CN105340732A - 一种小麦单倍体试管植株染色体加倍的方法 - Google Patents

一种小麦单倍体试管植株染色体加倍的方法 Download PDF

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林志珊
杜丽璞
刘畅
刘会云
王坤杨
范春捆
王婉晴
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Abstract

本发明公开了一种小麦单倍体试管植株染色体加倍的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：将秋水仙素或秋水仙素溶液添加在长有单倍体植株的培养基表面，处理，得到加倍的单倍体植株，实现单倍体植株染色体加倍。通过实验证明：本发明的方法不仅高效、简单、易行环保，对小麦单倍体植株的加倍效果具有普遍性，而且减少了秋水仙素的潜在污染，对于利用细胞工程途径改良小麦和小麦基因工程研究具有重要意义。

Description

一种小麦单倍体试管植株染色体加倍的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦单倍体试管植株染色体加倍的方法。
背景技术
小麦单倍体植株诱导和染色体加倍是培育小麦新品种，创建用于小麦遗传分析和基因定位DH群体的重要技术。小麦单倍体植株可以通过小麦与玉米杂交后染色体排除(Laurie等，1986，1988；陈新民等,1996)、花药培养(欧阳俊闻等,1973；朱志清等,2003)和小孢子培养(Touraev等,1996；Zheng等，2002)三种途径获得。其中，花药培养具有强烈的基因型依赖性，多数小麦品种或F1杂种的花药培养难以获得愈伤组织和再生植株；虽然小孢子培养对基因型的依赖性较小，但试验操作复杂，容易污染，周期较长；小麦与玉米杂交方式诱导单倍体植株几乎不受基因型的限制，操作容易，周期较短，但成胚率较低。在获得植株的倍性方面，小麦与玉米杂交后通过幼胚拯救获得单倍体植株几乎不能自然加倍，花药培养方式获得单倍体植株的自然加倍率20-30％(李志武等，1996)，小孢子培养方式获得单倍体植株的自然加倍率30-40％(Zheng等，2002)。为了确保纯合二倍体植株的获得并提高单倍体植株的加倍效率，需要利用秋水仙素对幼苗或愈伤组织进行染色体加倍。
目前为止，对小麦单倍体植株进行染色体加倍利用最多的方法是苗期分蘖节加倍，即将幼苗从培养基中取出，放入质量分数为0.02-0.1％的秋水仙素水溶液中，在通气泵介导的供氧条件下处理5-10小时，然后取出幼苗，流水冲洗3-4小时，最后移栽在花盆中。该方法的加倍率一般为50-60％，加倍植株生长发育正常(杨丽萍等，2011；赵爱菊等，2013；陈新民等，2013)。利用0.2％秋水仙素对小麦单倍体植株进行5小时浸根处理，加倍率也只有37.5％(杨丽萍等，2011)。但这2种方法操作比较繁琐，步骤较多，且秋水仙素对环境产生污染，也增加了人体接触秋水仙素的机率。因此，鉴于目前小麦单倍体加倍技术存在的一些缺点，需要建立一种简便、高效、安全的单倍体植株加倍方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种单倍体植株染色体加倍的方法。
本发明提供的单倍体植株染色体加倍的方法包括如下步骤：将秋水仙素或秋水仙素水溶液添加在长有单倍体植株的培养基表面，处理，得到加倍的单倍体植株，实现单倍体植株染色体加倍。
上述方法中，所述秋水仙素水溶液的质量分数为0.2-0.6％。
上述方法中，所述秋水仙素水溶液的质量分数为0.4％。
上述方法中，所述处理的时间为24h。
上述方法中，所述处理的温度为25℃。
上述方法中，所述单倍体植株为小麦单倍体植株；
所述小麦单倍体植株具体为小麦品种与玉米品种杂交得到的小麦单倍体植株。
上述方法中，所述小麦品种为科农199、新春9号或CB037，所述玉米品种为郑58。
上述方法中，所述培养基为1/2MS培养基；
所述1/2MS培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质在1/2MS培养基中的浓度为NH4NO3825mg/l、KNO3950mg/l、CaCl2·2H2O220mg/l、MgSO4·7H2O185mg/l、KH2PO4850mg/l、KI0.42mg/l、H3BO33.1mg/l、MnSO4·4H2O11.2mg/l、ZnSO4·7H2O4.3mg/l、Na2MoO4·2H2O0.13mg/l、CuSO4·5H2O0.013mg/l、CoCl2·6H2O0.013mg/l、FeSO4·7H2O13.9mg/l、Na2-EDTA·2H2O18.7mg/l、蔗糖20g/l、维生素B11mg/l、谷氨酰胺150mg/l、植物凝胶(Phytagel)2.4g/l。
本发明的另一个目的是提供上述方法的新用途。
本发明提供了上述方法在提高小麦单倍体植株染色体加倍率中的应用。
本发明还提供了上述方法在小麦育种中的应用。
本发明分别通过秋水仙素溶液在培养基表面添加、加注根部、涂抹叶片3种加倍方法对小麦单倍体试管苗进行加倍处理，试验结果表明：移栽前在单倍体试管苗培养基表面分别添加质量分数为0.2％、0.4％、0.6％秋水仙素溶液，小麦单倍体植株加倍率分别为76.9％、95.2％、84.6％，而对照不加倍处理的加倍率为0，表明培养基表面添加秋水仙素溶液方式对小麦单倍体植株的加倍效果非常明显(表3，图5，图6)，加倍率显著提高，明显高于目前应用的传统加倍方法。本发明的方法不仅高效、简单、易行、环保，对小麦单倍体植株的加倍效果具有普遍性，而且减少了秋水仙素的潜在污染，对于利用细胞工程途径改良小麦和小麦基因工程研究具有重要意义。
附图说明
图1为小麦品种科农199与玉米品种郑58杂交后幼胚拯救培养获得的幼苗。
图2为小麦品种科农199与玉米品种郑58杂交获得的小麦单倍体植株染色体构成。
图3为小麦品种新春9号与玉米品种郑58杂交后幼胚拯救培养获得的幼苗。
图4为小麦品种新春9号与玉米品种郑58杂交获得的小麦单倍体植株染色体构成。
图5为小麦品种CB037与玉米品种郑58杂交后幼胚拯救培养获得的幼苗。
图6为小麦单倍体植株经秋水仙素溶液培养基表面添加获得加倍植株的染色体构成。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的玉米新鲜花粉的定义：在玉米开花期间，上午8:00am抖落玉米雄穗上的旧花粉，9:00am收集玉米雄穗上的新鲜花粉。
下述实施例中的小麦遗传资源：科农199、新春9号和CB037均可从中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质资源库获得。
下述实施例中的玉米遗传资源：郑58可从中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质资源库获得。
下述实施例中的1/2MS培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质在1/2MS培养基中的浓度为NH4NO3825mg/l、KNO3950mg/l、CaCl2·2H2O220mg/l、MgSO4·7H2O185mg/l、KH2PO4850mg/l、KI0.42mg/l、H3BO33.1mg/l、MnSO4·4H2O11.2mg/l、ZnSO4·7H2O4.3mg/l、Na2MoO4·2H2O0.13mg/l、CuSO4·5H2O0.013mg/l、CoCl2·6H2O0.013mg/l、FeSO4·7H2O13.9mg/l、Na2-EDTA·2H2O18.7mg/l、蔗糖20g/l、维生素B11mg/l、谷氨酰胺150mg/l、植物凝胶(Phytagel)2.4g/l。1/2MS培养基的pH值为6.0，加热煮沸后分装在玻璃培养管中(直径3.5cm，高度12cm)，121℃、高压湿热条件灭菌15分钟。
下述实施例中的DA处理液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在DA处理液中的浓度为2,4-D100mg/L和AGP2g/L。DA处理液的具体配制方法为：先准确称取50mg2,4-D，加入200ml无水酒精，用微量移液器充分吸打溶解后加入到500ml蒸馏水中，然后准确称取1gAGP加入到上述500ml溶液中。
下述实施例中的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)是Sigma公司产品，货号为D7299。
下述实施例中的AGP(Arabinogalactanproteins，阿拉伯半乳聚糖蛋白)是Sigma公司产品，货号为G9752。
下述实施例中的秋水仙素为Sigma公司产品，货号为C9754。
下述实施例中的质量分数为0.2％的秋水仙素溶液是将200mg的秋水仙素与100ml的蒸馏水混匀得到的。
下述实施例中的质量分数为0.4％的秋水仙素溶液是将200mg的秋水仙素与50ml的蒸馏水混匀得到的。
下述实施例中的质量分数为0.6％的秋水仙素溶液是将200mg的秋水仙素与33.3ml的蒸馏水混匀得到的。
实施例1、秋水仙素对小麦单倍体植株的加倍效果方式的摸索
一、秋水仙素根部加注对小麦单倍体植株的加倍效果试验
以小麦品种科农199与玉米品种郑58杂交诱导的小麦单倍体幼苗为试验对象，小麦与玉米杂交幼胚拯救培养和小麦单倍体植株加倍处理步骤如下：
(一)小麦单倍体植株的获得
1、小麦与玉米杂交
将小麦品种科农199种植在中国农业科学院作物科学研究所试验农场(2013年9月)，越冬前覆盖塑料布(2013年12月)，返青期揭开塑料布(2014年3月)；将玉米品种郑58种植在中国农业科学院作物科学研究所温室(2014年2月，分期播种)；小麦品种科农199抽穗时及时人工去雄、套袋(2014年4月)，共去雄40穗；3天后收集玉米品种郑58的新鲜花粉授以去雄后的科农199；先后于授粉后24小时和48小时用DA处理液喷洒杂交穗各1次；授粉后16-17天取样杂交穗(40个麦穗)。
2、小麦与玉米杂交幼嫩籽粒灭菌和小麦单倍体植株获得
从小麦品种科农199与玉米品种郑58杂交后的40个麦穗上收集了506个幼嫩籽粒，70％酒精表面消毒1分钟，15％次氯酸钠灭菌20分钟，无菌水冲洗5次；在解剖镜下取出小麦与玉米杂交幼胚，将小麦与玉米杂交幼胚进行拯救培养：胚轴端向上接种至1/2MS培养基上，每个培养管接种3-4个杂交幼胚，共接种杂交幼胚43个；先在黑暗、25℃条件下培养3天，然后在光照、25℃条件下培养20天，最终获得了31株试管单倍体植株(图1)。
(二)小麦单倍体植株染色体加倍
1、小麦单倍体植株染色体检查
移栽前取获得的31株小麦单倍体试管苗1-2cm长度的根尖，冰水处理24小时，然后浸泡在酒精与乙酸溶液(酒精与乙酸的体积比为3:1)中固定24小时后放入95％酒精中保存。经固定的根尖用1NHCl在60℃下水解14分钟，然后用醋酸洋红进行染色，在显微镜下观察单倍体植株染色体。检查结果表明，获得的31株试管苗染色体数均为21条(图2)，全部为单倍体植株。
2、小麦单倍体植株移栽
取样根尖后的小麦单倍体试管苗移栽到盛有草炭土(大汉园艺产品，货号为：KLASMAN422)的花盆中(花盆直径25cm，高度20cm；每个花盆中均匀掺入20g奥绿缓释肥)，每个花盆移栽3-4株，浇250ml自来水，每株苗用良好透光的一次性塑料水杯罩住，放入5-8℃、光照条件的植物生长室中缓苗、春化(移栽10天后移去水杯)，30天后将花盆移至25℃、光照条件的植物生长室中生长，每3天浇250ml自来水。
3、小麦单倍体植株秋水仙素处理
移栽后的单倍体植株在25℃生长室中生长7天左右时，用微量移液器在每株植株的根部加注2ml不同质量分数(0.2％、0.4％和0.6％)的秋水仙素溶液，每个质量分数水平处理7-8株；24小时后浇250ml自来水，以后每3天浇250ml自来水；生长期间注意防治蚜虫和白粉病。成熟期调查结实性，判别染色体加倍效果。以质量分数为0％的秋水仙素溶液为对照。
(三)不同质量分数秋水仙素溶液的加倍效果比较
结果表明，不同质量分数的秋水仙素溶液处理的小麦单倍体植株都没有结实(表1)，与对照(不加倍处理)的结果相同，说明秋水仙素溶液加注根部对小麦单倍体植株不具有加倍效果。
表1、不同质量分数秋水仙素溶液根部加注后小麦单倍体植株的加倍效果
二、秋水仙素涂抹叶片对小麦单倍体植株的加倍效果试验
以小麦品种新春9号与玉米品种郑58杂交诱导的小麦单倍体幼苗为试验对象，小麦与玉米杂交幼胚拯救培养和小麦单倍体植株加倍处理步骤如下：
(一)小麦单倍体植株的获得
1、小麦与玉米杂交
将小麦品种新春9号和玉米品种郑58种植在中国农业科学院作物科学研究所温室(2014年11月，分期播种)；小麦品种新春9号抽穗时及时人工去雄、套袋(2015年2月)，共去雄56穗；3天后收集玉米品种郑58的新鲜花粉授以去雄后的新春9号；先后于授粉后24小时和48小时用DA处理液喷洒杂交穗各1次；授粉后18-19天取样杂交穗。
2、小麦与玉米杂交幼嫩籽粒灭菌和小麦单倍体植株获得
从小麦新春9号与玉米郑58杂交后的56个麦穗上收集了620个幼嫩籽粒，70％酒精表面消毒1分钟，15％次氯酸钠灭菌20分钟，无菌水冲洗5次；在解剖镜下取出小麦与玉米杂交幼胚，将小麦与玉米杂交幼胚进行拯救培养：胚轴端向上接种至1/2MS培养基上，每个培养管接种3-4个杂交胚，共接种杂交幼胚62个；先在黑暗、25℃条件下培养3天，然后在光照、25℃条件下培养20天，最终获得了49株试管单倍体植株(图3)。
(二)小麦单倍体植株染色体加倍
1、小麦单倍体植株染色体检查
移栽前取49株小麦单倍体试管苗1-2cm长度的根尖，冰水处理24小时，然后浸泡在酒精与乙酸溶液(酒精与乙酸的体积比为3:1)中固定24小时后放入95％酒精中保存。经固定的根尖用1NHCl在60℃下水解14分钟，然后用醋酸洋红进行染色，在显微镜下观察单倍体植株染色体。检查结果表明，获得的49株试管苗染色体数均为21条(图4)，全部为单倍体植株。
2、小麦单倍体植株移栽
取样根尖后的小麦单倍体试管苗移栽到中国农业科学院作物科学研究所温室(2015年3月)，用透光性能良好的塑料布覆盖，移栽7天后揭开塑料布，根据土壤水分情况及时浇水。温室温度为22-25℃。
3、小麦单倍体植株秋水仙素处理
小麦单倍体植株在温室中生长至拔节期，用棉签蘸取不同质量分数(0.2％，0.4％和0.6％)的秋水仙素溶液，反复涂抹新生叶片中部，每个秋水仙素质量分数水平处理12-13株。生长期间注意防治蚜虫和白粉病。成熟期调查结实性，判别单倍体植株染色体加倍效果。以质量分数为0％的秋水仙素溶液为对照。
(三)不同质量分数秋水仙素溶液的加倍效果比较
结果表明，不同质量分数的秋水仙素溶液涂抹处理小麦单倍体植株叶片后，质量分数为0.4％的秋水仙素溶液处理的13株小麦单倍体植株中只有1株结实(表2)，加倍率仅为7.69％；质量分数为0.2％、0.6％秋水仙素溶液处理和对照(不加倍处理)植株中，都没有发现结实植株，加倍率为0(表2)；表明秋水仙素溶液涂抹小麦单倍体植株叶片虽有加倍效果，但加倍效果很差。
表2、不同质量分数秋水仙素溶液涂抹小麦单倍体植株的加倍效果
三、秋水仙素培养基表面对小麦单倍体植株的加倍效果试验
以小麦品种CB037与玉米品种郑58杂交诱导的小麦单倍体幼苗为试验对象，小麦与玉米杂交幼胚拯救培养和小麦单倍体植株加倍处理步骤如下：
(一)小麦单倍体植株的获得
1、小麦与玉米杂交
将小麦品种CB037种植在中国农业科学院作物科学研究所试验农场(2015年1月)，播种后覆盖塑料布，出苗后揭去塑料(2015年3月)；将玉米品种郑58种植在中国农业科学院作物科学研究所温室(2015年2月，分期播种)；小麦品种CB037抽穗时及时人工去雄、套袋(2015年5月)，共去雄80穗；3天后收集玉米品种郑58的新鲜花粉授以去雄后的CB037；先后于授粉后24小时和48小时用DA处理液(2,4-D100mg/L和AGP2g/L)喷洒杂交穗各1次；授粉后16-17天取样杂交穗。
2、小麦与玉米杂交幼嫩籽粒灭菌和小麦单倍体植株获得
从小麦品种CB037与玉米品种郑58杂交后的80个麦穗上收集了735个幼嫩籽粒，70％酒精表面消毒1分钟，15％次氯酸钠灭菌20分钟，无菌水冲洗5次；在解剖镜下取出小麦与玉米杂交幼胚，将小麦与玉米杂交幼胚进行拯救培养：胚轴端向上接种至1/2MS培养基(固体)上，每个培养管接种3-4个杂交胚，共接种杂交幼胚49个；先在黑暗、25℃条件下培养3天，然后在光照、25℃条件下培养20天，最终获得了57株试管苗植株(图5)。
(二)小麦单倍体植株染色体加倍
1、小麦单倍体植株秋水仙素处理
小麦品种CB037与玉米品种郑58杂交后获得的57株试管植株生长健壮后，用微量移液器向每个试管中的培养基表面加入2ml不同质量分数(0.2％，0.4％和0.6％)的秋水仙素溶液，每个质量分数水平处理10-21株，处理温度为25℃；处理24小时后移栽。以质量分数为0％的秋水仙素溶液为对照。
2、小麦单倍体植株移栽
将秋水仙素溶液处理的试管苗移栽到盛有草炭土(大汉园艺产品，货号为：KLASMAN422)的花盆中(花盆直径25cm，高度20cm；每个花盆中均匀掺入20g奥绿缓释肥)，每个花盆移栽3-4株，移栽后浇250ml自来水，每株苗用良好透光的一次性塑料水杯罩住，放入5-8℃、光照条件的植物生长室中缓苗(移栽10天后移去水杯)，15天后将花盆移至25℃、光照条件的植物生长室中生长，每3天浇250ml自来水；生长期间注意防治蚜虫和白粉病。成熟期调查结实性，判别染色体加倍效果。
(三)不同质量分数秋水仙素溶液的加倍效果比较
结果如表3所示，对照(不加倍处理)的10株小麦植株都没有结实，加倍率为0；培养基表面添加质量分数为0.2％的秋水仙素溶液对13株小麦单倍体植株进行加倍，其中10株结实，加倍率为76.9％；培养基表面添加质量分数为0.4％的秋水仙素溶液对21株小麦单倍体植株进行加倍，其中20株结实，加倍率为95.2％；培养基表面添加质量分数为0.6％的秋水仙素溶液对13株小麦单倍体植株进行加倍，其中11株结实，加倍率为84.6％(表3)。对结实籽粒根尖细胞染色体进行观察，结果如图6所示，成功加倍植株的染色体数目均为42条。
表3、不同质量分数的秋水仙素溶液培养基表面添加后小麦单倍体植株的加倍效果
上述结果表明：培养基表面添加秋水仙素溶液方式对小麦单倍体植株的加倍效果明显，添加质量分数为0.2-0.6％秋水仙素溶液小麦单倍体植株的加倍效率达76.9-95.2％，以质量分数为0.4％秋水仙素溶液的加倍效果为最好，与对照(不加倍处理)差异显著。
综上所述，移栽前在单倍体试管苗培养基表面添加0.2-0.6％秋水仙素溶液方式对小麦单倍体植株的加倍效果非常明显，加倍率显著提高，明显高于目前应用的传统加倍方法。

Claims (10)

1.一种单倍体植株染色体加倍的方法，包括如下步骤：将秋水仙素或秋水仙素水溶液添加在长有单倍体植株的培养基表面，处理，得到加倍的单倍体植株，实现单倍体植株染色体加倍。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述秋水仙素水溶液的质量分数为0.2-0.6％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述秋水仙素水溶液的质量分数为0.4％。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述处理的时间为24h。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述处理的温度为25℃。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述单倍体植株为小麦单倍体植株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述小麦单倍体植株为小麦品种与玉米品种杂交得到的小麦单倍体植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述小麦品种为科农199、新春9号或CB037，所述玉米品种为郑58。
9.权利要求1-8中任一所述的方法在提高小麦单倍体植株染色体加倍率中的应用。
10.权利要求1-8中任一所述的方法在小麦育种中的应用。
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CN106717843A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 襄阳市农业科学院 一种小麦单倍体胚生试管苗的培养方法
CN115176702A (zh) * 2022-08-26 2022-10-14 河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所 一种不用药剂处理的小麦单倍体植株染色体加倍方法及应用

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