CN105362223A - 一种可靶向药物的三嵌段共聚物胶束的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可靶向药物的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚L-酪氨酸两亲性三嵌段共聚物胶束的制备方法，以聚乙二醇单甲醚(MPEG)为大分子引发剂，通过ε-己内酯(CL)、L-酪氨酸不同层级的聚合反应得到两亲性三嵌段共聚物。该共聚物在水中能自组装成生物相容性纳米胶束，其粒径小于人体最细毛细血管，易通过生理屏障；疏水性内核可增加疏水药物的水溶性，且不易产生药物突释；“增强渗透和滞留效应”(EPR)使药物在肿瘤部位聚集，从而达到靶向作用；外壳的柔韧性和亲水性可大大减少或避免被网状内皮系统识别及摄取的机会，延长药物在血液中的循环时间，提高了生物利用度。

Description

一种可靶向药物的三嵌段共聚物胶束的制备方法

技术领域

本发明属于药用高分子材料领域，具体涉及一种可靶向药物的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚L-酪氨酸两亲性三嵌段共聚物的制备方法。该共聚物主要用于疏水药物的包载，达到靶向作用。

背景技术

近些年来人们对嵌段共聚物在药物载体应用上进行了大量研究。嵌段共聚物是由不同链段单元按照一定的序列连接而组成的聚合物，而两亲性嵌段共聚物溶解后可自发形成由亲水外壳和疏水性内核组成的高分子胶束。将疏水性药物包埋于疏水端，可有效增加疏水性药物的水溶性，减少或避免被网状内皮系统识别及清除，且在血液长循环中通过EPR效应于肿瘤部位聚集进而达到靶向的效果。

目前，常见的嵌段共聚物胶束主要分为二嵌段和三嵌段的，二嵌段共聚物是最基础的嵌段结构，如中国专利201210086290.7等公开了一种聚乳酸-聚乙二醇的合成方法；具有亲水性外壳与疏水性内核，可包载疏水性药物而增加其水溶性，然而，由于其二嵌段的结构，制备胶束与三嵌段共聚物相比稳定性差，且对疏水性药物的包载也次于三嵌段共聚物胶束，在药物靶向性的优势亦略于三嵌段共聚物。三嵌段聚合物具有更低的临界相对浓度，随之出现的是更好的稳定性，邓联东等以甲苯异氰酸酯为偶联剂，合成了PEG-b-PCL-b-PEG两亲性三嵌段共聚物，生物降解性好，制备工艺简单，但由于其制备工程中，每个链段大小的不可控性，制备的胶束粒径分布不均，工艺重现性差；嵌段共聚物的亲水性片段主要由聚乙二醇(PEG)或聚氧乙烯(PEO)构成，疏水性片段常由聚苯乙烯(PSt)、聚己内酯或聚氨基酸等构成。聚己内酯具有生物降解性、药物透过性、生物相容性、可降解性以及原料易得等优点。本发明选用的合成材料聚酪氨酸，自身可降解为人体合成蛋白质所需氨基酸，容易被机体吸收和代谢，是一类生物降解高分子，因此其无毒且具有良好的生物相容性，容易被机体吸收和代谢，降解性也优于其他合成材料；将亲水性的MPEG、PCL与聚氨基酸通过原子转移自由基聚合形成三嵌段共聚物，再通过乳化溶剂蒸发法制备载药胶束，能够有效提高药物的稳定性，易于存放，延长其贮藏时间，生物相容性好，毒性小，安全性高；工艺粒径分布均匀，选用经典的盖布瑞尔伯胺合成反应，根据活性基团间反应而生成稳定结合的化学键，制备重现性好；且能够保护被包埋药物，利用荧光内窥视共聚焦成像系统对进行靶向递药研究证明其靶向作用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种可靶向药物的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚L-酪氨酸两亲性三嵌段共聚物的制备方法。

本发明所述的一种可靶向药物的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚L-酪氨酸两亲性三嵌段共聚物胶束的制备方法，该方法通过盖布瑞尔伯胺合成反应制备MPEG-PCL-NH₂，再以MPEG-PCL-NH₂为大分子引发剂引发L-Tyr-NCA活性单体进行聚合得到直链型三嵌段共聚物。

本发明所述的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚L-酪氨酸两亲性三嵌段共聚物为兼含亲水性的聚乙二醇单甲醚链段与疏水性的聚己内酯、聚酪氨酸链段的三嵌段共聚物。所述的聚乙二醇单甲醚为第一链段，其聚合度为45；聚己内酯为第二链段，其聚合度为12～15；聚L-酪氨酸为第三链段，其聚合度为5～8。

将上述两亲性嵌段共聚物0.02～0.05g溶于10ml二氯甲烷中，逐滴加入8～15ml的蒸馏水，在40℃、800～1000r﹒min^-1条件下搅拌2～4h，回收二氯甲烷，形成1～100nm大小的胶束。

本发明所述的三嵌段共聚物的具体制备步骤为：

(1)MPEG-PCL二嵌段共聚物的制备：

无水无氧、氮气保护条件下以100～150ml甲苯为溶剂，异辛酸亚锡为催化剂，将10.00gMPEG与1.00～1.20mol﹒L^-1ε-己内酯置于三颈瓶中反应12～15h，磁力搅拌速度为800～1000r﹒min^-1温度为130℃；氮气终止反应后将混合液冷却置室温，旋转蒸发掉溶剂，并用3～4倍乙醚分级沉淀出聚合物，滤过，25℃条件下真空干燥25～30h，得到MPEG-PCL二嵌段共聚物。

(由于ε-己内酯空间位阻小于其他己内酯，易发生开环聚合反应所以选择其为反应物)

(2)MPEG-PCL磺酸酯的制备：

将步骤(1)得到的MPEG-PCL与相同摩尔质量的对甲苯磺酰氯在无水无氧、氮气保护条件下以80～100ml二氯甲烷为溶剂，吡啶为催化剂，反应10～12h，反应温度为90℃，磁力搅拌速度为800～1000r﹒min^-1；氮气终止反应后将混合液冷却置室温，旋转蒸发掉部分溶剂，按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法，得到MPEG-PCL磺酸酯。

(3)MPEG-PCL邻苯二甲酰亚胺酯的制备：

将步骤(2)得到的MPEG-PCL磺酸酯与相同摩尔质量的邻苯二甲酰亚胺钾在无水无氧、氮气保护条件下以60～80mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，反应10～12h，反应温度为70℃，磁力搅拌速度为800～1000r﹒min^-1；氮气终止反应后将混合液冷却置室温，以二氯甲烷为亲溶剂，足量冰乙醚为憎溶剂按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法，得到MPEG-PCL邻苯二甲酰亚胺酯。

(4)大分子引发剂MPEG-PCL-NH₂的制备：

将步骤(3)得到的MPEG-PCL邻苯二甲酰亚胺酯与相同摩尔质量的水合肼以乙醇为溶剂反应8～10h，反应温度为50℃，磁力搅拌速度为800-1000r﹒min^-1；按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法得到引发剂MPEG-PCL-NH₂。

(5)L-Tyr-NCA活化单体的制备：

将L-酪氨酸与三倍质量的二-(三氯甲基)碳酸酯在无水无氧、氮气保护条件下以四氢呋喃(THF)为溶剂，反应20～30min待溶液澄清停止反应，反应温度为50℃，磁力搅拌速度为800～-1000r﹒min^-1；氮气终止反应后将混合液冷却置室温，旋转蒸发掉溶剂，再用石油醚及乙酸乙酯混合液分级沉淀得到初晶，置于-20℃冰箱过夜使其充分结晶，再按步骤(1)的干燥方法得到L-Tyr-NCA活化单体。

步骤(5)中反应时间为20～30min是由于反应20min后溶液澄清，而反应大于30min后体系又变回黄色混悬液。

时间	5min	10min	20min	30min
					反应现象	黄色混悬液	黄色混悬液	基本澄清	黄色混悬液

(6)MPEG-PCL-P-L-Tyr三嵌段共聚物的制备：

将步骤(4)中得到的大分子引发剂MPEG-PCL-NH₂与步骤(5)中的活性单体L-Tyr-NCA在无水无氧、氮气保护条件下以1：5～1：8的比例在二氯甲烷及DMF的混合液中反应，反应温度为50℃，磁力搅拌速度为800～1000r﹒min^-1；氮气终止反应后将混合液冷却置室温，旋转蒸发掉溶剂，按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法得到三嵌段共聚物MPEG-PCL-P-L-Tyr。

(7)将MPEG-PCL-P-L-Tyr三嵌段共聚物溶于二氯甲烷中，其中共聚物和疏水性药物的质量比为5～8：1，在40℃、800～1000r﹒min^-1条件下搅拌至溶解；向溶液中逐滴加入四分之三倍体积的蒸馏水，在40℃、800～1000r﹒min^-1条件下搅拌2～4h，回收溶剂，得到1～100nm大小的共聚物胶束。

上述制备方法中所述的一种可靶向药物的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚L-酪氨酸两亲性三嵌段共聚物胶束的制备方法，其特征在于步骤(7)与(8)中应用的胶束制备方法为乳化溶剂蒸发法。

本发明的优点在于制备工艺简单，且制备的纳米胶束粒径均匀，均在100nm以下，载药量、包封率高，稳定性好。

附图说明

图1为实施例1制备的MPEG、MPEG-PCL与MPEG-PCL-NH₂的IR对比谱图。

图2为实施例1制备的MPEG-PCL-NH₂的¹H-NMR谱图。

图3为实施例1制备的MPEG-PCL-P-L-Tyr的IR谱图。

图4为实施例1制备的MPEG-PCL-P-L-Tyr的¹H-NMR谱图。

图5为共聚物胶束粒径图。

图6分别是靶向性研究前后对比图，图6-1为FITC溶液组，6-2、6-3、6-4、6-5、6-6为FITC标记的载药胶束组。

具体实施方式

实施例1

(1)MPEG-PCL二嵌段共聚物的制备：

在氮气保护条件下以120ml甲苯为溶剂，0.0034mol﹒L^-1异辛酸亚锡为催化剂，将10.0012gMPEG与1.02mol﹒L^-1ε-己内酯置于反应器中130℃、1000r﹒min^-1磁力搅拌条件下反应12h；氮气终止反应后将混合液冷却置室温，旋转蒸发掉溶剂，以二氯甲烷为亲溶剂，足量冷乙醚为憎溶剂采用分级沉淀法除去未反应的反应物，抽滤得到粗品，再经多次溶解沉淀后除去反应物，25℃条件下真空干燥25h得到MPEG-PCL二嵌段共聚物，产率为90％。

(2)MPEG-PCL磺酸酯的制备：

取步骤(1)得到的MPEG-PCL10g，精密称定10.0002g，再取相同摩尔质量的对甲苯磺酰氯0.5265g在氮气保护下以100ml二氯甲烷为溶剂，0.5ml吡啶为催化剂，反应12h，氮气终止反应后将混合液冷却置室温，旋转蒸发掉部分溶剂，按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法，得到MPEG-PCL磺酸酯，产率为85％。

(3)MPEG-PCL邻苯二甲酰亚胺酯的制备：

取步骤(2)得到的MPEG-PCL磺酸酯8g，精密称定为8.0013g与0.3807g邻苯二甲酰亚胺钾在无水无氧、氮气保护条件下以80mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，70℃、1000r﹒min^-1磁力搅拌条件下反应10h；氮气终止反应后将混合液冷却置室温，按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法，得到MPEG-PCL邻苯二甲酰亚胺酯，产率为73％。

(4)大分子引发剂MPEG-PCL-NH₂的制备：

取步骤(3)得到的MPEG-PCL邻苯二甲酰亚胺酯5g,精密称定为5.0007g与相同摩尔质量的水合肼3ml以50ml乙醇为溶剂反应10h，反应温度为50℃，磁力搅拌速度为1000r﹒min^-1；按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法得到引发剂MPEG-PCL-NH₂，产率为81％。

(5)L-Tyr-NCA的制备：

将5.0013g的L-酪氨酸与15.0005g的二-(三氯甲基)碳酸酯在无水无氧、氮气保护条件下以四氢呋喃(THF)为溶剂，50℃、1000r﹒min^-1磁力搅拌条件下反应22min后溶液澄清，氮气终止反应后将混合液冷却置室温，旋转蒸发掉溶剂，再用石油醚及乙酸乙酯混合液分级沉淀得到雪花状结晶，置于冰箱过夜使其充分结晶,抽滤后，25℃干燥20h既得L-Tyr-NCA，产率为92％。

(6)MPEG-PCL-P-L-Tyr三嵌段共聚物的制备：

取步骤(4)中得到的大分子引发剂MPEG-PCL-NH₂1.0014g与步骤(5)中的活性单体L-Tyr-NCA0.0251g以1：5的摩尔比例在20ml二氯甲烷及2mlDMF的混合液中在50℃、800～1000r﹒min^-1氮气保护条件下磁力搅拌反应12h；反应结束，按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法，得到MPEG-PCL-P-L-Tyr三嵌段共聚物。

实施例2

MPEG-PCL-P-L-Tyr0.0502g三嵌段共聚物0.0108g溶于二氯甲烷中，在40℃、1000r﹒min^-1条件下搅拌2h后；在40℃、200r﹒min^-1的条件下回收溶剂，制得到均一澄清并泛有微微蓝光的共聚物胶束。用粒径仪测其粒径，出现一个锐峰，平均粒径为31.44nm，PDI值为0.182。

实施例3

(1)健康的昆明种小鼠12只，雌雄各半，随机分为2组，FITC标记的胶束载药组和FITC溶液组。给药前动物禁食不禁水12h后，尾静脉注射给药，给药剂量为10mg/kg。

(2)精密称量制备的三嵌段共聚物20.0mg分散于10mL丙酮中，超声使其溶解形成有机相。再将14.5mg药物和3mg异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记物分散于有机相中，超声溶解。在40℃、1000r﹒min^-1条件下搅拌2h后；在40℃、200r﹒min^-1的条件下回收溶剂。

(3)实验前于小鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(0.1mL/20g)深度麻醉动物。待小鼠麻醉后，尾静脉注射给药。在小鼠肝脏部位做微创手术，将共聚焦显微镜探针置于肝脏下，各组在5min，15min,30min及1h实时拍照。

Claims (4)

1.一种可靶向药物的三嵌段共聚物胶束的制备方法，其特征在于合成步骤和条件如下：

(1)MPEG-PCL二嵌段共聚物的制备：

在氮气保护下的聚合反应器中用甲苯(100～150mL)作溶剂，搅拌下对MPEG共沸除水20～40分钟，冷却至室温，搅拌条件下(800～1000r﹒min^-1)加入10.00gMPEG与1.00～1.02mol﹒L^-1ε-己内酯，异辛酸亚锡为催化剂，130℃反应12～15h；反应结束后，将反应体系冷却至室温，减压除去剩余溶剂，用1～2倍二氯甲烷溶解聚合物，并用3～4倍乙醚分级沉淀出聚合物，滤过，25℃条件下真空干燥25～30h，得到MPEG-PCL二嵌段共聚物。

(2)MPEG-PCL磺酸酯的制备：

将步骤(1)得到的MPEG-PCL与相同摩尔质量的对甲苯磺酰氯在无水无氧、氮气保护下，以80～100ml二氯甲烷为溶剂，吡啶为催化剂，90℃、800～1000r﹒min^-1磁力搅拌条件下反应10～12h；反应结束，按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法，得到MPEG-PCL磺酸酯。

(3)MPEG-PCL邻苯二甲酰亚胺酯的制备：

将步骤(2)得到的MPEG-PCL磺酸酯与相同摩尔质量的邻苯二甲酰亚胺钾在无水无氧、氮气保护下，以60～80mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，70℃、800～1000r﹒min^-1磁力搅拌条件下反应10～12h；反应结束，按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法，得到MPEG-PCL邻苯二甲酰亚胺酯。

(4)大分子引发剂MPEG-PCL-NH₂的制备：

将步骤(3)得到的MPEG-PCL邻苯二甲酰亚胺酯与相同摩尔质量的水合肼，以乙醇为溶剂反应8～10h，反应温度为50℃，磁力搅拌速度为800～1000r﹒min^-1；按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法得到引发剂MPEG-PCL-NH₂。

(5)L-Tyr-NCA活性单体的制备：

将L-酪氨酸与3倍量的二-(三氯甲基)碳酸酯在无水无氧、氮气保护条件下以四氢呋喃(THF)为溶剂，50℃、800～1000r﹒min^-1磁力搅拌条件下反应20～30min，反应结束，将反应体系冷却至室温，减压除去剩余溶剂，用1～2倍石油醚-乙酸乙酯(1:2～1:3)混合液分级沉淀，冷却结晶，得L-Tyr-NCA。

(6)MPEG-PCL-P-L-Tyr三嵌段共聚物的制备：

将步骤(4)中得到的大分子引发剂MPEG-PCL-NH₂与步骤(5)中的活性单体L-Tyr-NCA(1：3～1：5)以二氯甲烷及DMF的混合液为溶剂，在50℃、800～1000r﹒min^-1氮气保护条件下磁力搅拌反应10～12h；反应结束，按步骤(1)的分级沉淀法与干燥方法，得到MPEG-PCL-P-L-Tyr三嵌段共聚物。

2.根据权利要求1中所述可靶向药物的两亲性三嵌段共聚物其特征在于分子结构中亲水性嵌段为MPEG；疏水的两个嵌段是可生物降解的聚己内酯与聚酪氨酸。

3.根据权利要求1中所述的一种靶向药物的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚L-酪氨酸两亲性三嵌段共聚物胶束的制备方法，其特征在于步骤(1)中所用己内酯种类为ε-己内酯。

4.根据权利要求1中所述的一种靶向药物的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚L-酪氨酸两亲性三嵌段共聚物胶束的制备方法，其特征在于步骤(5)中反应时间为20～30min。