CN105368742A - 一种含acc脱氨酶的pgpr筛选和分离方法 - Google Patents

一种含acc脱氨酶的pgpr筛选和分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法。方法包括以下几个步骤：(1)采集；(2)根际菌的分离和纯化；(3)内生菌的分离和纯化。本发明的筛选和分离方法简单，效果好，分离得到的PGPR菌株可以用来作为种子萌发液，在用来萌发球花石楠种子时，发芽率为86％-87.3％，发芽势为72％-73％，平均根长为1.90-1.93cm，没有采用种子萌发液处理的球花石楠种子发芽率为67.7％，发芽势为66％，根长为1.05cm。

Description

一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法
技术领域：
本发明涉及一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法。
背景技术：
在所有根际促生菌中，尤以含ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid)脱氨酶活性的PGPR，不仅能有效的促进植物的生长，而且在逆境条件下(重金属污染、干旱、洪涝、高盐等)能大大提高植物的抗逆性。
球花石楠是很好的园林绿化树种，四季常绿，同时在常绿的树种中也是十分难得的季节性色叶树种。它的观赏价值主要体现在它的叶、花、果实以及树形等观赏特性上[62]。球花石楠在园林上的观赏价值十分高，其树冠圆整，果实呈鲜艳的红色，一年四季都有其可观赏的价值，在园林绿化中扮演着十分重要的角色。
发明内容：
本发明目的是，用来弥补现有技术的不足，提供一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法，包括以下几个步骤：
(1)采集：采集植物根系和根际土壤，备用；
(2)根际菌的分离和纯化：将采集的根际土壤放于装有滤纸的培养皿内自然风干，5-7d后称取1g根际土壤，将其溶解于装有10ml无菌水和玻璃珠的锥形瓶里，振荡两小时，吸取1ml浑浊液，加无菌水稀释到10ml，振荡摇匀后吸取1ml浑浊液，将其稀释到10ml，制成菌悬液；然后再吸取50μL菌悬液用涂布器均匀的涂布在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培养基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2℃不需光照的恒温培养箱内培养；48-72h后，挑取单菌落，反复划线验证观察其是否能生长，然后接种于38号培养基划线培养，连续划线3次，得到细菌的纯培养物；
(3)内生菌的分离和纯化：根系用自来水洗净泥土等脏物，将根切成约0.5cm的小段，无菌水冲洗3-5次，Tween-20处理60s，5％次氯酸钠溶液消毒6min，2.5％的硫代硫酸钠处理10min，无菌水冲洗3-4次，75％酒精浸泡1min，无菌水洗涤3-4次，最后将其放入已灭菌的硅胶中，封口放入55℃烘箱中烘干，将已烘干的组织放入已消毒的豆浆搅拌机里打碎成粉末，然后取少许粉末均匀洒在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培养基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2℃不需光照的恒温培养箱内培养；48-72h后，挑取单菌落，反复划线验证观察其是否能生长，然后接种于38号培养基划线培养，连续划线3次，得到细菌的纯培养物。
所述的一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法，采集的为月季根际土壤及其根系。
所述的一种含PGPR菌株的种子萌发液，将PGPR菌株接种于ADF培养基平板中，然后挑取单菌落接种于100mLADF液体培养基中振荡培养，1-1.5d后将其分别移入离心管中，于台式高速冷冻离心机中，8500rpm、4℃、10min，离心弃上清，然后用配置好的30mmol·L-1硫酸镁缓冲溶液洗涤两次，得到种子萌发液。
所述的一种种子萌发液的使用方法，将种子萌发液于紫外可见分光光度计下稀释到0.01-0.05Abs，浸泡种子即可。
所述的一种种子萌发液用于球花石楠种子萌发的方法，包括以下几个步骤：
(1)球花石楠果实处理：将采集后的球花石楠果实放入水中浸泡2h左右，然后揉搓去除果肉，再用细筛过滤出球花石楠种子，并去除其中杂质，于阴凉通风处晾干，1-2d后将风干后的种子，放入种子萌发液中浸泡12h，过滤放入装有滤纸的培养皿中培养；
(2)培养：将上述经过处理的球花石楠种子移入光照培养箱中予以培养，温度设定为22℃，光照强度为4LS，湿度为90％，光周期设定为16h白昼，8h黑夜。
本发明的有益效果如下：
本发明的筛选和分离方法简单，效果好，分离得到的PGPR菌株可以用来作为种子萌发液，在用来萌发球花石楠种子时，发芽率为86％-87.3％，发芽势为72％-73％，平均根长为1.90-1.93cm，没有采用种子萌发液处理的球花石楠种子发芽率为67.7％，发芽势为66％，根长为1.05cm。
具体实施方式：
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法，包括以下几个步骤：
(1)采集：采集月季根系和根际土壤，备用；
(2)根际菌的分离和纯化：将采集的根际土壤放于装有滤纸的培养皿内自然风干，5-7d后称取1g根际土壤，将其溶解于装有10ml无菌水和玻璃珠的锥形瓶里，振荡两小时，吸取1ml浑浊液，加无菌水稀释到10ml，振荡摇匀后吸取1ml浑浊液，将其稀释到10ml，制成菌悬液；然后再吸取50μL菌悬液用涂布器均匀的涂布在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培养基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2℃不需光照的恒温培养箱内培养；48-72h后，挑取单菌落，反复划线验证观察其是否能生长，然后接种于38号培养基划线培养，连续划线3次，得到细菌的纯培养物；
(3)内生菌的分离和纯化：根系用自来水洗净泥土等脏物，将根切成约0.5cm的小段，无菌水冲洗3-5次，Tween-20处理60s，5％次氯酸钠溶液消毒6min，2.5％的硫代硫酸钠处理10min，无菌水冲洗3-4次，75％酒精浸泡1min，无菌水洗涤3-4次，最后将其放入已灭菌的硅胶中，封口放入55℃烘箱中烘干，将已烘干的组织放入已消毒的豆浆搅拌机里打碎成粉末，然后取少许粉末均匀洒在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培养基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2℃不需光照的恒温培养箱内培养；48-72h后，挑取单菌落，反复划线验证观察其是否能生长，然后接种于38号培养基划线培养，连续划线3次，得到细菌的纯培养物。
所述的一种含PGPR菌株的种子萌发液，将PGPR菌株接种于ADF培养基平板中，然后挑取单菌落接种于100mLADF液体培养基中振荡培养，1-1.5d后将其分别移入离心管中，于台式高速冷冻离心机中，8500rpm、4℃、10min，离心弃上清，然后用配置好的30mmol·L-1硫酸镁缓冲溶液洗涤两次，得到种子萌发液。
所述的一种种子萌发液的使用方法，将种子萌发液于紫外可见分光光度计下稀释到0.01-0.05Abs，浸泡种子即可。
所述的一种种子萌发液用于球花石楠种子萌发的方法，包括以下几个步骤：
(1)球花石楠果实处理：将采集后的球花石楠果实放入水中浸泡2h左右，然后揉搓去除果肉，再用细筛过滤出球花石楠种子，并去除其中杂质，于阴凉通风处晾干，1-2d后将风干后的种子，放入0.01Abs种子萌发液中浸泡12h，过滤放入装有滤纸的培养皿中培养；
(2)培养：将上述经过处理的球花石楠种子移入光照培养箱中予以培养，温度设定为22℃，光照强度为4LS，湿度为90％，光周期设定为16h白昼，8h黑夜。
实施例2
一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法，包括以下几个步骤：
(1)采集：采集月季根系和根际土壤，备用；
(2)根际菌的分离和纯化：将采集的根际土壤放于装有滤纸的培养皿内自然风干，5-7d后称取1g根际土壤，将其溶解于装有10ml无菌水和玻璃珠的锥形瓶里，振荡两小时，吸取1ml浑浊液，加无菌水稀释到10ml，振荡摇匀后吸取1ml浑浊液，将其稀释到10ml，制成菌悬液；然后再吸取50μL菌悬液用涂布器均匀的涂布在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培养基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2℃不需光照的恒温培养箱内培养；48-72h后，挑取单菌落，反复划线验证观察其是否能生长，然后接种于38号培养基划线培养，连续划线3次，得到细菌的纯培养物；
(3)内生菌的分离和纯化：根系用自来水洗净泥土等脏物，将根切成约0.5cm的小段，无菌水冲洗3-5次，Tween-20处理60s，5％次氯酸钠溶液消毒6min，2.5％的硫代硫酸钠处理10min，无菌水冲洗3-4次，75％酒精浸泡1min，无菌水洗涤3-4次，最后将其放入已灭菌的硅胶中，封口放入55℃烘箱中烘干，将已烘干的组织放入已消毒的豆浆搅拌机里打碎成粉末，然后取少许粉末均匀洒在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培养基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2℃不需光照的恒温培养箱内培养；48-72h后，挑取单菌落，反复划线验证观察其是否能生长，然后接种于38号培养基划线培养，连续划线3次，得到细菌的纯培养物。
所述的一种含PGPR菌株的种子萌发液，将PGPR菌株接种于ADF培养基平板中，然后挑取单菌落接种于100mLADF液体培养基中振荡培养，1-1.5d后将其分别移入离心管中，于台式高速冷冻离心机中，8500rpm、4℃、10min，离心弃上清，然后用配置好的30mmol·L-1硫酸镁缓冲溶液洗涤两次，得到种子萌发液。
所述的一种种子萌发液的使用方法，将种子萌发液于紫外可见分光光度计下稀释到0.01-0.05Abs，浸泡种子即可。
所述的一种种子萌发液用于球花石楠种子萌发的方法，包括以下几个步骤：
(1)球花石楠果实处理：将采集后的球花石楠果实放入水中浸泡2h左右，然后揉搓去除果肉，再用细筛过滤出球花石楠种子，并去除其中杂质，于阴凉通风处晾干，1-2d后将风干后的种子，放入0.05Abs种子萌发液中浸泡12h，过滤放入装有滤纸的培养皿中培养；
(2)培养：将上述经过处理的球花石楠种子移入光照培养箱中予以培养，温度设定为22℃，光照强度为4LS，湿度为90％，光周期设定为16h白昼，8h黑夜。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)采集：采集植物根系和根际土壤，备用；
(2)根际菌的分离和纯化：将采集的根际土壤放于装有滤纸的培养皿内自然风干，5-7d后称取1g根际土壤，将其溶解于装有10ml无菌水和玻璃珠的锥形瓶里，振荡两小时，吸取1ml浑浊液，加无菌水稀释到10ml，振荡摇匀后吸取1ml浑浊液，将其稀释到10ml，制成菌悬液；然后再吸取50μL菌悬液用涂布器均匀的涂布在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培养基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2℃不需光照的恒温培养箱内培养；48-72h后，挑取单菌落，反复划线验证观察其是否能生长，然后接种于38号培养基划线培养，连续划线3次，得到细菌的纯培养物；
(3)内生菌的分离和纯化：根系用自来水洗净泥土等脏物，将根切成约0.5cm的小段，无菌水冲洗3-5次，Tween-20处理60s，5％次氯酸钠溶液消毒6min，2.5％的硫代硫酸钠处理10min，无菌水冲洗3-4次，75％酒精浸泡1min，无菌水洗涤3-4次，最后将其放入已灭菌的硅胶中，封口放入55℃烘箱中烘干，将已烘干的组织放入已消毒的豆浆搅拌机里打碎成粉末，然后取少许粉末均匀洒在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培养基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2℃不需光照的恒温培养箱内培养；48-72h后，挑取单菌落，反复划线验证观察其是否能生长，然后接种于38号培养基划线培养，连续划线3次，得到细菌的纯培养物。
2.根据权利要求1所述的一种含ACC脱氨酶的PGPR筛选和分离方法，其特征在于，采集的为月季根际土壤及其根系。
3.根据权利要求1或2所述的一种含PGPR菌株的种子萌发液，其特征在于，将PGPR菌株接种于ADF培养基平板中，然后挑取单菌落接种于100mLADF液体培养基中振荡培养，1-1.5d后将其分别移入离心管中，于台式高速冷冻离心机中，8500rpm、4℃、10min，离心弃上清，然后用配置好的30mmol·L-1硫酸镁缓冲溶液洗涤两次，得到种子萌发液。
4.根据权利要求3所述的一种种子萌发液的使用方法，其特征在于，将种子萌发液于紫外可见分光光度计下稀释到0.01-0.05Abs，浸泡种子即可。
5.根据权利要求4所述的一种种子萌发液用于球花石楠种子萌发的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)球花石楠果实处理：将采集后的球花石楠果实放入水中浸泡2h左右，然后揉搓去除果肉，再用细筛过滤出球花石楠种子，并去除其中杂质，于阴凉通风处晾干，1-2d后将风干后的种子，放入种子萌发液中浸泡12h，过滤放入装有滤纸的培养皿中培养；
(2)培养：将上述经过处理的球花石楠种子移入光照培养箱中予以培养，温度设定为22℃，光照强度为4LS，湿度为90％，光周期设定为16h白昼，8h黑夜。
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