CN105367639A - 青杄转录因子PwNF-YB3及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了青杄转录因子PwNF-YB3及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现新基因PwNF-YB3，将其导入拟南芥中得到转PwNF-YB3拟南芥，转PwNF-YB3拟南芥耐干旱和耐盐，表明PwNF-YB3或其编码的蛋白具备耐干旱和耐盐性。

Description

青杄转录因子PwNF-YB3及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及青杄转录因子PwNF-YB3及其编码基因与应用。

背景技术

农作物的生产受到盐碱、干旱等非生物胁迫的影响非常严重。全世界约有20％的耕地和50％的灌溉田受到不同程度的盐害威胁，并有逐年增加的趋势。我国盐渍土地面积约为1.4亿亩，占耕地总面积的近7％，此外还有盐渍荒地2亿多亩。全世界干旱和半干旱地区总面积占陆地总面积的34.9％；我国干旱、半干旱耕地面积占总面积的51％。通过转基因提高作物的耐盐抗旱能力是一条行之有效的办法。因此，寻找与盐、干旱胁迫有关的基因并研究其具体功能，以及调控途径具有重要的理论和实践意义。

早期的耐盐基因工程主要集中在清除自由基和增加渗透调节物质两个方面，并且主要通过转化单个或多个功能基因来提高转基因植株的耐盐能力，虽然转基因植株的耐盐能力有所提高，但效果不太明显。最近，定位在细胞核内的许多调节盐胁迫下功能基因表达的转录因子从许多植物中分离出来。研究结果表明通过这些转录因子调节后期的许多功能基因的表达，可以大大提高转基因植株的耐盐性，从而很大程度上促进了耐盐基因工程方面的研究工作并取得突破性进展。

NF-Y转录因子分为NF-YA,NF-YB和NF-YC三大家族。作为转录因子以其DNA结合域与一些基因启动子区的CCAAT序列结合来调节转录活性。目前对NF-Y的转录调控机制的研究主要是在酵母和哺乳动物中进行的,在植物中的报道只在近几年逐渐多起来。研究表明NF-Y转录因子可参与植物的多种生长发育及多种逆境反应，目前还未见青杄NF-YB家族成员对于其在种子萌发及幼苗抗盐耐旱方面的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供青杄转录因子PwNF-YB3及其编码基因。

本发明提供的蛋白，与植物抗盐耐旱相关，名称为PwNF-YB3，来源于青杄(PiceawilsoniiMast.)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使1)中的PwNF-YB3便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签

表1为标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的PwNF-YB3可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的PwNF-YB3的编码基因可通过将序列表1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述编码与植物耐逆性相关的蛋白DNA分子(名称为PwNF-YB3)也属于本发明的保护范围之内。

上述PwNF-YB3基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)编码区为序列表中序列1所示的核苷酸；

2)编码区为序列表中序列3所示的核苷酸；

3)在严格条件下与1)或2)杂交且编码所述蛋白的DNA分子；；

4)与1)或2)具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子；。

上述序列1由687个核苷酸组成，可编码序列表中序列2所述的蛋白，序列3为在序列1的两端添加酶切位点。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增上述PwNF-YB3基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

具体如下：引物1：5‘-ATGGCAGAGAACTATGGCAG-3’；

引物2：5‘-CTACCATTGGCCCCTGGGGGCT-3’。

含有上述PwNF-YB3基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

含有上述PwNF-YB3基因的重组载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有PwNF-YB3基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA1205、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。

使用PwNF-YB3基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的实施例中，采用的表达载体为pBI121，所述重组载体具体可为在pBI121的BamHI和SalI位点间插入上述PwNF-YB3基因(序列1或序列3)得到的重组表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的培育转基因植物的方法是将PwNF-YB3基因转入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物耐逆性高于所述目的植物。

上述方法中，上述的DNA分子是通过上述的重组载体导入目的植物中的；上述的PwNF-YB3基因可通过上述的重组表达载体导入目的植物中的。携带有本发明的PwNF-YB3基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

进一步，上述逆境是高盐环境或干旱环境。

所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱性。

所述耐逆性通过如下体现：所述转基因植物在高浓度盐或高浓度PEG的胁迫下种子萌发率和/或幼苗根长大于所述所述目的植物。上述高盐环境具体可以是75mM、150mM、165mM或220mM的NaCl水溶液引起的环境；上述干旱环境具体可以是100mM、200mM、300mM或400mM的甘露醇水溶液模拟得到的干旱环境。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。

本发明的实验证明，本发明发现新基因PwNF-YB3，将其导入拟南芥中得到转PwNF-YB3拟南芥，转PwNF-YB3拟南芥耐干旱和耐盐，具体为转PwNF-YB3拟南芥的种子在培养基中Nacl浓度为75mM、150mM、165mM和220mM时的萌发率显著高于野生型对照的种子萌发率，在培养基中NaCl浓度为165mM时幼苗的根长显著高于野生型对照的幼苗根长；并且本发明获得的转基因拟南芥的种子在培养基中甘露醇浓度为100mM、200mM、300mM和400mM时的的萌发率显著高于野生型对照的种子萌发率，在培养基中甘露醇浓度为300mM时幼苗的根长显著高于野生型对照的幼苗的根长；上述结果表明，PwNF-YB3或其编码的蛋白具备耐干旱和耐盐性。

附图说明

图1为PwNF-YB3基因在青杄各组织中的表达情况

图2为转PwNF-YB3拟南芥分子检测结果

图3为转PwNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子在165mM的NaCl处理下萌发7天的观测结果

图4为转PwNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子在不同浓度NaCl处理下萌发率测定结果

图5为转PwNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子在300mM的PEG处理下萌发7天的观测结果

图6为转PwNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子在不同浓度PEG处理下萌发率测定结果

图7为转PwNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度NaCl和PEG的平板生长7天的根长观察结果

图8为转PwNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度NaCl和PEG的根长测定结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、转录因子PwNF-YB3及其编码基因

1、转录因子PwNF-YB3及其编码基因的获得

青杄cDNA文库由英潍捷基(上海)公司构建完成，方法是Gateway。利用青杄PwNF-YB3的EST序列，以5’-CAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA-3’和5’-CTCGCCGGTGATGAAACTGATG-3’为引物进行5’RACE-PCR；以5’-GCTTACAGTGGTCTGAACCCTAG-3’和5’-CTGCCAGGAAACAGCTATGAC-3’为引物进行和3’RACE-PCR扩增，将RACE-PCR产物与EST序列拼接得到cDNA全长序列，经过测序，cDNA核苷酸序列为序列表中序列1，与Genbank中的序列进行比较，确定它属于青杄NF-YB类转录因子，将其所示的基因命名为PwNF-YB3，编码的蛋白命名为PwNF-YB3，其氨基酸序列为序列表中序列2。

上述cDNA可以通过人工合成获得。

2、通过荧光定量PCR分析PwNF-YB3基因的组织表达情况

分别提取青杄花粉、针叶、树皮和根组织的RNA，反转录合成cDNA；然后分别以上述各组织的cDNA为模板，以5’-CAGAGAAATGGAGGGCGAGAAG-3’和5’-ACCACTGTAAGCATTAGCATTAGAG-3’为引物进行PCR扩增，检测PwNF-YB3基因在青杄不同组织中的表达情况。同时以EF1-α基因作为内参，扩增EF1-α基因的5’引物为：5’-AACTGGAGAAGGAACCCAAG-3’，3’引物为：5’-AACGACCCAATGGAGGATAC-3’。

RT-qPCR反应条件：先95℃预变性15min；然后95℃20sec，56℃28sec，72℃50sec，共33个循环；再72℃延伸5min。

PwNF-YB3基因在各组织中的表达情况如图1所示，结果表明，PwNF-YB3在所有组织中均有表达，花粉中表达量较低，树皮中表达量最高。

实施例2、PwNF-YB3基因在提高植物耐逆性中的应用

一、转PwNF-YB3拟南芥的构建

1、PwNF-YB3基因的获得

制备下述引物对：

引物1：5‘-ATGGCAGAGAACTATGGCAG-3’；

引物2：5‘-CTACCATTGGCCCCTGGGGGCT-3’。

以青杄(Piceawilsonii，记载在如下文献中：YuYL,LiLL,etal.ThePwHAP5,aCCAAT-bindingtranscriptionfactor,interactswithPwFKBP12andplaysaroleinpollentubegrowthorientationinPiceawilsonii..JournalofExperimentalBotany,2011,14:4805–4817.，公众可从北京林业大学获得)的cDNA为模板，用上述引物1和2进行PCR扩增，得到687bp的PCR产物。

将687bp的PCR产物送去测序，其核苷酸序列为序列表中序列1，由687个核苷酸组成，可编码序列表中序列2所述的蛋白PwNF-YB3。

2、重组表达载体的获得

将上述PCR产物与pEASY-T载体(购自全式金公司)相连接，得到的连接产物用限制性内切酶BamHI和SalI进行双酶切，得到酶切产物(含有上述PwNF-YB3基因的DNA片段，核苷酸序列为序列表中序列3(序列3仅是在序列1两端添加酶切位点)，酶切产物与经相同酶切的质粒pBI121(购自Clontech公司)相连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自天根公司)，并涂布在含有5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷、X-gal和100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上培养过夜。挑取白色单菌落，在LB液体培养基中培养过夜并进行菌落PCR鉴定；同时碱法提取质粒DNA进行序列测定。

测序结果表明，质粒为将序列表中序列1或序列3所示的PwNF-YB3插入表达载体PBI121的BamHI和SalI酶切位点间得到的重组载体，命名为PBI121-PwNF-YB3。

3、转PwNF-YB3拟南芥的获得

1)转PwNF-YB3拟南芥的获得

将上述2制备的重组载体PBI121-PwNF-YB3转化农杆菌GV3101的感受态细胞，得到重组菌GV3101/PBI121-PwNF-YB3(提取质粒送去测序，为重组载体PBI121-PwNF-YB3)。

将重组菌GV3101/PBI121-PwNF-YB3单克隆接种于含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养两天。将培养液3000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀用含5％蔗糖和0.03％SilwetL-77的侵染液悬浮。

采用沾花浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-0)(购自ABRC)，收获该当代转基因拟南芥植株所接的种子(T1代),在含有50mg/LKan(卡那霉素)的MS培养基筛选萌发的种子。将在上述培养基上萌发的T1代幼苗移到培养土中，收获种子(T2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的T3代转PwNF-YB3拟南芥种子。最后将T3代转基因拟南芥种子直接播种到培养土中，长出的T3代转PwNF-YB3拟南芥植株在长日照条件下生长两周左右开花。

2)转PwNF-YB3拟南芥的分子检测

提取T3代转PwNF-YB3拟南芥全株的RNA，反转录得到cDNA，以其为模板，用如下引物进行PCR扩增。以野生型拟南芥为对照。

引物1：5’-CAGAGAAATGGAGGGCGAGAAG-3’

引物2：5’-ACCACTGTAAGCATTAGCATTAGAG-3’

结果如图2所示，T3代转PwNF-YB3拟南芥(T)PwNF-YB3的表达量显著高于野生型拟南芥(WT)，表明PwNF-YB3在T3代转PwNF-YB3拟南芥表达。

采用同样的方法，将空载体PBI121转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，播种、传代，得到T3代转空载体拟南芥。

二、转PwNF-YB3拟南芥功能研究

1、种子萌发试验

1)耐盐性研究

取野生型拟南芥(WT)、T3代转PwNF-YB3拟南芥(T)和T3代转空载体拟南芥的种子，在MS培养基上进行种子萌发实验，其中培养基中含不同Nacl浓度(分别是75mM、150mM、165mM和220mM)，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmolm^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。每个株系100粒种子，实验重复3此，结果取平均值。

在第7天统计种子萌发率，结果如图3和图4所示(WT表示野生型拟南芥，T表示T3代转PwNF-YB3拟南芥，图3为表型图，图4为统计图)，T3代转PwNF-YB3拟南芥的种子在培养基中Nacl浓度为75mM、150mM、165mM和220mM时的萌发率显著高于野生型拟南芥的种子萌发率。

野生型拟南芥(WT)和T3代转空载体拟南芥结果无显著差异。

2)耐干旱性研究

取野生型拟南芥(WT)、T3代转PwNF-YB3拟南芥(T)和T3代转空载体拟南芥的种子，在MS培养基上进行种子萌发实验，其中培养基中含不同甘露醇浓度(分别是0、100mM、200mM、300mM和400mM)，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmolm^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。每个株系100粒种子，实验重复3此，结果取平均值。

在第7天统计种子萌发率，结果如图5和图6所示(WT表示野生型拟南芥，T表示T3代转PwNF-YB3拟南芥，图5为表型图，图6为统计图)，T3代转PwNF-YB3拟南芥的种子在甘露醇浓度为100mM、200mM、300mM和400mM时的的萌发率显著高于野生型拟南芥的种子萌发率。

野生型拟南芥(WT)和T3代转空载体拟南芥结果无显著差异。

2、根长测量耐盐性和耐干旱试验

取野生型拟南芥(WT)、T3代转PwNF-YB3拟南芥(T)和T3代转空载体拟南芥的种子，在MS培养基上进行种子萌发实验，萌发后生长5天的拟南芥幼苗，用镊子移除，垂直平铺在MS培养基上，其中培养基中含NaCl和PEG的浓度分别是165mM和300mM。实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmolm^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。每个株系30株，实验重复3此，结果取平均值。

在第7天测量统计两个株系的根长，结果如图7和图8所示(WT表示野生型拟南芥，T表示T3代转PwNF-YB3拟南芥，图7为表型图，图8为统计图)，T3代转PwNF-YB3拟南芥的种子在NaCl浓度为165mM、甘露醇浓度为300mM时的根长显著高于野生型拟南芥的幼苗根长。

野生型拟南芥(WT)和T3代转空载体拟南芥结果无显著差异。

上述结果表明，PwNF-YB3或其编码的蛋白具备耐干旱和耐盐性。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸序列残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的核苷酸；

2)编码区为序列表中序列3所示的核苷酸；

3)在严格条件下与1)或2)杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。

6.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在调控植物耐逆性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述调控为提高；

所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱性；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。

8.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求2或3所述的DNA分子转入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物耐逆性高于所述目的植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的DNA分子是通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物中的；

所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。