CN105316285A

CN105316285A - 人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法

Info

Publication number: CN105316285A
Application number: CN201510749897.2A
Authority: CN
Inventors: 曾宪卓; 鲁菲
Original assignee: ISTEM REGENERATIVE MEDICINE SCI-TECH Co Ltd
Current assignee: ISTEM REGENERATIVE MEDICINE SCI-TECH Co Ltd
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2016-02-10

Abstract

本发明涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，所述三维细胞培养支架是由胶原和壳聚糖或赖氨酸制成；或所述三维细胞培养支架是由胶原与壳聚糖和戊二醛制成的。通过采用壳聚糖或赖氨酸，亦或是壳聚糖和戊二醛对胶原支架进行改性，以提高胶原支架的机械性能，并利用其三维多孔结构维持骨髓间充质干细胞体外培养过程中的三维生长环境，以更好地模拟适宜骨髓间充质干细胞生长的骨髓微环境，解决了现有技术中，采用单一三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在支架机械性能弱等缺陷造成细胞增殖率低、易死亡等问题。

Description

人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨MSCs体外大量扩增具有深远意义。

目前骨髓间充质干细胞的体外扩增多采用二维培养方式进行的，也有部分采用三维细胞培养支架进行培养，但均是采用单一的三维细胞培养支架，由于单一的三维细胞培养支架存在机械性能弱，不稳固等问题，因此，在培养过程中，容易从三维细胞培养支架的三维培养方式转变成二维培养方式，从而使得骨髓间充质干细胞活性差，扩增不明显。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用单一的三维支架培养骨髓间充质干细胞的方法因支架机械性能弱，不稳固等造成骨髓间充质干细胞扩增率不高、细胞活性差等缺陷，提供一种能够采用两种及以上三维支架的人工模拟骨髓微环境进行骨髓间充质干细胞的培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；

其中，所述三维细胞培养支架是由胶原和壳聚糖，或胶原和赖氨酸组合制成；或，所述三维细胞培养支架是由胶原与壳聚糖和戊二醛三者共同制成的。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述三维细胞培养支架中还添加有纳米晶胶原基骨或脱细胞软骨。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，由所述胶原和壳聚糖制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤：

将胶原溶于乙酸溶液中，配制胶原溶胀液；将壳聚糖溶于乙酸中，配制壳聚糖溶液，然后将胶原溶胀液和壳聚糖溶液混合脱泡，冷冻并冻干。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，由所述胶原和赖氨酸制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤：

将胶原溶于乙酸溶液中制成胶原溶胀液，经真空脱泡，冷冻并冻干处理后，浸泡于含有赖氨酸的MES溶液中，然后再添加EDAC交联剂和含NHS氨基酸保护剂，交联处理后漂洗，然后冷冻并干燥。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，由所述胶原、壳聚糖和戊二醛制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤：

将胶原溶于乙酸溶液中，配制成胶原溶胀液；并用乙酸溶液配制壳聚糖溶液，然后将胶原溶胀液和壳聚糖溶液混合并放置于真空中干热交联后浸泡于戊二醛溶液中，继续交联8-16个小时后，漂洗，冷冻并冻干。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：

将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入所述培养基进行培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例接种进行传代培养至细胞生长到融合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，采用三维细胞培养支架进行体外培养的步骤为：取三维细胞培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰个/L细胞浓度与复溶后三维细胞培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，三维细胞培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂，且所述助溶剂的质量分数为5％-15％。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。

实施本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，可以达到以下有益效果：通过采用壳聚糖或赖氨酸，或是采用壳聚糖和戊二醛对胶原支架进行改性，以提高三维细胞培养支架的机械性能，使其不易被酶解，并利用其三维多孔结构维持骨髓间充质干细胞体外培养过程中的三维生长环境，以更好地模拟适宜骨髓间充质干细胞生长的骨髓微环境，并提高三维细胞培养支架的细胞黏附性，使得骨髓间充质干细胞能够黏附在三维细胞培养支架的多孔结构上生长，扩大了细胞与培养基的接触面积，从而达到提高骨髓间充质干细胞的细胞活性及增值率，解决了现有技术中，采用单一三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在支架机械性能弱等缺陷造成细胞增殖率低、易死亡等问题。

具体实施方式

为解决现有技术中采用单一的三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在细胞活性差，增殖率低等缺陷，本发明的创新点在于提供一种采用两种及以上的三维细胞培养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞培养支架机械性能弱、不稳固、生物相容性差、不利于细胞黏附等问题，从而可真正实现骨髓间充质干细胞的三维培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨髓间充质干细胞的扩增率。

具体地，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

S1、获取骨髓间充质干细胞；

S2、采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，三维细胞培养支架是由胶原和壳聚糖，或由胶原和赖氨酸组合制成；或，三维细胞培养支架是由胶原与壳聚糖和戊二醛三者共同组合制成。

胶原具有无抗原性、及良好的生物相容性，其本身所包含的细胞黏附信号肽序列可以引导骨髓间充质干细胞对胶原支架的特定识别，有助于保持骨髓间充质干细胞的表型及活性，但由胶原单独制作而成的胶原支架存在易酶解、机械性能差、细胞黏附性相对较弱等缺陷。本发明的创新点在于通过采用壳聚糖或赖氨酸对胶原进行改性，能够提高胶原的抗酶解能力，改善胶原的力学性能，提高支架材料的机械性能及孔隙率。另外，通过引入戊二醛和胶原的氨基酸残基以及胶原的H原子发生反应，通过这些反应使胶原分子相互连接形成交联的互穿网络，这样不但可以提高材料的机械性能，还可以延缓生物材料的降解速率；而壳聚糖的引入能够大大减缓胶原支架的降解速度，以满足细胞对支架材料降解的要求。

而由壳聚糖制成的壳聚糖水凝胶或壳聚糖改性水凝胶均具有生物功能性亲水表面，可促进细胞黏附、增殖；两者分别单独作为三维细胞培养支架材料存在机械性能弱，不能保持既定性状，可塑性不强，不能很好的模拟骨髓微环境的缺陷；而由壳聚糖与胶原支架共同制成的三维细胞培养支架，则能够增强三维细胞培养支架的机械性能，及生物相容性及细胞黏附性，促进骨髓间充质干细胞的黏附生长及增殖，另外，胶原支架也能够使骨髓间充质干细胞保持其干细胞特性。

进一步地，为提高三维细胞培养支架的机械性能，本发明提供的三维细胞培养支架中还包括纳米晶胶原基骨或脱细胞软骨；其中，纳米晶胶原基骨具有三维孔洞网络结构，机械强度较好，且具有一定的生物相容性；而脱细胞软骨是生物新鲜组织经过物理方法处理，脱去组织中的所有细胞、抗原等物质后所得到的产物，主要包括胶原支架、弹性蛋白、非胶原支架糖蛋白、蛋白多糖和糖胺多糖，具有良好的生物相容性、柔韧性、低抗原性，在体外培养过程中无降解变形，保留了培养前的结构，且保留了大量对细胞黏附、增殖有利的蛋白多糖和Ⅱ型胶原支架等，其力学性质与天然的软骨很相近，还具有能提供对细胞黏附有益的信号分子。

进一步地，步骤S1中还包括原代骨髓间充质干细胞的获取，及原代骨髓间充质干细胞的传代培养，具体为：

S11、原代骨髓间充质干细胞的获取：

采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

S12、对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养至第三代骨髓间充质干细胞：

将原代骨髓间充质干细胞调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入培养基进行培养，优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。当细胞生长到融合时，PBS漂洗2～3次，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例传代接种培养至细胞生长到融合，重复上述操作继续传代，即PBS漂洗2～3次，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例传代接种培养至细胞生长到融合，即获得第三代骨髓间充质干细胞。

步骤S2的具体过程为：

取三维细胞培养支架于蒸馏水中复溶，复溶过程中可添加助溶剂促进三维细胞培养支架溶解，优选地，助溶剂为乙醇，且乙醇的质量分数为5％-15％。取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰L^-1细胞浓度与复溶后三维细胞培养支架共同接种于培养基中进行培养。

优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。其中，氢化可的松能够参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，调节骨髓间充质干细胞的增值，促进骨髓间充质干细胞功能表达。青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；链霉素能够作用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人为产生的抗药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为优选地是将青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细菌对骨髓间充质干细胞的生长及活性造成的不良影响。因此，采用该血清培养基培养间充质干细胞不仅可以促进骨髓间充质干细胞生长和增殖，而且可避免培养过程中产生的细菌对细胞活性造成的影响。

进一步地，步骤S2中所采用的三维细胞培养支架可以是由以下物质组合制成的：1、胶原和壳聚糖；2、胶原、壳聚糖及戊二醛；3、胶原和赖氨酸；4、胶原和壳聚糖及纳米晶胶原基骨；5、胶原、壳聚糖和戊二醛及纳米晶胶原基骨；6、胶原和赖氨酸及纳米晶胶原基骨；7、胶原和壳聚糖及脱细胞软骨；8、胶原、壳聚糖和戊二醛及脱细胞软骨；9、胶原和赖氨酸及脱细胞软骨。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的制备过程为：

1、胶原的制备，包括以下步骤：

1)取新鲜牛键，去除肌肉、脂肪，并尽可能去除筋膜；用三蒸水反复清洗后，装于PE自封袋中-30℃保存；

2)于冷冻状态下，用手术刀将牛键削为薄片，然后于组织捣碎机中捣碎；

3)称取60克左右牛键粉碎物，用0.05％(w/v)的醋酸洗必泰浸泡5min消毒，然后用0.9％的生理盐水多次洗涤，纱布过滤，尽可能洗去残留的醋酸洗必泰；

4)将消毒后的牛键于含有0.25％胰酶的PBS消化液(pH＝7.4)中，37℃下消化24小时；

5)消化结束后，加入几滴H₂O₂，浸泡10-15分钟，去除残留的胰酶；然后用三蒸水反复清洗，洗去H₂O₂。

6)在消化好的牛键中加入少量3％的乙酸溶液，用组织捣碎机搅拌为粘稠状混合物，再加入1000毫升3％的乙酸溶液，于4℃溶胀72小时；

7)用布氏漏斗将未溶胀的牛键颗粒分离，溶胀物于离心机中离心(2000r/15min)，以分离不溶物；

8)用5％NaCl溶液盐析离心上清液；

9)沉淀物再经3％的乙酸溶胀后，重复步骤7)和8)；

10)然后于三蒸水中，用截留分子量为3000的透析袋4℃透析72h，每12h换水；

11)透析后的胶原经冷冻干燥后，于-20℃条件下保存。

2、纳米晶胶原基骨的制备，包括以下步骤：

将一定比例的磷酸钠溶液和氯化钙溶液(Ca/P＝1.66)添加入0.67g/L的Ⅰ型胶原支架溶液中，缓慢搅拌，调节溶液pH在7.4左右，48小时后离心去除上清，冷冻干燥。冻干后得到的粉末再与聚乳酸复合成形即得最终的纳米晶胶原基骨三维框架材料；纳米晶胶原基骨三维框架材料在PBS中漂洗30min共3次，在体积分数为95％的乙醇中浸泡2h，用无菌滤纸吸去多余液体，后研碎。

3、脱细胞软骨的制备，包括以下步骤：

取牛股骨，将股骨头关节面软骨用手术刀切下，蒸馏水冲洗2遍，室温下将关节软骨浸泡于含0.035mmol/LPMSF(蛋白酶抑制剂)的PBS缓冲液(pH7.5)中，经粉碎机粉碎、梯度离心制成软骨微丝；软骨微丝经脱细胞液脱细胞处理，其中，脱细胞液为：0.035mmol/LPMSF、l％TritonX-100及pH7.5的Tris-HCl缓冲液；持续震荡48h，7000r/min×5min离心，PBS缓冲液冲洗，然后37℃下加入50U/ml的DNA酶和1U/ml的RNA酶消化2h，重复7000r/min×5min离心，沉淀用超纯水冲洗3遍后再配成浓度为30g/L的乳糜状悬液，-20℃冰箱中保存备用。

实施例1

本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

S1a、获取原代骨髓间充质干细胞；

采集骨髓标本，肝素抗凝。每份标本按1：2的比例加在密度为1.073g/ml的percoll分离液上，2300rpm转速下离心30min，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，1000rpm离心10min，洗涤3次，弃上清液，即获得原代骨髓间充质干细胞。

S2a、原代骨髓间充质干细胞的传代培养；

将步骤S1a中所获得的骨髓间充质干细胞调整至1×10⁷个/培养瓶(25ml)密度，并添加血清培养基进行培养，其中，血清培养基为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基，葡萄糖的浓度为1500-4500mg/l。当细胞生长到95％以上完全融合时，倾去旧培养基，用PBS液漂洗2～3次，倾去PBS液，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶，加入量以使胰蛋白酶可以完全覆盖瓶底的细胞为准。将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养终止消化，吸管顺序轻轻吹打瓶底，倒置显微镜下观察细胞完全脱壁后，按1：2～1：3比例传代接种于25ml培养瓶，放置于37℃、5％CO₂、95％湿度的培养箱中培养，直至细胞生长到几乎完全融合时，再次进行传代，获得第三代骨髓间充质干细胞，继续培养3天。

S3a、取步骤S2a中获得的第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养；

S31a、三维细胞培养支架的制备过程，包括以下步骤：

将胶原溶于3％(0.5M)的乙酸溶液中，搅拌均匀形成浓度为0.5％的胶原溶胀液；并用3％(0.5M)的乙酸溶液配制0.5％的壳聚糖溶液，按体积比1：1充分混合真空脱泡后4℃储存备用。以每孔0.4ml注入24孔培养板中，于-20℃温度冷冻1小时。然后于冷冻一干燥机中冻干24小时，即获得由胶原和壳聚糖共同制成的三维细胞培养支架，下简称“胶原壳聚糖支架”。

S32a、将骨髓间充质干细胞接种于三维细胞培养支架上进行体外共培养；

取步骤S31a中获得的胶原壳聚糖支架0.5g于3％10ml乙酸和20ml蒸馏水中复溶后，接种于培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种于含有三维细胞培养支架的培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤所采用的培养液为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，本实施例中，三维细胞培养支架是由胶原、壳聚糖和戊二醛共同制成的胶原壳聚糖改性支架；

在该实施例中，取第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养的过程，包括以下步骤：

S31b、三维细胞培养支架的制备：

将胶原溶于3％(0.5M)的乙酸溶液中，搅拌均匀形成浓度为0.5％的胶原溶胀液；并用3％(0.5M)的乙酸溶液配制0.5％的壳聚糖溶液，将胶原溶胀液和壳聚糖溶液混合后于150℃，真空烘箱中(真空度<0.2mbar)中干热交联24小时，获得胶原/壳聚糖支架；将真空干热交联的胶原/壳聚糖支架按体积比1:1的比例浸泡于0.25％(w/v)的戊二醛水溶液中，4℃交联12小时。交联结束后，用三蒸水充分漂洗6次，每次10分钟，洗去残留的戊二醛，然后再经过冷冻一冻干即获得交联后的胶原壳聚糖改性支架。

S32b、接种步骤S31b获得的三维细胞培养支架；

取0.5g研碎后的三维细胞培养支架于10ml的3％乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然后将三维细胞培养支架接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹个/L浓度接种与含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤所采用的培养液为含有10％胎牛血清、10^-7mol/L的氢化可的松、80U/ml的青霉素及80mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。

实施例3

与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由胶原支架和赖氨酸组合制成的。

S31c、三维细胞培养支架的制备；

将胶原溶于3％(w/v)(pH＝2.78)的乙酸溶液中，搅拌均匀形成浓度为0.5％(w/v)的胶原溶胀液，经过真空脱泡处理后，以每孔0.4ml注入24孔培养板中，于-20℃温度下冷冻1小时，然后于冷冻干燥机中冻干24小时，即获得胶原支架。

将胶原支架于lml、50mM的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)溶液中室温下浸泡1小时，其中，MES溶液中含有质量分数为3％的赖氨酸，且MES溶液的pH值为5.5，呈弱酸性；然后添加1ml含有40mM的EDAC交联剂(乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺)和20mM的含NHS氨基酸保护剂(N-羟基琥珀酰亚胺)的MES溶液，并于室温下交联处理24小时；交联后用三蒸水漂洗6次，每次10分钟，然后经冷冻一干燥，即可制备经氨基酸辅助交联的胶原支架，以下简称胶原赖氨酸支架。

S32c、接种步骤S31c获得的三维细胞培养支架；

取0.5g研碎后的三维细胞培养支架于10ml的3％乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然后将三维细胞培养支架接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹个/L浓度接种于含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤所采用的培养液为含有10％胎牛血清、10^-8mol/L的氢化可的松、120U/ml的青霉素及120mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。

实施例4

与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由纳米晶胶原支架以及胶原壳聚糖支架的组合产物；其中，纳米晶胶原支架的制备方法如上所述，胶原壳聚糖支架的制备方法见实施例1，在此不再赘述。

取纳米晶胶原支架0.25g和胶原壳聚糖支架0.5g于3％10ml乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然后接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种于含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

实施例5

与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由纳米晶胶原支架以及胶原壳聚糖改性支架的组合产物，其中，纳米晶胶原支架的制备方法如上所述，胶原与壳聚糖改性支架的制备方法见实施例1，在此不再赘述。

取纳米晶胶原支架0.25g和胶原壳聚糖改性支架0.5g于3％10ml乙酸和20ml蒸馏水中复溶后，接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种于含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

实施例6

与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由纳米晶胶原支架以及胶原赖氨酸支架组合而成的；其中，纳米晶胶原支架的制备方法如上所述，胶原赖氨酸支架的制备方法见实施例3，在此不再赘述。

取纳米晶胶原支架0.25g和胶原赖氨酸支架0.5g于3％10ml乙酸和20ml蒸馏水中复溶后接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种于含有三维细胞培养支架的三维细胞培养支架。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

实施例7

与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由胶原壳聚糖支架和脱细胞软骨组合而成；其中，胶原壳聚糖支架的制备方法见实施例1，脱细胞软骨的制备方法如上所述，在此不再赘述。

取30g/L的脱细胞软骨匀浆10ml和胶原壳聚糖支架0.5g于3％10ml乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然后将其接种于细胞培养容器中；再取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种于含有上述三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

实施例8

本实施例中，三维细胞培养支架是由胶原壳聚糖改性支架和脱细胞软骨组合而成的，其中，胶原壳聚糖改性支架的制备方式见实施例2，脱细胞软骨的制备方式如上所述，在此不再赘述；

取研碎后的胶原壳聚糖改性支架0.5g、10ml的30g/L的脱细胞软骨于10ml的3％乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然后将其接种于细胞培养容器中；再取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种于上述含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

实施例9

本实施例中，三维细胞培养支架是由胶原赖氨酸支架和脱细胞软骨组合而成的，其中，胶原赖氨酸支架的制备方式见实施例3，脱细胞软骨的制备方式如上所述，在此不再赘述；

取胶原赖氨酸支架0.5g、10ml的30g/L的脱细胞软骨于10ml的3％乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然后将其接种于细胞培养容器中；再取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种于上述含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

为进一步验证本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。

检测对象：

检测组1-9分别对应本发明实施例1-9骨髓间充质干细胞与三维细胞培养支架共培养第3天所获得的细胞；

对照组1-6—分别对应单独采用胶原支架、纳米晶胶原支架基骨、脱细胞软骨、壳聚糖水凝胶、壳聚糖改性水凝胶和赖氨酸支架中任意一种培养骨髓间充质干细胞第3天所获得的细胞；

检测一、台盼蓝法进行细胞计数

取检测组1-9及对照组1-6的细胞，分别执行以下操作：

用75％酒精清洗计数板和盖玻片，用吸水纸擦干；在每次细胞补液前取10ul细胞悬液和10ul的0.4％苔盼蓝充分混合，再加80ul的PBS缓冲液稀释细胞悬液；吸取少量细胞悬液，加入在计数板上的盖玻片内，一定注意不要溢出至计数板上的小槽内，也不要过少或带气泡，在倒置显微镜下观察血球计数板上计数4个大方格内的细胞总数，并根据以下公式计算出细胞密度：细胞悬液密度计算公式—细胞密度＝(4个大格细胞总数/4)×10⁴×10(稀释倍数)个/ml，具体数据见下表1。

表1：

检测结果：由表1中的数据可知，检测组1-12中的细胞密度均远大于对照组1-6中的细胞密度，由此说明，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法提高了骨髓间充质干细胞的增殖率。

检测二、流式细胞仪检测细胞表型CD44，CD90，CD105的阳性率

组别	CD44阳性率	CD90阳性率	CD105阳性率	CD34阳性率	CD45阳性率
						检测组1	99.51％	99.63％	99.79％	1.41％	1.22％
检测组2	99.67％	99.82％	99.84％	1.48％	1.49％
						检测组3	99.70％	99.87％	99.60％	1.31％	1.28％
检测组4	99.62％	99.21％	99.81％	1.29％	1.30％
						检测组5	99.81％	99.30％	99.77％	1.39％	1.19％
检测组6	99.88％	99.50％	99.87％	1.31％	1.14％
						检测组7	99.74％	99.20％	99.51％	1.27％	1.37％
检测组8	99.85％	99.30％	99.47％	1.21％	1.39％
						检测组9	99.75％	99.45％	99.39％	1.38％	1.41％
对照组1	92.01％	91.34％	90.87％	9.07％	9.35％
						对照组2	89.32％	88.91％	90.03％	9.01％	9.08％
对照组3	92.61％	90.88％	91.09％	8.25％	9.97％
						对照组4	88.37％	87.23％	89.93％	8.91％	8.68％
对照组5	90.37％	89.87％	89.83％	8.78％	8.38％
						对照组6	89.43％	86.65％	90.27％	9.01％	9.18％

检测结果：由表二中的数据可知，检测组1-12均大于对照组1-6中的数据，由此说明，检测组1-12所获得的骨髓间充质干细胞的活性较强。

综上所述，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，通过采用壳聚糖或赖氨酸，亦或是采用壳聚糖和戊二醛对胶原支架进行改性，以提高三维细胞培养支架的机械性能，使其不易被酶解，并利用其三维多孔结构维持骨髓间充质干细胞体外培养过程中的三维生长环境，以更好地模拟适宜骨髓间充质干细胞生长的骨髓微环境，并提高三维细胞培养支架的细胞黏附性，使得骨髓间充质干细胞能够黏附在三维细胞培养支架的多孔结构上生长，扩大了细胞与培养基的接触面积，从而达到提高骨髓间充质干细胞的细胞活性及增值率，解决了现有技术中，采用单一三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在支架机械性能弱等缺陷造成细胞增殖率低、易死亡等问题。

以上结合对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims

1.一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

其中，所述三维细胞培养支架是由胶原和壳聚糖，或胶原和赖氨酸制成；或，所述三维细胞培养支架是由胶原与壳聚糖和戊二醛三者共同制成的。

2.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养支架中还添加有纳米晶胶原基骨或脱细胞软骨。

3.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，由所述胶原和壳聚糖制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤：

4.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，由所述胶原和赖氨酸制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，由所述胶原、壳聚糖和戊二醛制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤：

6.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

7.根据权利要求6所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，采用三维细胞培养支架进行体外培养的步骤为：取三维细胞培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰个/L细胞浓度与复溶后三维细胞培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。

9.根据权利要求4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，三维细胞培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂，且所述助溶剂的质量分数为5％-15％。

10.根据权利要求8所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。