CN105349694B - 检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物、试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因检测领域，特别涉及检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物、试剂盒及其方法。一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物，由上游引物P1和下游引物P2组成，P1和P2的碱基序列如SEQ ID No.1和2所示。检测鲍曼不动杆菌耐药性的试剂盒，含有P1和P2。一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的方法，通过检测待测样本的ComM基因的完整性来判断待测样本是否具有多重耐药或者广泛耐药特性。本发明提供的上游引物P1和下游引物P2是根据鲍曼不动杆菌的ComM基因序列进行设计的，具有特异性强，敏感度高，重复性好等优点，然后基于ComM基因的完整性来判断待测样本是否具有多重耐药与广泛耐药特性。

Description

检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物、试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物、试剂盒及其方法。
背景技术
鲍曼不动杆菌具有强大的获得耐药性和克隆传播的能力，多重耐药、广泛耐药、全耐药鲍曼不动杆菌呈世界性流行。据2010年中国CHINET细菌耐药性监测网数据显示，我国10省市14家教学医院鲍曼不动杆菌占临床分离革兰阴性菌的16.11％，仅次于大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌，已成为我国院内感染的最重要病原菌之一。此外，鲍曼不动杆菌具有在体外长期存活能力，易造成克隆播散。故鲍曼不动杆菌尤其是耐药性鲍曼不动杆菌防控已成为保障医疗质量和医疗安全，保障广大患者的生命安全和健康权益所需要迫切解决的问题。
目前鲍曼不动杆菌耐药诊断的金标准是基于培养-药物敏感性测试的方法。简单的说，先将标本按照常规培养方法，在孵箱中进行18-24小时孵育，再将获得的纯菌落制成菌悬液，将菌悬液涂布在M-H培养基平板上，使用药敏纸片贴于细菌平板表面，再次放置在孵箱中进行24小时孵育，量取抑菌圈直径，根据美国临床实验室标准化协会表中进行判断；或者在获得菌悬液后，采用VITEK2COMPACT全自动微生物鉴定及药敏分析系统进行菌种鉴定于药敏结果读取，该步骤也需耗时约24小时。
因此，现有技术存在以下缺点：
方法一为细菌药敏判断金标准，耗时长，且对实验技术人员要求高，适合对鲍曼不动杆菌药敏的精细诊断；方法二对实验人员要求较低，但实验成本高。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物，该引物特异性强，敏感度高，重复性好。
本发明的第二目的在于提供一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的试剂盒，以便于检测鲍曼不动杆菌的耐药性。
本发明的第三目的在于提供一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的方法，快速便捷，敏感性好，特异性强，准确性高。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的引物，由上游引物P1和下游引物P2组成，所述上游引物P1的碱基序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物P2的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
鲍曼不动杆菌容易发生多重耐药或广泛耐药的重要原因在于这类细菌容易通过基因水平转移获得外源的耐药元件。鲍曼不动杆菌具有几乎全套的自然转化系统，鲍曼不动杆菌首先通过外膜蛋白识别外源DNA元件，在菌毛相关蛋白ComE、ComB、ComF和ComP的介导下，通过PilU和PilT的摆动作用将外源DNA转运入细胞周质中；胞膜受体蛋白ComEA与周质中外源DNA结合并将其传递给相应的核酸酶，核酸酶将双链DNA中的一条单链降解，剩余的另一条互补单链则在内膜蛋白PilO、ComM以及PilN的共同作用下，通过膜通道蛋白ComEC被转运到细胞内；进入胞内的单链DNA与DprA蛋白结合从而避免被胞内核酸酶降解，并在RecA蛋白作用下与染色体基因进行同源重组，完成整个自然转化过程。
经试验验证，ComM是否被插入直接决定鲍曼不动杆菌菌株是否具有天然感受态功能。并且，鲍曼不动杆菌是否具有天然感受能力，很大程度是由ComM是否完整所决定的。
经临床验证，鲍曼不动杆菌ComM若是被插入破坏，则鲍曼不动杆菌往往不具备天然感受态能力，在其进化过程中不容易获得外源耐药元件，进而不容易获得多重耐药或广泛耐药特性；若鲍曼不动杆菌ComM不被插入破坏，保持其完整性，该菌株往往具备完整的天然感受态能力，在其进化过程中容易获得外源耐药元件，容易获得多重耐药或者广泛耐药特性。
本发明提供的上游引物P1和下游引物P2是根据鲍曼不动杆菌的ComM基因序列进行设计的，以上游引物P1和下游引物P2作为引物，对ComM基因序列进行PCR扩增，具有特异性强，敏感度高，重复性好等优点，能快速检测鲍曼不动杆菌的耐药性。
本发明还提供了一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的试剂盒，含有上述的上游引物P1和下游引物P2。
优选地，所述试剂盒还含有Taq酶、dNTPs和PCR buffer。
本发明还提供了一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的方法，通过检测待测样本的ComM基因的完整性来判断待测样本是否具有多重耐药或者广泛耐药特性。
本发明提供的一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的方法，基于ComM基因的完整性来判断待测样本是否具有多重耐药与广泛耐药特性，ComM基因的碱基序列如SEQ ID No.3所示。若鲍曼不动杆菌ComM不完整，则鲍曼不动杆菌往往不具备多重耐药或者广泛耐药特性；若鲍曼不动杆菌ComM完整，则判定鲍曼不动杆菌为多重耐药或者广泛耐药菌株。
进一步地，检测待测样本的ComM基因的完整性通过分子水平进行检测。
分子水平的检测包括一些常用的目的片段的扩增或是DNA分子杂交等，通过分子水平来判断ComM基因的完整性。
PCR检测方便易行，快速便捷，检测特异性强，成本低，进一步地，所述分子水平检测为PCR检测。
进一步地，所述PCR检测所用的引物为上述的上游引物P1和下游引物P2。
以上游引物P1和下游引物P2作为引物对待测样本进行PCR检测，敏感性好，特异性强，准确性高。
进一步地，所述PCR检测所用的退火温度为52℃±1℃。以该退火温度进行PCR扩增，特异性好。
优选地，PCR扩增程序为：
94-95℃1-3min；
94-95℃10-20s，52℃±1℃10-15s,72℃30-40s，共25-40个循环；
72℃保持3-5min。
进一步地，所述PCR检测所用的PCR体系的体积为15-50μl。
如，PCR体系的体积为50μl，具体体系成分如下：
Figure BDA0000889493920000041
Figure BDA0000889493920000051
相应地，PCR体系的体积还可以为15μl、20μl、25μl、30μl等等，相应地，体系内的各成分相应的缩小即可。
进一步地，所述待测样本为鲍曼不动杆菌的基因组提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明是基于鲍曼不动杆菌ComM基因片段大小来检测鲍曼不动杆菌耐药性，用于快速评估特定鲍曼不动杆菌是否具有多重耐药与广泛耐药特征，有效解决实验时长与成品的问题，可以用于鲍曼不动杆菌耐药特性的快速评估。
(2)本发明还提供了测定ComM基因片段的引物，该引物特异性强，敏感度高，准确性高，重复性好。
(3)本发明还提供了检测鲍曼不动杆菌耐药性的试剂盒，以便于检测鲍曼不动杆菌的耐药性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中不同菌体的感受态细胞的摄入能力曲线图；
图2为本发明实施例2中不同菌体的感受态细胞的摄入能力曲线图；
图3为本发明实施例3中不同菌体的基因组DNA进行PCR扩增的电泳图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
ComM是否被插入直接决定鲍曼不动杆菌菌株是否具有天然感受态功能。
鲍曼不动杆菌实验室标准菌株不具备形成天然感受态能力。本实施例使用放射性同位素标记的DNA测试不同鲍曼不动杆菌菌株的DNA吸收能力，以评估其感受态形成能力。所用的不同鲍曼不动杆菌菌株为Acinetobacter baumannii ATCC 17978,Acinetobacterbaumannii AYE和Acinetobacter baumannii A118。不同鲍曼不动杆菌菌株的感受态细胞(10ml；1-3×109cells/ml)孵育30℃的矿质培养基中，该矿物培养基含有α-35S-dATP-radiolabeled DNA40ng/ml，每次取出0.5ml测样，检测细胞的放射性。结果如图1所示。
从图1可以看出，发现实验室标准菌株Acinetobacter baumannii ATCC 17978和Acinetobacter baumannii AYE标准菌株并不具备形成天然感受态的能力，而Acinetobacter baumannii A118菌株具备天然感受态形成能力，在实验周期内，CPM数值可以达1600单位/0.5ml cells。
三种鲍曼不动杆菌菌株存在基因组差异，鲍曼不动杆菌A118的ComM基因和ATCC17978以及AYE菌株存在显著的大小差异。进一步分析发现，只有A118菌株ComM基因是完整的，而ATCC17978以及AYE菌株该基因都被插入失活，这可能为后两者不具备天然感受态功能的重要原因。
实施例2
将包含完整ComM基因的重组质粒通过电转化的方法转入ATCC17978菌体内，获得ATCC17978-pET-comM重组菌株。以实施例1相同的方法，检测该重组菌株的放射性。结果如图2所示。
从图2可以看出，ATCC17978-pET-comM重组菌株明显的获得了天然感受态功能。
实施例3
临床检出鲍曼不动杆菌多为多重耐药(multiple drug resistant,MDR)或广泛耐药(extensive drug resistant,XDR)，多重耐药菌株指耐受3类抗生素，包括青霉素类与头孢类、氟喹诺酮类以及氨基糖苷类抗生素类；广泛耐药菌株则指除耐受以上3类抗生素的外，还对碳青霉烯类抗生素耐受。
首先，假设这部分多重耐药和广泛耐药的鲍曼不动杆菌是因为其具备完整得天然感受态能力，在后续的进化中获得外源耐药元件，发展为多重耐药或广泛耐药特征。根据鲍曼不动杆菌是否具有天然感受能力，很大程度是有ComM基因是否完整所决定的，本发明通过检测临床分离鲍曼不动杆菌ComM基因是否被插入破坏，来快速判断鲍曼不动杆菌是否具有多重耐药或者广泛耐药特性。
该实施例共选择了六株不同的菌株，具体为：Acinetobacter baumannii A118、Acinetobacter baumannii ATCC 17978、具有多重耐药性的鲍曼不动杆菌MDR1和MDR2、具有广泛耐药性的鲍曼不动杆菌XDR1和XDR2。
分别提取各菌株的基因组DNA，然后以以下PCR体系和PCR程序进行PCR扩增；
PCR体系的体积为50μl，具体体系成分如下：
Figure BDA0000889493920000081
PCR扩增程序为：
95℃1min；
95℃10s，52℃10s,72℃30s，共25个循环；
72℃保持3min。
将PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图3所示。
从图3可以看出，有Acinetobacter baumannii A118及MDR1,MDR2，XDR1,XDR2菌株都能扩增出略大约250bp的条带，Acinetobacter baumannii ATCC17978未见该条带。A118所具备的comM基因为未插入的完整形式，而ATCC17978在该区段有约6000bp的插入，故不能获得250bp的段片段。使用多重耐药菌株及广泛耐药菌株基因组作为模板，都能顺利获得该片段，这再次说明可以利用comM基因是否完整来快速判断受试菌株是否具有多重或广泛耐药特性。
另外，本发明共收集127株鲍曼不动杆菌多重及广泛耐药菌株(多重耐药菌株79，广泛耐药菌株48)以及74株不耐药或单耐药鲍曼不动杆菌。按照上述PCR体系和程序进行PCR扩增，如果获得条带大小为250bp左右，判断为ComM完整菌株，进而判断为具备多重耐药或者广泛耐药特性菌株；如果不出现条带或者出现条带明显大于250p，则判断为药物敏感性菌株。
按照诊断实验四格表计算方法敏感性，特异性以及准确性。四格表的标准诊断如表1所示。多重耐药分离菌株四格表检验数据如表2所示。
表1四格表的标准诊断
Figure BDA0000889493920000091
用标准诊断方法，诊断的病例数为a+c；在有病的受试者中，诊断性试验阳性者为a，阴性者为c。
用标准诊断方法，诊断无该病的例数为b+d；在无病的受试者中，诊断性试验阳性例数为b，阴性例数为d。
评价指标如下：
1)敏感度：经金标准确诊有病的人中，诊断性试验阳性者所占的比例，SEN＝a/(a+c)；
2)特异度：经金标准确诊为无病的人中，诊断性试验阴性者所占的比例，SPE＝d/(b+d)；
3)准确性：经诊断性试验检查后真阳性与真阴性占总例数的比例诊断性试验阴性者所占的比例，ACC＝(a+d)/(a+b+c+d)。
表2多重耐药分离菌株四格表检验数据
Figure BDA0000889493920000092
Figure BDA0000889493920000101
由表2可以得到，本发明提供的ComM基因PCR扩增法检测的敏感性＝71/(71+8)＝89.87％；特异性＝63/(11+63)＝85.14％；准确性＝(71+63)/(71+11+8+63)＝87.58％。
本发明提供的ComM基因PCR扩增法与鲍曼不动杆菌药敏实验金标准相比，ComM片段扩增法用于鲍曼不动杆菌临床菌株多重耐药的敏感性为89.87％，特异性为85.14％，准确性为87.58％
广泛耐药分离菌株四格表检验数据如表3所示。
表3广泛耐药分离菌株四格表检验数据
Figure BDA0000889493920000102
由表3可以得到，本发明提供的ComM基因PCR扩增法检测的敏感性＝45/(45+3)＝93.75％；特异性＝63/(11+63)＝85.14％；准确性＝(45+63)/(45+11+3+63)＝88.52％。
本发明提供的ComM基因PCR扩增法与鲍曼不动杆菌药敏实验金标准相比，ComM片段扩增法用于鲍曼不动杆菌临床菌株广泛耐药的敏感性为93.75％，特异性为85.14％，准确性为88.52％。
综上所述，使用基于PCR的方法获得鲍曼不动杆菌ComM基因片段大小，判断临床分离株基因组中ComM基因是未被插入，进而判断该分离株是否具有多重耐药或广泛耐药特性具有理论数据支持，且与鲍曼不动杆菌耐药判断金标准比较，这种方法能较准确的反应临床分离株的多重耐药和广泛耐药特性，显著节约实验时间，适用鲍曼不动杆菌耐药特性的快速判断。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Figure IDA0000889494000000011

Claims (4)

1.一种检测鲍曼不动杆菌耐药性的方法，其特征在于，通过检测待测样本的comM基因的完整性来判断待测样本的耐药性；检测待测样本的comM基因的完整性通过PCR检测；如果获得条带大小为250bp左右，判断为ComM完整菌株，进而判断为具备多重耐药或者广泛耐药特性菌株；如果不出现条带或者出现条带明显大于250p，则判断为药物敏感性菌株；
所扩增的comM基因的碱基序列如SEQ ID NO3所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR检测所用的退火温度为52℃±1℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR检测所用的PCR体系的体积为15-50μl。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本为鲍曼不动杆菌的基因组提取物。
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