CN105353112A - 基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法 - Google Patents

基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法 Download PDF

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张瑞
高志琪
苑惠敏
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焦炳欣
郭鸿雁
王芳
刘一君
郝莹
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Abstract

本发明涉及一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，其步骤：选取仪器；收集尿液样品；对尿液样本进行三组计数，获得六份标本计数；对每组尿液样本都不进行离心处理而直接进行检测；对每组尿液样本均采用经过校准的移液器填充一次性计数板的计数池；将每组尿液样本计数板的计数池充池后都静置3分钟，显微镜采用低倍镜镜头观察计数池中有形成分的全貌及分布；再采用高倍显微镜镜头，观察鉴定细胞成分和计算数量；上皮细胞EC的变异系数CV<14％；红细胞RBC、白细胞WBC的变异系数CV<7％；根据尿液红细胞、白细胞和上皮细胞计数的扩展不确定度，合成标准不确定度。本发明保证了检验结果的准确性和可靠性，进一步促进尿液检查结果能够互通互认。

Description

基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法
技术领域
本发明涉及一种尿液有形成分检验标准化方法，特别是关于一种用于校准和评价常规镜检类尿液有形成分分析仪的基于定量计数法原理的尿液有形成分(红细胞RBC、白细胞WBC和上皮细胞EC)候选参考测量方法。
背景技术
目前，尿液有形成分是指通过尿液排出体外能在光学显微镜下观察到的有形物，包括各种细胞、管型、结晶及各类病理成分分析,对泌尿系统疾病诊断、治疗、监测及健康普查等均有重要应用价值，是尿液分析中必不可少的检查手段。尿液有形成分检查方法较多，从方法学上可分为人工镜检法、尿沉渣分析仪检查法和干化学分析法。人工镜检法根据方法性质可分为定性检查法和定量检查法。尿沉渣分析仪法基于分析原理的不同主要分为流式细胞法、机器视觉图像识别法等。仪器法自动化程度高，适用于临床大批量样本检测。由于仪器种类、检测方法的不同，同一项目实验室间甚至实验室内的结果存在较大差异。自2000年以来，国际上开始推荐使用标准化的尿沉渣定量计数法。2003年国际实验血液学协会(ISLH)推荐尿液有形成分计数参考测量程序，2009年CLSI发布再版的尿沉渣分析指南(GP16-A3)，目的是提高尿液检验结果的质量和可靠性。2009年我国血液、体液专家委员会也提出《尿液有形成分检验标准化的建议》，但目前为止尚未建立尿液有形成分的参考方法，为满足尿液有形成分检验标准化的需要，如何实现尿液检查结果的互通互认成为目前亟待解决的技术问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，该方法实现了尿液有形成分检验的自动化和标准化，同时保证了检验结果的准确性和可靠性，进一步促进尿液检查结果能够互通互认。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，其特征在于包括以下步骤：1)选取显微镜、一次性尿液定量计数板和移液器；2)采用视觉原理尿有形成分分析仪配套试剂，并收集尿液样品；3)对尿液样本进行三组计数，每组计算均需获得三份白细胞WBC和三份上皮细胞EC共六份标本计数，要求三组之间的计数差异在95％可信区间内，若超出该可信区间则重新计数；4)对每组尿液样本都不进行离心处理而直接进行检测，并在检测前将原始尿颠倒充分混匀至少30次；5)对每组尿液样本均采用经过校准的移液器填充一次性尿液定量计数板的计数池，移液器每次取样本量7ul进行充池以避免液体过多溢出；当计数池未充完全、计数区域有气泡以及计数区域有碎片时则需重新填充新的计数池；6)将每组尿液样本计数板的计数池充池后都静置3分钟，显微镜采用低倍镜10×10镜头观察计数池中有形成分的全貌及分布；再采用10×40高倍显微镜镜头，观察鉴定细胞成分和计算数量，记录结果，结果以“个/ul”报告；7)采用低倍显微镜镜头时：对上皮细胞EC计数，每次至少计数10个/ul，最多不超过80个/ul,计数6次，根据计数结果计算每个样本的均值和标准差，并由均值和标准差得到变异系数，使上皮细胞EC的变异系数CV<14％；若计数为不合格数据，则剔除超出均值±2SD的数据，合格数据不少于15个；采用高倍显微镜镜头时：分别对红细胞RBC、白细胞WBC计数，每次至少计数40个/ul，最多不超过300个/ul，计数6次，根据计数结果计算每个样本的均值和标准差，并由均值和标准差得到变异系数，使红细胞RBC、白细胞WBC的变异系数CV<7％；若计数为不合格数据，则剔除超出均值±2SD的数据，合格数据不少于15个；8)取扩展因子k＝2，根据尿液红细胞RBC、白细胞WBC和上皮细胞EC计数的扩展不确定度，合成标准不确定度为：Uc2(y)＝(u1)2+(u2)2+…+(un)2，相对扩展不确定度：U95％＝2×Uc(y)。
较佳地，所述步骤1)中，所述一次性尿液定量计数板采用Uric-SCP尿液定量计数板，其每个计数池充池容积为6.4ul，计数区域容积为1ul。
较佳地，所述步骤2)中，尿液样品收集过程为：(1)采用洁净带盖的塑料尿管收集清洁中段尿液10ml；相对密度<1.010；渗透压<300mOsm/kg的稀释尿液标本和pH>7.5碱性的尿液标本除外；(2)将尿液标本冷藏保存，冷藏温度为2℃至4℃。
较佳地，所述步骤6)中，对每组尿液样本的计数，每个颗粒计数一次，不得重复计数，并在一小时内完成计数；其中，计数板上每个方格左侧和上侧压线的颗粒作为有效计数，右侧和下侧不计数。
较佳地，所述步骤7)中，优选得到上皮细胞EC的变异系数CV为12.7％，红细胞RBC、白细胞WBC的变异系数CV分别为6.6％和6.4％。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明中没有采用离心方法去除尿液样本中的上清液，避免了离心对尿液有形成分的影响，保证了检验结果的准确性和可靠性。2、本发明通过优化测量过程中的每一个环节，采用定量计数板法计数尿液有形成分WBC、RBC和EC，使本发明的不确定度低、精密度高、准确度好，可以有效促进尿液检查结果能够互通互认。3、本发明由于采用将尿液样本在计数板内的静置时间为3分钟，因此可以有效避免尿液样本干涸状态，确保计算的准确度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
本发明提供一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，其步骤如下：
1)选取测量仪器：AULYMPUSCX41显微镜、一次性尿液定量计数板和EppendorfReference移液器。其中，其中，本发明中一次性尿液定量计数板优选Uric-SCP尿液定量计数板，其每个计数池充池容积为6.4ul，计数区域容积为1ul。
2)采用视觉原理尿有形成分分析仪配套试剂，并收集尿液样品；其中，尿液样品收集过程为：
(1)采用洁净带盖的塑料尿管收集清洁中段尿液10ml；稀释(相对密度<1.010；渗透压<300mOsm/kg)和碱性(pH>7.5)的尿液标本除外，因为红、白细胞易于溶解。
(2)将尿液标本冷藏保存，冷藏温度为2～4℃，测量过程需要在1h内完成。
3)对尿液样本进行三组计数，每组计算均需获得三份白细胞WBC和三份上皮细胞EC共六份标本计数，要求三组之间的计数差异在95％可信区间内，若超出该可信区间则重新计数；
4)对每组尿液样本都不进行离心处理而直接进行检测，并在检测前将原始尿颠倒充分混匀至少30次；
5)对每组尿液样本均采用经过校准的移液器填充一次性尿液定量计数板的计数池，移液器每次取样本量7ul进行充池以避免液体过多溢出。当计数池未充完全、计数区域有气泡以及计数区域有碎片时则需重新填充新的计数池。
6)将每组尿液样本计数板的计数池充池后都静置3分钟，显微镜采用低倍镜10×10镜头观察计数池中有形成分的全貌及分布；再采用10×40高倍显微镜镜头，观察鉴定细胞成分(细胞、真菌、结晶等)和计算数量，记录结果，结果以“个/ul”报告；
其中，对每组尿液样本的计数，每个颗粒计数一次，不得重复计数，并在一小时内完成计数；其中，计数板上每个方格左侧和上侧压线的颗粒作为有效计数，右侧和下侧不计数。
7)采用低倍显微镜镜头时：对上皮细胞EC计数，每次至少计数10个/ul，最多不超过80个/ul,计数6次，根据计数结果计算每个样本的均值和标准差，并由均值和标准差得到变异系数，使上皮细胞EC的变异系数CV<14％。若计数为不合格数据，则剔除超出均值±2SD(SD为标准差)的数据，合格数据不少于15个。其中，CV＝SD/均值；优选得到上皮细胞EC的变异系数CV为12.7％；
采用高倍显微镜镜头时：分别对红细胞RBC、白细胞WBC计数，每次至少计数40个/ul，最多不超过300个/ul，计数6次，根据计数结果计算每个样本的均值和标准差，并由均值和标准差得到变异系数，使红细胞RBC、白细胞WBC的变异系数CV<7％。若计数为不合格数据，则剔除超出均值±2SD的数据，合格数据不少于15个；优选得到红细胞RBC、白细胞WBC的变异系数CV分别为6.6％和6.4％。
8)不确定度是由随机误差、计数的技术差异及计数的容量误差引起的，取扩展因子k＝2(95％置信区间)，根据尿液红细胞RBC、白细胞WBC和上皮细胞EC计数的扩展不确定度，合成标准不确定度为：Uc2(y)＝(u1)2+(u2)2+…+(un)2，相对扩展不确定度：U95％＝2×Uc(y)。
根据本发明的参考测量方法可以判断视觉原理尿有形成分分析仪的准确度，例如，将AVE766机器视觉原理尿有形成分分析仪对相同样本连续测量6次，根据测量结果计算每个样本的变异系数，判断该变异系数与参考测量方法中的变异系数之间的偏倚，偏倚在±5％范围内则该分析仪可正常工作，若偏倚超过±5％范围时，以参考测量方法的计数为准，分析仪需校准。
实施例：
三组计数中分别计数WBC和EC各3份样本，WBC和EC均值分别为217～285，51～85；SD分别为0.7～3.4，1～1；CV分别为0.3～1.1，1.9～1.9，结果如表1所示。
表1每组计数间的差异
朝阳医院、地坛医院、佑安医院、复兴医院、房山医院五家医院分别采用本发明的参考测量方法对尿液白细胞、红细胞和上皮细胞计数，分别计算五家医院定量计数板计数尿液有形成分的变异系数，结果如表2所示。
表2五家医院定量计数板计数尿液有形成分的变异系数
以朝阳医院为例，分别计算WBC、RBC和EC参考测量方法和视觉原理尿有形成分分析仪的均值、变异系数及两方法间的偏倚。结果如表3、表4所示。
表3朝阳医院WBC、RBC参考方法和仪器法的均值、精密度及两方法间的偏倚
表4朝阳医院EC参考方法和仪器法的均值、精密度及两方法间的偏倚
得到参考测量方法和仪器法对五家医院的综合精密度及两方法间的偏倚，结果如表5所示。
表5参考方法、仪器法精密度及两方法间的偏倚
计数的容量误差引起的不确定度为2％；每组计数的差异引起的不确定度为1.9％；尿液RBC、WBC和EC计数引起的总不确定度分别为7.0％、7.2％和13.0％，计算相对扩展不确定度分别为14.0％、14.4％和26％(95％置信区间)。
上述各实施例仅用于说明本发明，各部件的结构、尺寸、设置位置及形状都是可以有所变化的，在本发明技术方案的基础上，凡根据本发明原理对个别部件进行的改进和等同变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (6)

1.一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，其特征在于包括以下步骤：
1)选取显微镜、一次性尿液定量计数板和移液器；
2)采用视觉原理尿有形成分分析仪配套试剂，并收集尿液样品；
3)对尿液样本进行三组计数，每组计算均需获得三份白细胞WBC和三份上皮细胞EC共六份标本计数，要求三组之间的计数差异在95％可信区间内，若超出该可信区间则重新计数；
4)对每组尿液样本都不进行离心处理而直接进行检测，并在检测前将原始尿颠倒充分混匀至少30次；
5)对每组尿液样本均采用经过校准的移液器填充一次性尿液定量计数板的计数池，移液器每次取样本量7ul进行充池以避免液体过多溢出；当计数池未充完全、计数区域有气泡以及计数区域有碎片时则需重新填充新的计数池；
6)将每组尿液样本计数板的计数池充池后都静置3分钟，显微镜采用低倍镜10×10镜头观察计数池中有形成分的全貌及分布；再采用10×40高倍显微镜镜头，观察鉴定细胞成分和计算数量，记录结果，结果以“个/ul”报告；
7)采用低倍显微镜镜头时：对上皮细胞EC计数，每次至少计数10个/ul，最多不超过80个/ul,计数6次，根据计数结果计算每个样本的均值和标准差，并由均值和标准差得到变异系数，使上皮细胞EC的变异系数CV<14％；若计数为不合格数据，则剔除超出均值±2SD的数据，合格数据不少于15个；
采用高倍显微镜镜头时：分别对红细胞RBC、白细胞WBC计数，每次至少计数40个/ul，最多不超过300个/ul，计数6次，根据计数结果计算每个样本的均值和标准差，并由均值和标准差得到变异系数，使红细胞RBC、白细胞WBC的变异系数CV<7％；若计数为不合格数据，则剔除超出均值±2SD的数据，合格数据不少于15个；
8)取扩展因子k＝2，根据尿液红细胞RBC、白细胞WBC和上皮细胞EC计数的扩展不确定度，合成标准不确定度为：Uc2(y)＝(u1)2+(u2)2+…+(un)2，相对扩展不确定度：U95％＝2×Uc(y)。
2.如权利要求1所述的一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述一次性尿液定量计数板采用Uric-SCP尿液定量计数板，其每个计数池充池容积为6.4ul，计数区域容积为1ul。
3.如权利要求1所述的一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，其特征在于：所述步骤2)中，尿液样品收集过程为：
(1)采用洁净带盖的塑料尿管收集清洁中段尿液10ml；相对密度<1.010；渗透压<300mOsm/kg的稀释尿液标本和pH>7.5碱性的尿液标本除外；
(2)将尿液标本冷藏保存，冷藏温度为2℃至4℃。
4.如权利要求2所述的一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，其特征在于：所述步骤2)中，尿液样品收集过程为：
(1)采用洁净带盖的塑料尿管收集清洁中段尿液10ml；相对密度<1.010；渗透压<300mOsm/kg的稀释尿液标本和pH>7.5碱性的尿液标本除外；
(2)将尿液标本冷藏保存，冷藏温度为2℃至4℃。
5.如权利要求1至4任一项所述的一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，其特征在于：所述步骤6)中，对每组尿液样本的计数，每个颗粒计数一次，不得重复计数，并在一小时内完成计数；其中，计数板上每个方格左侧和上侧压线的颗粒作为有效计数，右侧和下侧不计数。
6.如权利要求1至4任一项所述的一种基于定量计数法原理的尿液有形成分候选参考测量方法，其特征在于：所述步骤7)中，优选得到上皮细胞EC的变异系数CV为12.7％，红细胞RBC、白细胞WBC的变异系数CV分别为6.6％和6.4％。
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