CN105338831A - 产生具有最佳化感官质量的微藻生物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于调节小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻(Chlorella？protothecoides)的生物质的方法，该生物质是通过在异养条件下且在不存在光下发酵产生且用于制备具有最佳化感官特征的粉，该方法的特征在于它包括以下步骤：在发酵结束时立即收集该生物质，且在调节之前将其存储小于8小时；将由此回收且存储的生物质在低于70℃的温度下HTST处理30秒到1分30秒；且使用至多3体积水/体积生物质洗涤该生物质。

Description

产生具有最佳化感官质量的微藻生物质的方法
本发明涉及用于产生小球藻(Chlorella)属的微藻生物质的新颖方法，该生物质使得可制备具有最佳化感官特征的粉。因此，本发明允许将此微藻粉掺入食品调配物中且并不生成不合意气味。
背景技术
历史上，仅需要“水和日光”生长的藻类在长期以来被视为食物来源。
存在若干可用于食品中的藻类物种，大部分为“大型藻类”，例如海带、海白菜(石莼(Ulvalactuca))和紫菜属(Porphyra)(培养于日本)或“红皮藻(dulse)”(帕尔玛利亚掌叶(Palmariapalmata))型红藻。
然而，除这些大型藻类外，还存在其他由“微藻”代表的藻类来源，也就是海洋或非海洋起源的光合作用或非光合作用单细胞微型藻类，其经培养应用于生物燃料或食品中。
举例来说，在开放的泻湖中(在光养条件下)培养螺旋藻(钝顶螺旋藻(Arthrospiraplatensis))以用作食品补充剂或以少量掺入糖果产品或饮料中(通常小于0.5％重量/重量)。
其他富含脂质的微藻(包含某些小球藻物种)在亚洲国家作为食品补充剂也很受欢迎(提及产生ω-3-脂肪酸的隐甲藻(Crypthecodinium)或裂壶藻(Schizochytrium)属的微藻)。
小球藻型微藻粉的产生和用途例如描述于文件WO2010/120923和WO2010/045368中。
微藻粉的油部分可基本上由单不饱和油构成，与常见于常规食物产品中的饱和、氢化和多不饱和油相比，可提供营养及健康优势。
在期望以工业方式从所述微藻的生物质产生微藻粉粉末时，不仅从技术角度看，并且从所产生粉的感官特征看，仍存在相当大的困难。
实际上，尽管例如使用以光合作用方式培养于室外池塘中或通过光生物反应器产生的藻类粉末是可商购的，但其具有深绿色(与叶绿素有关)和强烈的难闻味道。
即使调配于食物产品中或作为营养补充剂，这些藻类粉末也总是赋予食物产品或营养补充剂这种在视觉上无吸引力的绿色且具有难闻腥味或海洋藻类的气味。
另外，已知某些蓝藻物种天然地产生气味性化学分子(例如土臭素(反式-1,10-二甲基-反式-9-萘烷醇)或MIB(2-甲基异龙脑))，从而产生泥土或发霉味道。
至于小球藻，本领域中通常所接受的描述语为“绿茶”味道，其略微类似于其他绿色植物粉末(例如粉末状绿色大麦或粉末状绿色小麦)，该味道是源于其高叶绿素含量。
它们的气味通常仅在它们与具有强烈气味的植物或柑橘类果汁混合时才被遮蔽。
因此，仍存在对于制备具有适宜感观质量的小球藻属的微藻生物质的方法的未满足需要，该方法允许将从所述微藻制得的粉用于更多和更多样化食物产品中。另外，仍本着工业最佳化的精神，可重现地提供具有可重现感观质量的小球藻属微藻的方法将极为有利。
发明内容
为设计本发明方法，申请公司首先选择形成感官小组以评估各种批次的原壳小球藻生物质粉的感官性质。然后，生产批次的感官描述允许鉴别将允许按照预期且可重现地产生具有感观质量的微藻生物质粉的方法的关键步骤。
在通过在异养条件下且在不存在光下进行发酵来产生微藻生物质时，如下文所例示，申请公司由此改变各种生物质发酵和处理参数以生成这些不同批次。申请公司最后成功证实由感官小组赋予所产生每一批次的感官调与用于实施产生所述批次的方法的一些条件之间的关联。
此关联然后使得申请公司能够选择用于实施生物质发酵和处理的参数，所述参数单独或组合确保产生具有最佳化感官特征的小球藻生物质。
申请公司然后提出用于调节小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻的生物质的产生方法，该生物质用于制备具有最佳化感官特征的粉。
本发明因此涉及用于调节小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻的生物质的方法，该生物质是在异养条件下且在不存在光下产生且用于制备具有最佳化感官特征的粉，该调节方法的特征在于它包括以下步骤：
-在发酵结束时立即收集生物质，且在其调节之前存储小于8小时，
-将由此回收且存储的生物质在低于70℃的温度下高温/短时(HTST)热处理30秒到1分30秒，并且
-使用至多3体积水/体积生物质洗涤生物质。
优选地，该生物质在调节和研磨之前的存储时间小于3小时，优选地小于1小时。
优选地，在介于60℃与68℃之间，优选地65℃±2℃、特定地65℃的温度下实施HTST热处理1分钟。
优选地，使用1体积水/体积生物质洗涤生物质。
在一优选实施例中，在洗涤生物质的步骤之前实施HTST处理。
在一优选实施例中，通过在介于6.5与7之间，优选地6.8的初始pH下发酵小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻来获得经调节生物质，且其中将发酵pH调控于介于6.5与7之间的值，优选地调控于值6.8。
本发明还涉及用于产生小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻的生物质的方法，该生物质用于制备具有最佳化感官特征的粉，该方法包括：
-通过在异养条件下且在不存在光下使该小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻发酵来产生生物质，该发酵的初始pH和发酵期间的pH调控固定于介于6.5与7之间的值，优选地于值6.8；并且
-借助如本文件中所描述的方法调节该生物质。
最后，本发明还涉及用于制备具有最佳化感官特征的小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻的粉的方法，该方法包括：
-借助如本文件中所描述的方法调节该生物质；
-研磨该经调节的生物质；并且
-干燥经研磨的生物质。
任选地，该方法还包括在调节之前通过在异养条件下且在不存在光下使小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻发酵来产生生物质，发酵初始pH和发酵期间的pH调控固定于介于6.5与7之间的值，优选地固定于值6.8。
具体实施方式
出于本发明目的，在通过感官小组在食品调配物或品尝调配物(例如，如本文所描述的冰激凌或品尝食谱)中评估断定不存在损害含有此微藻粉的所述食品调配物的感观质量的异味时，微藻粉具有“最佳化感官特征”。
这些异味可与不合意特定气味性和/或芳香分子的存在有关，这些分子的特征在于具有对应于产生感觉所需的感官刺激最小值的感知阈值。
因此，“最佳化感官特征”由感官小组通过在4种感官准则(外观、质地、气味和风味)的量表评估中获得最佳评分来反映。
出于本发明目的，术语“微藻粉”应以其最广泛解释来理解且理解为表示(例如)包括多个微藻生物质颗粒的组合物。微藻生物质是源自微藻细胞，其可为全细胞或裂解细胞或全细胞和裂解细胞的混合物。
一定数量的现有技术文件(例如国际专利申请案WO2010/120923)描述产生和在食品中使用小球藻微藻生物质的方法。
本发明中所讨论的微藻为小球藻属、更特定地原壳小球藻、甚至更特定地通过所属领域技术人员已知的任一方法失去叶绿素色素(由于在黑暗中于所属领域技术人员熟知的某些操作条件下实施培养，或由于菌株发生突变而不再产生这些色素)的小球藻的微藻。
此专利申请案WO2010/120923中所描述的发酵方法由此使得，如果用于所产生生物质的发酵和处理的条件有所变化，则产生一定数量的具有可变感官质量的微藻粉。
申请公司由此选择改变下列参数且分析其影响：
-发酵培养基的初始pH，
-发酵期间的pH，
-收获发酵汁期间的酸化，
-生物质的热处理(称为HTST的热处理)
-生物质的洗涤，
-生物质的研磨，
-pH的调节，
-巴氏消毒(pasteurization)
-干燥，和
-由此所获得粉的存储。
如下文所例示，用于调节生物质以最佳化微藻粉的感官特征的方法的关键步骤如下：
-在发酵结束时立即收集生物质，且在其条件(在其研磨之前)之前存储小于8小时，
-在低于70℃的温度下HTST处理由此回收且存储的生物质且实施30秒到1分30秒，
-使用至多3体积水/体积生物质洗涤经HTST处理的生物质。
因此，尽可能快速地收集生物质以进行后续热处理和/或洗涤步骤。经测定，存储必须尽可能短。优选地，存储持续小于8、7、6、5、4、3、2或1小时。优选地，在调节和研磨生物质之前的存储时间小于3小时，优选地小于1小时。理想地，不存在存储步骤并且对所收集生物质直接实施后续热处理和/或洗涤步骤。
还确定，HTST热处理也对感官特征具有影响且由此对微藻粉的感观质量具有影响。因此，温度优选地低于或等于70℃且高于50℃。其可介于55℃与70℃之间，优选地介于60℃与68℃之间，优选地65℃。处理时间优选地为1分钟。
还展示，可最佳化洗涤，同时改良感官特征且由此改良微藻粉的感观质量。因此，优选地，使用3、2.5、2、1.5或1体积水/1体积生物质洗涤生物质。在一实施例中，一体积水将用于一体积生物质。
最后，其展示调节步骤的顺序对感官特征具有影响且由此对微藻粉的感观质量具有影响。特定地，优选在洗涤生物质的步骤之前实施HTST热处理。
经调节微藻生物质是通过在异养条件下且在不存在光下使小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻发酵来制得的生物质。
任选地，所用微藻可非排他性地选自原壳小球藻、凯氏小球藻(Chlorellakessleri)、微小小球藻(Chlorellaminutissima)、小球藻属、耐热性小球藻(Chlorellasorokiniama)、黄绿异小球藻(Chlorellaluteoviridis)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、瑞氏小球藻(Chlorellareisiglii)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、嗜糖小球藻(Chlorellasaccharophila)、凯氏拟小球藻(Parachlorellakessleri)、拜氏拟小球藻(Parachlorellabeijerinckii)、大型无绿藻(Protothecastagnora)和桑椹型无绿藻(Protothecamoriformis)。
优选地，本发明所使用的微藻属于原壳小球藻物种。根据此优选模式，打算用于产生微藻粉的藻类具有GRAS状态。在1958年由美国食品药品管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)创造的GRAS(公认安全(GenerallyRecognizedAsSafe))概念使得可管理添加到食品中且专家组认为无害的物质或提取物。
所属领域技术人员已熟知发酵条件。待使用的适当培养条件特定地描述于石川-伊久留市比良(IkuroShihira-Ishikawa)和长谷瑛二(EijiHase)的以下文章中：“特定地涉及由葡萄糖诱导的叶绿体变性的原壳小球藻中的细胞色素沉着的营养控制(NutritionalControlofCellPigmentationinChlorellaprotothecoideswithspecialreferencetothedegenerationofchloroplastinducedbyglucose)”，植物和细胞生理学(PlantandCellPhysiology)，5,1964。
此文章特定地描述，可通过改变氮和碳的来源和比率由原壳小球藻产生所有颜色等级(无色、黄色、黄绿色和绿色)。特定地，使用富葡萄糖且缺氮的培养基获得“褪色(washed-out)”且“无色”的细胞。
在本文中加以区分无色细胞与黄色细胞。另外，在过量葡萄糖和有限氮中培养的褪色细胞具有高生长速率。另外，这些细胞含有较高量的脂质。
其他文章(例如徐涵(HanXu)、苗晓玲(XiaolingMiao)、吴庆宇(QingyuWu)的文章：“通过在发酵器中的异养生长从微藻原壳小球藻的高质量生物柴油生产(HighqualitybiodieselproductionfromamicroalgaChlorellaprotothecoidesbyheterotrophicgrowthinfermenters)”，生物技术期刊(JournalofBiotechnology)，126,(2006),499-507)指示，异养培养条件(也就是在不存在光下)使得可获得在微藻细胞中具有高脂质含量的增加的生物质。
固体和液体生长培养基通常可在文献中获得，并且用于制备适用于各种微生物菌株的特定培养基的建议可在线参见(例如)www.utex.org/(由德克萨斯大学奥斯汀分校的藻类培养保藏中心(UniversityofTexasatAustinforitsalgalculturecollection，UTEX)维护的网站)。
根据一般知识和上述现有技术，负责培养微藻细胞的所属领域技术人员将完全能够调整培养条件以获得优选地富含脂质的适宜生物质。
特定地，可基于大致完全描述于专利申请案WO2010/120923中者来定义发酵方案。
根据本发明，在液体培养基中培养微藻以产生所述生物质。
在发酵器(或生物反应器)中产生生物质。生物反应器、培养条件和异养生长和繁殖方法的具体实例可以任一适当方式加以组合以改良微生物生长和脂质和/或蛋白质产生的效率。
在一特定实施例中，以进料-分批模式使用经调整以维持3g/l到10g/l的残余葡萄糖浓度的葡萄糖流速来实施发酵。
在葡萄糖进料期期间，优选地限制培养基中的氮含量以使得脂质累积量为30％、40％、50％或60％。将发酵温度维持于优选地介于25℃与35℃之间、特定地28℃的适宜温度。通过控制发酵器的曝气、反压和搅拌来将所溶解氧优选地维持于最低30％。
在一优选实施例中，展示发酵期间的pH对最终产品的感观质量具有影响。因此，将发酵的初始pH固定于介于6.5与7之间，优选地于6.8的值，且然后在发酵期间调控于介于6.5与7之间的值，优选地调控于6.8的值。生产发酵时间为3到6天，例如4到5天。
优选地，所获得生物质具有介于130g/l与250g/l之间的浓度，其中脂质含量大约为50干重％，纤维含量为10干重％到50干重％，蛋白质含量为2干重％到15干重％，并且糖含量小于10重量％。
接下来，从发酵培养基收获在发酵结束时获得的生物质且经历如上文所描述的调节方法。
在调节之后，将生物质转化成微藻粉。用于制备微藻粉的主要步骤尤其包括研磨、均质化和干燥。
微藻粉可从以机械方式裂解且均质化(均质物然后经受喷雾干燥或闪蒸干燥)的浓缩微藻生物质制得。
优选地裂解用于产生微藻粉的生物质细胞以释放其油或脂质。使用(例如)均质器将细胞壁和细胞内组分研磨或减小成非团聚细胞颗粒或碎片。优选地，所得颗粒具有小于500μm、100μm或甚至10μm或更小的平均大小。
还可干燥经裂解细胞。举例来说，可使用压力破碎机将含有细胞的悬浮液抽吸穿过限流孔口以裂解细胞。施加高压(高达1500巴)，随后穿过喷嘴瞬间膨胀。细胞可通过以下三种不同机制破裂：流经阀门、液体在孔口中的高剪切和在出口处压力的突然降低，其皆导致细胞发生爆破。可使用尼罗(Niro)均质器(基伊埃尼鲁索尔维(GEANiroSoavi))(或任一其他高压均质器)破裂细胞。在高压(大约1500巴)下以此方式处理藻类生物质通常会裂解高于90％的细胞且将颗粒大小减小到小于5μ。优选地，所施加压力为900巴到1200巴、特定地1100巴。
此外且为增加裂解细胞的百分比，微藻生物质可经受高压双重处理或甚至更多(三重处理等)。优选地，使用双重均质化以将裂解细胞的百分比增加到大于50％、大于75％或大于90％。借助此双重处理观察到大约95％的裂解细胞百分比。
在期望富含脂质(特定地大于10％)的粉时，微藻细胞的裂解是任选但优选的。因此，微藻粉可任选地呈非裂解细胞形式。
优选地，期望至少部分的裂解，也就是，微藻粉是呈部分地裂解细胞形式且含有25％到75％裂解细胞。优选地，期望最大或甚至完全裂解，也就是微藻粉是呈强烈地或甚至完全裂解细胞的形式且含有85％或更高，优选地90％或更高的裂解细胞。因此，微藻粉能够呈非研磨形式直到研磨程度大于95％的极高研磨形式。具体实例涉及研磨程度为细胞裂解50％、85％或95％优选地85％或95％的微藻粉。
另一选择为，可使用球磨机。在此类磨机中，在具有小研磨颗粒的悬浮液中搅动细胞。细胞破裂是由剪切力、珠粒之间的研磨和与珠粒的碰撞所引起。实际上，这些珠粒使细胞破裂以从其释放细胞内容物。适当球磨机的描述(例如)在专利US5330913中给出。
由此获得呈“水包油”乳液形式的颗粒悬浮液，所述颗粒任选地其大小小于源细胞。
然后可喷雾干燥此乳液且消除水，从而留下含有细胞碎片和脂质的干燥粉末。在干燥之后，粉末的水含量或水分含量通常小于10重量％，优选地小于5重量％且更优选地小于3重量％。
优选地，制备呈粒子形式的微藻粉。微藻粉粒子能够借助特定喷雾干燥工艺获得，该工艺在并流塔中使用高压喷雾喷嘴将颗粒引导到位于塔底部的移动带。然后将该材料以多孔层形式传输穿过后干燥和冷却区，此赋予其类似于饼的易碎结构，该结构在带末端发生破裂。然后处理该材料以获得所需粒径。为根据此喷雾干燥原理实施藻类粉的造粒，可(例如)使用由GEA尼罗公司出售的FiltermatTM喷雾干燥器或由利业包装(TetraPak)公司出售的TetraMagnaProlac干燥器TM干燥系统。
在一优选实施例中，在调节方法后，用于制备微藻粉粒子的方法可包括下列步骤：
1)制备固体含量介于15干重％与40干重％之间的微藻粉乳液，
2)将此乳液引入高压均质器中。乳液的此高压均质化可在两阶段装置(例如由APV公司出售的戈兰(Gaulin)均质器)中实现，其中在第一阶段使用100巴到250巴且在第二阶段10巴到60巴的压力。
3)在垂直喷雾干燥器中喷雾，该垂直喷雾干燥器在其基底处配备有移动带且在其上部部分中具有高压喷嘴，同时调控以下参数：
a)于喷雾喷嘴位准处施加超过100巴，优选地介于100巴与200巴之间且更优选地介于160巴与170巴之间的压力值，
b)输入温度介于150℃与250℃之间，优选地介于180℃与200℃之间，且
c)此喷雾干燥区中的输出温度介于60℃与120℃之间，优选地介于60℃与110℃之间且更优选地介于60℃与80℃之间，
4)将移动带上干燥区的输入温度调控为介于40℃与90℃之间，优选地介于60℃与90℃之间，且将输出温度调控为介于40℃与80℃之间，并且将冷却区的输入温度调控为温度介于10℃与40℃之间，优选地介于10℃与25℃之间，且将输出温度调控为介于20℃与80℃之间，优选地介于20℃与60℃之间，
5)收集由此获得的微藻粉粒子。
根据本发明，然后通过所属领域技术人员已知的任一方式对从发酵培养基提取的生物质进行以下处理：
-浓缩(例如通过离心)
-任选地通过添加标准防腐剂(例如苯甲酸钠和山梨酸钾)来进行保存，
-细胞研磨。
本发明将从下列旨在为说明性的和非限制性的实例中更清楚地得以理解。
实例
实例1.各批次的原壳小球藻生物质粉的制备
A.标准方案的描述：从生物质生产到粉生产
1.发酵
发酵方案是从大致完全描述于专利申请案WO2010/120923中的方案改编而来。
使用原壳小球藻的预培养物接种生产发酵器。接种之后的体积达到9000l。
所用碳源为在130℃下灭菌3分钟的55重量/重量％葡萄糖糖浆。
以进料-分批模式使用经调整以维持残余葡萄糖浓度为3g/l到10g/l的葡萄糖流速实施发酵。
生产发酵时间为4到5天。
在发酵结束时，细胞浓度达到185g/l。
在葡萄糖进料期期间，限制培养基中的氮含量以使得脂质累积量为50％。
将发酵温度维持于28℃。
将接种之前的发酵pH调节到6.8且然后在发酵期间调控于此同一值。
通过控制发酵器的曝气、反压和搅拌来将所溶解氧维持于最低30％。
2.生物质调节
将发酵汁在75℃下于高温/短时(“HTST”)区中热处理1min且冷却到6℃。
然后使用脱碳酸饮用水利用6体积水对1体积生物质的稀释比率洗涤生物质，且使用阿法拉伐菲克斯510(AlfaLavalFeux510)通过离心浓缩。
然后使用75％磷酸将生物质酸化到pH4且然后添加防腐剂(500ppm苯甲酸钠/1000ppm山梨酸钾)。
3.生物质研磨
然后利用内茨施(Netzsch)LME500球磨机使用直径为0.5mm的硅酸锆球研磨生物质。
目标研磨度为85％到95％。
在存储期期间的整个此工艺中且通过使用专有交换器在线冷却来保持产品较冷。
添加抗氧化剂(150ppm/干燥抗坏血酸和500ppm/干燥生育酚混合物)以防止氧化降解。
使用氢氧化钾将培养基调节到pH7。
4.粉干燥
然后将产物在77℃下在线巴斯德灭菌3分钟且进行干燥操作。
后者是在具有旋风分离器的菲尔马特(Filtermat)FMD125上实施。喷嘴压力为160-170巴。
B.感官小组和使得能够评估从生物质获得的微藻粉的感观质量的描述语的定义
由此聚集一组14名个体以使用下列描述语评估所产生的各个生物质批次：
申请公司然后发现，品尝基质可有利地从下列配方构成：
-7％微藻粉
-1％粒状糖
-0.25％家庭用香草香料
-91.75％脱脂奶。
使用浸没式混合器将混合物均质化直到获得均质混合物为止(大约20秒)且然后在75℃下于水浴中加热5分钟。
在每一品尝阶段，针对每一描述语与微藻粉参考批次1相比来评估4到5种产物。
以1到9范围的量表以下列方式依次评估所有产品：
值1：所评估描述语并不呈现于产品中。
值5：所评估描述语以与参考产品1完全相同的方式呈现于产品中。
值9：所评估描述语完全呈现于产品中。
参考批次1是在具有“满足”所有这些描述语的感官特征的意义上相吻合的微藻粉。
优选地，参考批次1不能视为具有最佳化感官特征的微藻粉：其为由感官小组视为“满意”，尤其关于所测试所有描述语具有标记5的微藻粉。
微藻粉的其他批次由此将由感官小组归类到此参考批次1的两侧。
优选地，还包含被认为“极其不可接受”的参考批次2，这是因为其不满足关于芳香调，尤其是气味和风味的描述语。因此，此批次与参考批次1相差甚远。
实施方差分析(ANOVA)以评估描述语(对于模型描述语～粉+判断中的粉效应，与费歇尔测试(Fishertest)-类型-3ANOVA有关的p值小于0.20的描述语)的辨别能力。
将粉效应解释为描述语的辨别能力：如果没有效应(临界概率>0.20)，则不能根据此准则辨别粉。此临界概率越小，则描述语的辨别能力越大。
然后实施主要组分分析(PCA)以获得粉的感官图和所有粉关于所有描述语的同步表现。
数据处理软件
使用R软件(自由出售)实施分析：
R2.14.1版(2011-12-22)
版权(C)2011R基础统计学计算(TheRFoundationforStatisticalComputing)
ISBN3-900051-07-0
平台：i386-pc-mingw32/i386(32位)
该软件是需要加载含有计算函数的模块的工作环境。
此研究中所使用的模块如下：
-对于PCA：程序包FactoMineR1.19版
-对于ANOVA：程序包car2.0-12版
C.发酵pH的影响
发酵pH条件按惯例定义于标准方案中，其是始于假设发酵pH应固定于值6.8(所属领域技术人员已知的原壳小球藻属微藻的最佳生长pH)，但此pH值对所研究或确立的微藻粉的感观性质并无影响。
由此从在中性(6.8)和酸性(5.2)两个pH条件下制得的生物质产生两个系列的粉批次。选择此值5.2以考虑细菌学限制(酸性pH相对地不利于污染细菌的生长)。
下表I呈现在这两个pH值下所产生批次的参考值。
表I
然后通过感官小组根据上文所呈现的描述语来评估这些批次中的每一者。
根据上文所描述的方法分析8个不同批次(批次21、批次23、批次24、批次31、批次53、批次61、批次111和批次131)。
此处呈现关于描述语“奶油/乳酪产品”和“植物余味”的两个实例。
“植物余味”：方差分析表
“奶油/乳酪产品”方差分析表
关于所研究2种描述语的与粉效应有关的临界概率似乎小于0.2：由此辨别2种描述语。关于“植物余味”描述语的临界概率小于关于“奶油/乳酪产品”描述语者，这暗示在粉之间所观察关于第一准则的差异大于关于第二准则者。
下表II汇总针对所有描述语的粉和判断效应获得的临界概率。
表II
粉 判断
颜色 1.62E-31 1.16E-05
植物余味 1.60E-21 1.30E-02
变质油味道 4.00E-06 9.00E-04
涂层 1.48E-05 1.63E-02
谷物 4.05E-04 1.94E-07
蘑菇 1.37E-03 5.66E-05
甜 3.23E-03 4.02E-04
乳酪产品 1.70E-01 4.55E-01
辨别所有描述语；其皆保留用于确立PCA。
由于芳香是粉的基本准则，所以仅对关于风味的描述语(蘑菇、谷物、植物余味、乳酪产品、变质)实施PCA。此PCA的图示为图1和2。
因此PCA的第一轴汇总75％以上的信息，所以使用此轴上产品的坐标作为“变量/分类”。此分类由此明确给出产品之间的感官距离的叙述。
此方法使得可确立各种微藻粉的感观质量的分类，其可表示如下：
批次111>批次31>批次21>批次23>参考批次1>批次131>批次24>批次53>批次61>参考批次2，其中在(一方面)批次111、31、21、23和131与(另一方面)批次24、53和61之间具有清晰间隔。
总体来说，该感官小组将批次111、31、21、23和131判断为可接受且将批次24、53和61判断为不可接受。
这些结果由此明确阐释发酵pH对产品的可接受性完全不可接受的余味的存在的影响。
在pH5.2下，感官特征系统性地具有植物余味，而在pH6.8下，感官特征总体而言更为中性，没有显著植物余味。
乍一看，将发酵pH控制在值6.8由此看来是用于制备具有适宜或甚至最佳化感官特征的微藻粉(批次111)的关键准则。
然而，考虑到在pH6.8下所产生批次的感观可变性，必须注意，pH并非造成所观察效应的唯一参数。
D.在研磨之前调节生物质的步骤对所产生粉的感观质量的影响的测量
还研究了在研磨之前调节(＝预研磨)生物质的两个主要步骤HTST热处理和洗涤的影响。
从在pH6.8下根据上文所描述标准方法的步骤1产生的相同生物质开始，根据4种不同组合实施调节生物质的步骤(图3)。
所述步骤使得能够产生4个批次：1到4号：
-1号组合为没有HTST处理和洗涤的对照。
-2号组合：仅洗涤
-3号组合：仅HTST
-4号组合：在洗涤之前HTST
根据这4个组合产生4个粉批次。每一系列的剩余步骤都相同且使得可调节试样以用于感官分析。下表III呈现关于此组产品可辨别(关于粉效应的p值小于0.2)的描述语的列表：
表III
粉 判断
涂层 2.30E-02 5.79E-03
颜色 3.08E-02 5.30E-02
甜 1.22E-01 6.61E-02
植物余味 1.69E-01 7.37E-01
奶油/乳酪产品 3.74E-01 2.50E-03
蘑菇 3.88E-01 4.02E-02
谷物 5.56E-01 3.33E-02
实施主要组分分析以表示所产生各种粉之间的差异(与选择作为参考1的粉进行比较，也就是，如上文所解释，由感官小组视为“满意”，尤其是关于所测试的所有描述语具有标记5的微藻粉)。
结果呈现于图4和5中。
据观察：
-参考粉1的甜度小于所产生的4个批次，其颜色更深，涂层更多；
-粉1和3都是最甜的；洗涤由此为确保产品中性的重要步骤；
-粉1和2具有余味，其展示HTST处理的优点。在这2种粉中，感官小组注意到先前从未遇到的不同芳香气味，该芳香气味描述如下：酸乳的酸味、“草药味”、苦味、化学品味、香辣味，此情形在粉1上较粉2更为强烈/独特。
在HTST热处理操作之后添加洗涤步骤时，试样的感官中性有所改良，且甜味调有所减小。
在研磨之前整合HTST且然后洗涤生物质的步骤的组合由此使得可通过以下方式来改良最终产品的感观性质：消除“粗制”生物质的调性特性，通过改良其中性和通过减小甜味调。
测试其他组合以细化“预研磨”方法的感官影响的表征。图6
此处，颠倒HTST和洗涤操作：
组合4：HTST，然后洗涤(与上文相同的组合)
组合5：在洗涤之后HTST。
下表IV呈现针对此组产品可辨别(关于粉效应的p值小于0.2)的描述语的列表：
表IV
粉 判断
颜色 5.33E-04 0.05
甜 0.01 0.64
谷物 0.06 0.61
蘑菇 0.17 0.29
涂层 0.25 0.64
植物余味 0.43 0.89
奶油/乳酪产品 0.71 0.78
变质 0.98 0.88
实施主要组分分析以表示所产生两种不同粉之间的差异(仍相对于对照：参考批次1)。
结果呈现于图7和8中。
在颠倒两个步骤时，对应于在HTST之前洗涤的微藻粉(组合5)具有在蘑菇/谷物和甜味方面较强的芳香味。
另外，小组成员评论该产品为“香辣”。
在此情形下，组合4对于其在食品应用中更有利的更中性感官特征是优选的。
E.热处理本身对生物质质量的影响
热处理操作会造成细胞失活，这对于生物质的性质具有一定影响。
随热处理条件而变化的细胞失活百分比(表示为在热处理1分钟之后残余活细胞的％)呈现于图9中。
对于持续1分钟的热处理来说，从50℃开始实现大于90％的失活百分比。
细胞失活伴有细胞内的可溶性材料释放到细胞外培养基中的现象。此现象很可能与壁透化有关。
在热处理生物质之后通常观察到细胞纯度降低，此与细胞外培养基的固体含量增加有关(图10)。所释放可溶性材料主要由蔗糖和在较小程度上的盐和蛋白质组成。
产生热处理条件有所变化的实验设计。
下表呈现热处理(HTST)条件有所变化的所产生批次。
下表V呈现关于此组批次可辨别(关于所产生效应的p值小于0.2)的描述语的列表：
表V
粉 判断
植物余味 0.09 0.93
颜色 0.10 0.05
涂层 0.18 0.61
蘑菇 0.29 0.01
奶油/乳酪产品 0.31 0.52
变质 0.44 0.90
谷物 0.48 0.72
甜 0.54 0.01
实施PCA以表示各个批次之间的差异(图11和12)。
关于所产生的此间距来辨别少数描述语，这是因为感知到关于除那些所评估描述语外的描述语的异常特征。
实际上，除具有较深颜色外，批次42和45尤其苦涩、香辣和发酵味，从而在口腔中留下金属感。
这2个批次最小程度地进行热处理(42未接受任何HTST处理且45在50℃下热处理1min)。
对于批次46来说，其具有植物余味；在95℃下热处理3min由此将不利于产品的感官质量。
批次23具有中间特征；在65℃下热处理1min(批次43)最有益于获得中性感官特征。
F.洗涤影响
以与先前相同的方式，申请公司探究这些新最佳化热处理条件与最佳化洗涤步骤的结合，从而使得可携带走这些细胞外可溶性材料以获得所产生微藻粉的改良感观性质
测试各种洗涤条件。
下表呈现通过改变洗涤条件(根据水体积/生物质体积比率)产生的批次。
批次 操作条件
47 无洗涤
49 6/1(水/生物质)洗涤
50 1/1(水/生物质)洗涤
51 3/1(水/生物质)洗涤
应注意，此实验设计使得可通过“增加”洗涤(从“最少洗涤”到“最高洗涤”，批次47<批次50<批次51<批次49)来分析影响。
下表VI呈现关于此组批次可辨别(关于粉效应的p值小于0.2)的描述语的列表：
表VI
粉 判断
颜色 0.00 0.00
涂层 0.02 0.19
甜 0.10 0.01
蘑菇 0.24 0.00
谷物 0.46 0.00
植物余味 0.51 0.01
奶油/乳酪产品 0.60 0.27
变质 0.84 0.04
实施PCA以表示各个批次之间的差异。结果表示于图13和14中。
此研究明确显示洗涤的基本性质。未洗涤的产品47较甜且判断为不可接受。未洗涤产品(47)自身与其他产品有所区别，这是因为其较甜且具有不同的非典型味道。
此研究的其他产品具有类似感官特征。
然而，应注意，“简单”洗涤(仅1体积水/体积生物质)得到完全适宜的产品质量且由此在工业规模上获得可观经济节约(每体积所处理生物质1有效体积水而非6体积水)。
G.收获生物质期间的酸化影响
在控制负责所产生粉的感观质量的步骤中根本不考虑的参数之一为停止发酵的方案的影响。
通常，在发酵结束时，pO2值有所回升，此为残余葡萄糖完全消耗的迹象，末端发酵方案由下列步骤组成：
-停止pH调控，
-将发酵器冷却到Tp<20℃，
-减小搅拌和空气流速，并且
-维持室顶上的空气压力。
初始发酵pH(不论其是另外固定于5.2还是6.8)通常逐渐降低到pH接近4。
申请公司已证实，此酸化与源自在O2供应方面受限的代谢的乳酸分泌相关。
由此从感官角度考虑评估此观察以测量在调节生物质之前的存储期持续时间的影响，所述存储引起此酸化。
产生以下两个批次：存储时段为8小时(有益于酸化)和未进行存储。
下表VII呈现关于此组产品可辨别(关于粉效应的p值小于0.2)的描述语的列表。
表VII
粉 判断
涂层 1.71E-02 7.50E-02
植物余味 2.27E-02 6.29E-02
蘑菇 2.35E-02 1.25E-02
谷物 7.40E-02 7.30E-02
甜 9.41E-02 3.69E-01
奶油/乳酪产品 1.10E-01 7.27E-02
变质 2.61E-01 3.25E-01
颜色 6.10E-01 4.29E-03
实施PCA以表示粉之间的差异。结果表示于图15和16中。
将3种产品(包含参考批次1)在从奶油/乳酪产品/甜味到谷物/蘑菇/植物余味/涂层范围内的轴上进行分类：
“未进行存储/酸化”批次较甜且具有较明显奶油/乳酪产品味。参考1具有较多涂层且具有谷物/蘑菇/植物余味芳香味；“进行存储/酸化”测试位于二者之间。
如果相对比较“进行存储/酸化”和“未进行存储/酸化”测试，则“未进行存储/酸化”测试由此更为“中性”；其异味少于“进行存储/酸化”测试。
感官分析由此明确显示，长存储期以及此酸化现象会轻微降低最终产品的感官特征，这是因为出现弱强度的谷物/蘑菇/植物余味调。
图式简单说明
图1：各种批次(点云)的PCA的图示-发酵pH的影响
图2：代表各种批次的感官特征的PCA的关联性的圆圈–发酵pH的影响
图3：所测试的预研磨组合。
图4：各种批次(点云)的PCA的图示-在研磨之前调节生物质的步骤的影响
图5：代表各种批次的感官特征的PCA的关联性的圆圈-在研磨之前调节生物质的步骤的影响
图6：所测试的其他预研磨组合
图7：各种批次(点云)的PCA的图示-在研磨之前调节生物质的步骤的影响
图8：代表各种批次的感官特征的PCA的关联性的圆圈-在研磨之前调节生物质的步骤的影响
图9：随热处理条件而变化的在热处理1分钟之后残余活细胞的百分比。
图10：在(HTST)热处理之前和之后从生物质提取的上清液部分的组成的对比
图11：各种批次(点云)的PCA的图示-热处理的影响
图12：代表各种批次的感官特征的PCA的关联性的圆圈-热处理的影响
图13：各种批次(点云)的PCA的图示-洗涤的影响
图14：代表各种批次的感官特征的PCA的关联性的圆圈-洗涤的影响
图15：各种批次(点云)的PCA的图示-收获生物质期间的酸化的影响
图16：代表各种批次的感官特征的PCA的关联性的圆圈-收获生物质期间的酸化的影响。

Claims (9)

1.一种用于调节小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)的生物质的方法，该生物质是在异养条件下且在不存在光下产生且用于制备具有最佳化感官特征的粉，该调节方法的特征在于它包括以下步骤：
-在发酵结束时立即收集该生物质，且在其调节之前存储小于8小时，
-在介于60℃与68℃之间的温度下高温/短时(HTST)热处理该由此回收且存储的生物质30秒到1分30秒，并且
-使用至多3体积水/体积生物质洗涤该经HTST处理的生物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在其调节和研磨之前该生物质的存储时间小于3小时，优选地小于1小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在65℃±2℃，优选地65℃的温度下实施该HTST热处理1分钟。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其特征在于使用1体积水/体积生物质洗涤该生物质。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其特征在于在洗涤该生物质的步骤之前实施该HTST处理。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于通过使该小球藻属的微藻在介于6.5与7之间，优选地6.8的初始pH下发酵，并将该发酵pH调控于介于6.5与7之间的值，优选地于值6.8下来获得该生物质。
7.一种用于产生小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻的生物质的方法，该生物质用于制备具有最佳化感官特征的粉，该方法包括：
-通过在异养条件下且在不存在光下使该小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻发酵来产生生物质，该发酵的初始pH和发酵期间的pH调控被固定于介于6.5与7之间的值，优选地于值6.8；并且
-借助根据权利要求1到5中任一项所述的方法调节该生物质。
8.一种用于制备具有最佳化感官特征的小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻的粉的方法，该方法包括：
-借助根据权利要求1到5中任一项所述的方法调节该生物质；
-研磨该经调节的生物质；并且
-干燥该经研磨的生物质。
9.根据权利要求8所述的用于制备具有最佳化感官特征的小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻的粉的方法，该方法还包括在该调节之前通过使该小球藻属的微藻，优选地原壳小球藻在异养条件下且在不存在光下发酵来产生生物质，该发酵的初始pH和发酵期间的pH调控被固定于介于6.5与7之间的值，优选地于值6.8。
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