基，向狒狒EL的氨基酸残基加入突变，利用ELISA研究EL抗体的结合。具体地，应用Quikchange Site-Directed MutagenesisKit(Agilent Technologies公司)向狒狒EL的cDNA加入突变，置换为丙氨酸。但是，在狒狒EL与小鼠EL的氨基酸残基不同的情况下，置换为小鼠EL的氨基酸残基。应用表达导入了突变的狒狒EL的质粒DNA，以与实施例2同样的方法配制肝素提取液，以与实施例8同样的ELISA法研究与抗体的结合。为了评价狒狒EL的氨基酸残基的相对贡献率，算出相对结合活性([A450为1.0的抗体浓度_突变型EL]/[A450为1.0的抗体浓度_野生型EL])。导入了突变的狒狒EL对55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3和23H8抗体的相对结合活性示于图7A-G。另外，导入了突变的狒狒EL对16B3、16E7、14E1和19E7的相对结合活性示于图7H-K。
比较图7A-G的结果表明，对于55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3和23H8抗体与EL的结合重要的氨基酸是序列编号1所示氨基酸序列的50位的精氨酸、60位的谷氨酸、61位的组氨酸、65位的酪氨酸、100位的天冬酰胺。
比较图7H-K的结果表明，对于16B3、16E7、14E1和19E7抗体与EL的结合重要的氨基酸是序列编号1所示氨基酸序列的220位的组氨酸、221位的苏氨酸、222位的酪氨酸、223位的苏氨酸、224位的精氨酸、226位的苯丙氨酸、227位的甘氨酸、231位的甘氨酸、232位的异亮氨酸、233位的谷氨酰胺、234位的蛋氨酸、240位的天冬氨酸、242位的酪氨酸、243位的脯氨酸、244位的天冬酰胺、246位的甘氨酸、249位的谷氨酰胺、250位的脯氨酸、251位的甘氨酸、254位的亮氨酸、258位的亮氨酸、263位的酪氨酸、269位的缬氨酸、273位的谷氨酸。
【实施例12】
确定各抗体的可变区的氨基酸序列
对于EL抗体，应用常规方法确定可变区的序列，示于图4A～图4L中。
【实施例13】
55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3和23H8抗体的可变区的氨基酸序列的比对
使用基因分析软件GENETYX比对55A1、7D4、14A1、2D5、53A11、13B3和23H8抗体的重链和轻链的氨基酸序列(图5A至图5D)。
比对的结果发现，55A1、7D4、14A1和2D5抗体的重链和轻链的各CDR的氨基酸序列是类似的，残余的53A11、13B3和23H8抗体的重链的CDR1和CDR2的氨基酸序列是类似的。
55A1、7D4、14A1和2D5抗体的重链和轻链的各CDR的氨基酸序列如下文所述是类似的。
重链的CDR1由NYGMN的5个氨基酸序列组成。
重链的CDR2由WINTYSGVPTY(A或T)(G或D)DFKG的17个氨基酸序列组成。
重链的CDR3由(R或F)(G或S)YYGR(R或H)YFD(V或Y)的11个氨基酸序列组成。
轻链的CDR1由KASQSVDYD(V或G)DSYM(H或N)的15个氨基酸序列组成。
轻链的CDR2由AASNLXS的7个氨基酸序列组成。X表示任意氨基酸。
轻链的CDR3由(H或Q)Q(T或S)(I或T或N)(E或D)DPP(-或W)T的9或10个氨基酸序列组成。-表示氨基酸缺失。
53A11、13B3和23H8抗体的重链的CDR1和CDR2的氨基酸如下文所述是类似的。
重链的CDR1由(D或E)(Y或N)T(M或I)H的5个氨基酸序列组成。
重链的CDR2由XINPYYGGTX(Y或N)NEKFKD的17个氨基酸组成。X表示任意的氨基酸序列。
重链的CDR3和轻链的各CDR中没有看到氨基酸序列的共通性。
【实施例14】
16B3、16E7、14E1和19E7抗体的可变区的氨基酸序列的比对
使用基因分析软件GENETYX比对16B3、16E7、14E1和19E7抗体的重链和轻链的氨基酸序列(图6A至图6D)。
比对的结果发现，16B3与16E7抗体的重链和轻链的各CDR的氨基酸序列是类似的。
16B3和16E7抗体的重链和轻链的各CDR的氨基酸序列如下文所述是类似的。
重链的CDR1由(G或S)YTMS的5个氨基酸序列组成。
重链的CDR2由EISF(A或T)R(D或S)RAFYPDTVKG的17个氨基酸组成。
重链的CDR3由LGG(R或N)N(H或Y)DYWYFDV的13个氨基酸序列组成。
轻链的CDR1由RASESVEYYGTSLMQ的15个氨基酸序列组成。
轻链的CDR2由AASNVES的7个氨基酸序列组成。
轻链的CDR3由QQSWKVPFT的9个氨基酸序列组成。
【产业实用性】
本发明的抑制血管内皮脂肪酶的酶活性的抗体具有对血管内皮脂肪酶的选择性抑制活性，因此，作为用于脂质代谢异常、高脂血症、动脉硬化、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、糖尿病、肥胖和/或X综合征的治疗和/或预防的药物是有用的。
Claims (5)
1.抑制血管内皮脂肪酶的酶活性的单克隆抗体，选自：
1)单克隆抗体，其具有：
包含由序列编号10的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号11的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号12的氨基酸序列组成的CDR3的重链可变区、以及
包含由序列编号14的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号15的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号16的氨基酸序列组成的CDR3的轻链可变区，
2)单克隆抗体，其具有：
包含由序列编号18的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号19的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号20的氨基酸序列组成的CDR3的重链可变区、以及
包含由序列编号22的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号23的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号24的氨基酸序列组成的CDR3的轻链可变区，
3)单克隆抗体，其具有：
包含由序列编号26的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号27的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号28的氨基酸序列组成的CDR3的重链可变区、以及
包含由序列编号30的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号31的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号32的氨基酸序列组成的CDR3的轻链可变区，
4)单克隆抗体，其具有：
包含由序列编号34的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号35的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号36的氨基酸序列组成的CDR3的重链可变区、以及
包含由序列编号38的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号39的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号40的氨基酸序列组成的CDR3的轻链可变区，
5)单克隆抗体，其具有：
包含由序列编号42的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号43的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号44的氨基酸序列组成的CDR3的重链可变区、以及
包含由序列编号46的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号47的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号48的氨基酸序列组成的CDR3的轻链可变区，
6)单克隆抗体，其具有：
包含由序列编号50的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号51的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号52的氨基酸序列组成的CDR3的重链可变区、以及
包含由序列编号54的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号55的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号56的氨基酸序列组成的CDR3的轻链可变区，
7)单克隆抗体，其具有：
包含由序列编号58的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号59的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号60的氨基酸序列组成的CDR3的重链可变区、以及
包含由序列编号62的氨基酸序列组成的CDR1、由序列编号63的氨基酸序列组成的CDR2和由序列编号64的氨基酸序列组成的CDR3的轻链可变区。
2.抑制血管内皮脂肪酶的酶活性的单克隆抗体，选自：
1)单克隆抗体，其具有：
由序列编号9的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由序列编号13的氨基酸序列组成的轻链可变区，
2)单克隆抗体，其具有：
由序列编号17的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由序列编号21的氨基酸序列组成的轻链可变区，
3)单克隆抗体，其具有：
由序列编号25的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由序列编号29的氨基酸序列组成的轻链可变区，
4)单克隆抗体，其具有：
由序列编号33的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由序列编号37的氨基酸序列组成的轻链可变区，
5)单克隆抗体，其具有：
由序列编号41的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由序列编号45的氨基酸序列组成的轻链可变区，
6)单克隆抗体，其具有：
由序列编号49的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由序列编号53的氨基酸序列组成的轻链可变区，
7)单克隆抗体，其具有：
由序列编号57的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由序列编号61的氨基酸序列组成的轻链可变区。
3.根据权利要求1至2中任一项的单克隆抗体的人源化单克隆抗体。
4.用于血管内皮脂肪酶相关疾病的治疗或预防的药物组合物，其含有权利要求1至3中任一项的单克隆抗体。
5.权利要求4的药物组合物，其中血管内皮脂肪酶相关疾病是脂质代谢异常。
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