CN105325731A - α-酮戊二酸作为饲料添加剂的用途及相应饲料 - Google Patents

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赵玉蓉
王红权
邬静
田亚男
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Abstract

一种α-酮戊二酸作为饲料添加剂的用途，该α-酮戊二酸以饲料添加剂的形式添加在仔猪日常饲料中，能显著提高仔猪的生长速度，抑制仔猪肠道病原菌的侵染，降低仔猪黄白痢发病率，增强肠上皮细胞紧密连接主要相关基因的表达；具有绿色、天然、无耐药、无残留，功能多、兼顾生长和抗疾病等特性；能较大地降低仔猪黄白痢发病率、降低仔猪养殖成本，适合产业化生产。

Description

α-酮戊二酸作为饲料添加剂的用途及相应饲料
技术领域
本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及一种α-酮戊二酸以饲料添加剂的形式添加在仔猪日粮(仔猪日常饲料)中以用于抑制猪仔肠道病原菌的侵染、降低仔猪黄白痢发病率。
背景技术
仔猪黄白痢又称新生猪腹泻，是仔猪黄痢和仔猪白痢的合称，是由致病性大肠杆菌等引起的一种急性传染病。目前已分离的仔猪黄痢、白痢的血清型众多，各血清型疫苗之间有效的交叉保护性差，给该病的防治造成了很大的难度。国内的仔猪黄白痢的发病率达20％-60％，出现混合感染和继发感染时，病死率可达60％以上，给养猪业造成了严重的危害。随着畜牧业集约化程度的提高和饲料工业的发展，全球范围内，由于抗生素的乱用，耐药菌株增多，导致此病也日益恶化，多呈季节流行性和地方流行性。针对仔猪黄白痢、生长受阻等应激，国内外做了大量研究，主要是抗生素、高锌、益生素、寡糖、酶制剂、酸化剂等方面的研究。
α-酮戊二酸又称为2-氧代-1,5酮戊二酸(alpha-Ketoglutaricacid，AKG)，为白色或类白色细结晶性粉末，易溶于水、醇、极难溶于醚，热稳定性高，熔点在113-115℃，分子式C5H6O5，分子量146.10，其分子结构式如下：
该α-酮戊二酸以生物合成或化工合成的原形物形式使用，是谷氨酰胺的前体物质和三羧酸循环的重要中间产物，具有良好的稳定性，在体内可以氧化产生ATP。另外，AKG也是其它酮酸如α-酮异己酸的前体物质，α-酮异己酸可转变为羟甲基丁酸，而羟甲基丁酸被认为是蛋白质分解的保护物质。动物体内的转氨酶多以AKG为特异的氨基受体，可将大多数氨基酸的氨基转移给AKG生成谷氨酸(Glu)。Glu参与构成谷胱甘肽(GSH)，而GSH具有抗氧化和解毒作用；Glu和氨在谷氨酰胺合成酶的催化下合成谷氨酰胺(Gln)；Glu还可以与乙酰辅酶A产生N-乙酰谷氨酸，推动尿素循环。可见，AKG在机体内既是一种能量载体，又能运载氮、贮存氮，改善机体的氮代谢。目前的研究表明，AKG可增强细胞代谢活性、降低体外细胞培养体系及机体产生的活性氧含量，具有明显的抗氧化作用；减轻急慢性氰化物中毒诱导的大脑氧化应激；通过抗氧化作用机制减轻酒精诱导的肝细胞损伤；上调应激相关蛋白表达，增加胰岛素、生长激素及胰岛素样生长因子-1等血清水平；减轻实验动物内毒素血症诱导的氧化应激及胃肠粘膜损伤，并改善胃肠粘膜完整性及营养吸收；有效维持机体总氮平衡和促进蛋白质合成。
目前，α-酮戊二酸已做为一种营养强化剂广泛应用于人类保健品和医疗机构，但作为仔猪饲料添加剂研究较少，将α-酮戊二酸添加在仔猪饲料中作为抑制病原菌侵染制剂和降低仔猪黄白痢发病率的饲料尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术中仔猪抗应激能力差，易感染病原菌，黄白痢发病率和死亡率高的问题，提供一种α-酮戊二酸作为饲料添加剂的用途及相应饲料，通过将α-酮戊二酸作为饲料添加剂添加在仔猪日常饲料中，以增强仔猪肠上皮细胞紧密连接主要相关基因的表达，从而抑制病原菌对仔猪肠道组织的侵染，降低仔猪黄白痢发病率，显著促进仔猪生长。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：α-酮戊二酸在制备仔猪用抑制肠道病原菌侵染制和仔猪用降低黄白痢发病率药剂中的应用。
本发明采用的另一种技术方案是：α-酮戊二酸在制备抑制肠道病原菌侵染和降低黄白痢发病率的饲料中的应用。
本发明同时提供一种仔猪用饲料，该饲料中添加有α-酮戊二酸，该α-酮戊二酸的添加量为每1千克该饲料添加5-10克。
上述提及的α-酮戊二酸为市购产品，可为市面上流通或贮藏的按不同工艺技术生产的各种形态的α-酮戊二酸。使用时，可将α-酮戊二酸应用于被法规许可添加于仔猪饲料或饲料添加剂中的载体或者基质。
当α-酮戊二酸添加到仔猪日常饲料中时，可采用的添加方式包括将其以固体混合的方式直接与日常饲料混合，搅匀，或是加水溶解后以喷雾形式均匀喷洒在日常饲料中，或是现有技术中的其它添加方法。如果适当的话，α-酮戊二酸可以和通常的仔猪饲料添加剂一起添加，如维生素、矿物质、微量元素等。
本发明通过将α-酮戊二酸作为添加剂添加在仔猪日常饲料中，具有显著增强仔猪肠上皮细胞紧密连接主要相关基因表达，抑制病原菌对仔猪肠道组织的侵染，降低仔猪黄白痢发病率，促进仔猪生长的优点。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1α-酮戊二酸对仔猪生长性能的影响
试验饲料及分组：选取母猪胎次相同、产活仔数相同的8窝仔猪(调整为每窝12头，与母猪同笼)，随机分为两个处理组，分别为对照组和α-酮戊二酸添加组(本发明饲料组)，每个处理4个重复，每个重复为一窝(或笼)，分别饲喂基础日粮和本发明饲料日粮。仔猪的基础日粮配制参照NRC(1998)猪的营养需要。本发明饲料日粮为每1千克基础日粮中添加有10克α-酮戊二酸替代基础日粮中相应质量的玉米粉。配制试验饲料时，每种饲料原料采用锤片式粉碎机粉碎(筛片孔径为1mm)，按比例混合并搅拌均匀，制成直径2mm、长度3mm的硬颗粒，在室温下风干后4℃冰箱贮存备用。
试验方法：试验在同一栋封闭猪舍内进行。本发明饲料组的仔猪从7日龄开始喂饲本发明饲料日粮至35日龄，为期28天，自由采食、饮水，免疫消毒程序按猪场常规方法进行。以重复笼为单位饲喂，每天观察记录试验猪的采食、排粪等情况。
试验结果：从表1可知，本发明饲料组的仔猪喂饲添加有α-酮戊二酸的基础日粮后，平均日增重显著提高，黄白痢发病率显著降低。说明：α-酮戊二酸能显著促进仔猪生长，显著降低仔猪黄白痢发病率。
表1α-酮戊二酸对仔猪生长性能的影响
基础饲料组(对照组) 本发明饲料组
平均初始重(kg) 3.31±0.22 3.37±0.25
平均日增重(kg) 0.273±0.003b 0.316±0.028a
黄白痢发病率(％) 4.251±0.711a 1.172±0.637b
注：同行数据中标有不同字母者为差异显著(P＜0.05)，下同。
实施例2α-酮戊二酸对沙门氏菌侵染IPEC-1(仔猪小肠上皮细胞)的影响
沙门氏菌准备：将LB固体培养基上分离培养获得的单个沙门氏菌菌落，接种到5ml液体LB培养基中，37℃，225r/min震荡培养过夜后，取10μl含有沙门氏菌的液体LB培养基接种到5ml液体LB培养基中，37℃过夜，使得沙门氏杆菌达到指数生长期。
沙门氏杆菌侵染试验，将IPEC-1细胞接种于24孔细胞培养板，每孔含5×104个细胞，每组设3个平行孔，待细胞贴壁后，分别每天更换原来的培养基(对照组)和含α-酮戊二酸(购自Sigma公司，纯度为99.5％)的培养基(AKG的浓度为1mM)，培养2天。将之前准备的沙门氏菌1000r/min，离心10min，弃去上清，用5ml的DMEM/F12培养液(不含青/链霉素)重新悬浮细菌。每孔接种100μl含沙门氏菌的DMEM/F12培养基，并将培养板800r/min，离心10min，从而将细菌沉淀至培养板底充分与IPEC-1细胞接触。在37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育60min。60min后移去培养基，用PBS洗涤2遍，每孔加入1ml含有100μg/mlGentamicin，在37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育120min以除去未侵染进细胞内的沙门氏菌。用PBS洗涤3遍后，每孔加入200ul1％TritonX-100，在37℃的孵箱中裂解5min,再于每孔加入800μlPBS充分混匀。再将获得的裂解液稀释1×103后，取100μl接种于固体LB培养基，培养过夜后计数培养板上的菌落数。由表2可以得知α-酮戊二酸能够显著减少沙门氏菌对IPEC-1细胞的侵染。
表2α-酮戊二酸对沙门氏菌侵染IPEC-1细胞的影响
对照组 α-酮戊二酸组
培养板上的菌落数(个) 44.00±2.42a 34.25±3.40b
实施例3：α-酮戊二酸对IPEC-1细胞(仔猪小肠上皮细胞)紧密连接主要相关基因表达的影响
将IPEC-1细胞接种于6孔细胞培养板，每孔含1×106个细胞，每处理设3个平行孔，待细胞贴壁后，吸弃原培养基，分别每天更换原来的培养基(对照组)和含α-酮戊二酸(购自Sigma公司，纯度为99.5％)的培养基(AKG的浓度为1mM)，待细胞生长覆盖培养板底部大于90％后弃上清，用冰冷的PBS洗细胞2次，每孔加1mlTrizol裂解细胞，然后按常规方法提取RNA、cDNA反转录、实时荧光PCR,采用2-(△△Ct)计算各基因mRNA的相对表达量。由表3可以得知，α-酮戊二酸能显著上调IPEC-1细胞紧密连接主要相关基因表达，说明α-酮戊二酸有利于改善仔猪肠道上皮组织的屏障功能。
表3α-酮戊二酸对IPEC-1细胞紧密连接主要相关基因表达的影响
对照组 α-酮戊二酸组
闭锁小带蛋白(ZO-1) 1.01±0.14b 1.99±0.11a
闭锁蛋白(Occludin) 1.09±0.08b 3.28±0.18a
密封蛋白(Claudin-1) 1.08±0.10b 5.23±0.29a

Claims (6)

1.α-酮戊二酸在制备仔猪用抑制肠道病原菌侵染剂中的应用。
2.α-酮戊二酸在制备仔猪用降低黄白痢发病率药剂中的应用。
3.α-酮戊二酸在制备抑制肠道病原菌侵染和降低黄白痢发病率的饲料中的应用。
4.一种仔猪用饲料，其特征在于，该饲料中添加有α-酮戊二酸，该α-酮戊二酸的添加量为每1千克该饲料添加5-10克。
5.如权利要求4所述的仔猪用饲料，其特征在于，所述饲料是将α-酮戊二酸与仔猪日常饲料混合，搅匀，得到。
6.如权利要求4所述的仔猪用饲料，其特征在于：所述饲料是先将α-酮戊二酸溶于水后，再把溶有α-酮戊二酸的水均匀喷洒在仔猪日常饲料中，得到。
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