CN105296423A

CN105296423A - 一种cd3ak细胞培养组合物及其培养方法

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Publication number: CN105296423A
Application number: CN201510846417.4A
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 王一飞; 葛啸虎; 李丽娟
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: CN105296423B

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方法。该CD3AK细胞培养组合物包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素、血清和基础培养基。本发明CD3AK细胞培养组合物可促进CD3AK细胞的大量增殖，并且提高其细胞的杀伤活性，避免了外源性蛋白及病毒的污染，大大降低了生产成本，且培养出来的CD3AK细胞纯度较高。

Description

一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方法。

背景技术

CD3AK细胞(anti-CD3antibodyinducedactivatedkillercells)是指淋巴细胞等单个核细胞经抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)激活后的杀伤细胞，在激活后，无需CD3McAb持续存在，小剂量外源性的IL-2就可以维持其活性增殖，是以CD3⁺CD8⁺T为主的异质性细胞群，其前体细胞来源丰富，主要是T细胞，以其存活时间长，较低的IL-2依赖性。

CD3AK细胞具有广谱杀瘤活性，其杀伤肿瘤细胞是以其伪足和突起与靶细胞紧密结合，靶细胞的死亡形式是凋亡和溶解坏死，其抗瘤作用优于LAK细胞，成为继LAK和TIL之后，肿瘤AIT研究中最受关注的肿瘤效应细胞。CD3AK细胞具有比LAK细胞和TIL更强的扩增及抗肿瘤能力，体外抗肿瘤能力比常规LAK高6～20倍，对NK细胞敏感和LAK细胞敏感的肿瘤细胞均有不同程度的杀伤效应。能够有选择地直接或间接杀伤肿瘤细胞，但对自体或异体转化的淋巴细胞和正常组织细胞没有杀伤活性，对人体没有毒副作用。CD3AK细胞能够第一时间纠正患者的免疫功能，提高肿瘤患者对手术、放疗和化疗的耐受，并且可以消灭残存肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长、分化、浸润，预防癌症复发有重要的意义，所以CD3AK细胞在肿瘤治疗方面有着重要的应用前景和价值。

目前，对于CD3AK细胞的培养技术主要是采用脐血分离淋巴细胞，经CD3McAb和IL-2诱导CD3AK细胞，加入胎牛血清。但该方法存在一定的缺陷，如虽然细胞扩增数量较大，但是细胞的杀伤活性较低。因此，急需提供一种既能大量扩增CD3AK细胞的数量，又能提高细胞的杀伤活性的CD3AK细胞培养方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方法。该CD3AK细胞培养组合物可促进CD3AK细胞的增殖，提高对肿瘤细胞的杀伤活力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种CD3AK细胞培养组合物，包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素、血清和基础培养基。

本发明将CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素、血清添加入基础培养基，培养CD3AK细胞，可促进CD3AK细胞的增殖，提高对肿瘤细胞的杀伤活力，且CD3AK细胞的纯度较高。

作为优选，组合物中各组分用量为：

在本发明提供的一些实施例中，本发明培养组合物中各组分用量为：

在本发明提供的另一些实施例中，本发明培养组合物中各组分用量为：

作为优选，基础培养基为RPMI-1640基础培养基。

作为优选，血清为自体血清。

本发明还提供了一种CD3AK细胞培养方法，包括如下步骤：

采用基础培养基将PBMC重悬，加入CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素和血清，进行细胞培养，每隔3天补液一次，获得CD3AK细胞。

作为优选，本发明CD3AK细胞培养方法中各组分用量为：

在本发明提供的一些实施例中，本发明组合物中各组分用量为：

在本发明提供的另一些实施例中，本发明组合物中各组分用量为：

作为优选，基础培养基为RPMI-1640基础培养基。

作为优选，血清为自体血清。

在本发明提供的一些实施例中，细胞培养的条件为37℃、浓度为5％的CO₂。

作为优选，PBMC的接种密度为(1～10)×10⁶个/mL。

在本发明提供的一些实施例中，PBMC的接种密度为1×10⁶个/mL。

在本发明提供的一些实施例中，补液为：补加基础培养基、CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素，CDMcAb终浓度为10～50μg/mL，IL-2终浓度为100～300U/mL，IL-15终浓度为10～30U/mL，田七皂苷终浓度为10～50mg/mL，汉黄芩素终浓度为0.2～6.0mg/L，补液后细胞密度在(0.5～1.0)×10⁶个/mL。

作为优选，细胞培养的天数为7～10天。

本发明提供了一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方法。该CD3AK细胞培养组合物包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素、血清和基础培养基。本发明至少具有如下优势之一：

1、本发明CD3AK细胞培养组合物可促进CD3AK细胞的大量增殖，并且提高其细胞的杀伤活性；

2、本发明采用自体血清来促进细胞的增殖，避免了外源性蛋白及病毒的污染；

3、本发明只需较低剂量的IL-2，大大降低了生产成本；

4、本发明培养方法培养出来的CD3AK细胞纯度较高。

附图说明

图1是本发明培养方法和传统培养方法培养的CD3AK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

CDMcAb：CD3AK细胞(anti-CD3antibodyinducedactivatedkillercells)是指淋巴细胞等单个核细胞经抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)激活后的杀伤细胞，在激活后，无需CD3McAb持续存在，小剂量外源性的IL-2就可以维持其活性增殖，是以CD3⁺CD8⁺T为主的异质性细胞群，其前体细胞来源丰富，主要是T细胞，以其存活时间长，较低的IL-2依赖性。

IL-2：即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，又名T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor，TCRF)。主要由活化的CD4⁺Th1细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。可促进Th0和CTL的增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。环孢素、他克莫司等免疫抑制剂可以抑制其活性和生成。

IL-15：即白细胞介素-15(interleukin-15，IL-15)，由多种细胞产生，生物学作用与IL-2相似。其细胞来源和靶细胞分布较IL-2广，故可能在不表达IL-2的部位发挥类似IL-2的效应。

田七皂苷：是从三七提取的三七皂苷，包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1等，能增加脑血管流量，扩张脑血管，改善血流动力学，降低脑缺血。

汉黄芩素：又名5,7-二羟基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮，是一种溶于有机溶剂而不溶于水的黄色针状结晶物。用小鼠切除的小肠实验表明有罂粟碱样的解痉作用，但作用较弱，约为罂粟碱的五分之一。大鼠口服可降低乙醇所致的甘油三酸酯水平。还具有抗癌作用、利尿作用。

外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)：即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。

本发明提供的CD3AK细胞培养组合物及其培养方法中所用CDMcAb、细胞因子、培养基、中药成分均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1CD3AK细胞的培养

1、外周血单个核细胞的分离

采集50～100mL的人外周血，将其与生理盐水按体积比1：1的比例混匀，将混匀后的血液混合液与淋巴细胞分离液按体积比2:1的比例缓慢的加至淋巴细胞分离液上层，3000rpm离心20min；

离心后离心管的从上到下看，分别为血浆、白膜层(即单个核细胞层PBMC)、淋巴细胞分离液、红细胞层，抽取PBMC层，将收集到的PBMC用生理盐水洗涤重悬后，1500rpm离心10min，重复洗涤两次，收集到PBMC；

2、CD3AK细胞的扩增培养

用1640培养基将收集到的PBMC重悬，按1×10⁶的密度接种于培养瓶中，添加CD3单克隆抗体(CDMcAb)、细胞生长因子IL-2和IL-15，终浓度分别为10μg/mL、100U/mL和10U/mL；再添加2％的自体血清(自体血清只需首次接种细胞时添加)，并加入田七皂苷10mg/mL、汉黄芩素0.2mg/L中药提取混合物。置于37℃，浓度为5％的CO₂培养箱中培养。

补液前细胞密度不大于3×10⁶个/mL，补液后细胞密度在0.5～1.0×10⁶个/mL，每隔3天补液，全量补加CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素，终浓度分别为10μg/mL、100U/mL和10U/mL、10mg/mL、0.2mg/L。培养到第7天时收集细胞。

实施例2CD3AK细胞的培养

1、外周血单个核细胞的分离

2、CD3AK细胞的扩增培养

用1640培养基将收集到的PBMC重悬，按1×10⁶的密度接种于培养瓶中，添加CD3单克隆抗体(CDMcAb)、细胞生长因子IL-2和IL-15，终浓度分别为50μg/mL、300U/mL和30U/mL；再添加20％的自体血清(自体血清只需首次接种细胞时添加)，并加入田七皂苷50mg/mL、汉黄芩素6.0mg/L中药提取混合物。置于37℃，浓度为5％的CO₂培养箱中培养。

补液前细胞密度不大于3×10⁶个/mL，补液后细胞密度在0.5～1.0×10⁶个/mL，每隔3天补液，全量补加CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素，终浓度分别为50μg/mL、300U/mL和30U/mL、50mg/mL、6.0mg/L。培养到第7天时收集细胞。

实施例3CD3AK细胞的培养

1、外周血单个核细胞的分离

2、CD3AK细胞的扩增培养

用1640培养基将收集到的PBMC重悬，按1×10⁶的密度接种于培养瓶中，添加CD3单克隆抗体(CDMcAb)、细胞生长因子IL-2和IL-15，终浓度分别为30μg/mL、200U/mL和20U/mL；再添加10％的自体血清(自体血清只需首次接种细胞时添加)，并加入田七皂苷30mg/mL、汉黄芩素3.0mg/L中药提取混合物。置于37℃，浓度为5％的CO₂培养箱中培养。

补液前细胞密度不大于3×10⁶个/mL，补液后细胞密度在0.5～1.0×10⁶个/mL，每隔3天补液，全量补加CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素，终浓度分别为30μg/mL、200U/mL和20U/mL、30mg/mL、3.0mg/L。培养到第7天时收集细胞。

实施例4指标检测

对本发明方法培养的CD3AK细胞进行各项指标检测，同时设置对照，试验组别设置如下：

实验组1：实施例1培养7天的CD3AK细胞；

实验组2：实施例2培养7天的CD3AK细胞；

实验组3：实施例3培养7天的CD3AK细胞；

对照组：除不添加中药提取混合物及自体血清外，其它操作与本发明方法相同。

1、细胞的活率检测

将培养后的CD3AK细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞活率，如表1。

表1细胞活率检测结果

组别	细胞活率
		实验组1	98.6％
实验组2	98.5％
		实验组3	99.1％
对照组	98.7％

从上述结果可以看出实验组的细胞活率与对照组相比无明显差异。

2、细胞扩增数量的检测

将培养后的CD3AK细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，细胞增殖倍数＝培养后收集到的细胞量/接种时的细胞量，结果如表2。

表2CD3AK细胞增殖倍数

组别	细胞增殖倍数
		实验组1	3750
实验组2	3900
		实验组3	4120
对照组	800

从上述结果可以看出各实验组培养后的细胞增殖数量，尤其是实验组3的增殖倍数最高，效果最佳，并且实验组的增殖数量均显著高于对照组。

3、细胞培养后对肿瘤细胞的杀伤活性检测

采用CCK-8法检测，取培养7天后的CD3AK细胞，调整其细胞浓度至1.0×10⁶/mL，作为效应细胞。以对数生长期的K562细胞为靶细胞，调整其密度为5.0×10⁴/mL，按效靶比分别为40:1、20:1、10:1、5:1的比例混合培养于96孔板中，同时设置单独的效应细胞孔、单独靶细胞孔和空白对照孔，每组3个复孔，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育24h，加入CCK-8试剂20μL，孵育4h后进行检测，采用酶标仪检测波长在450nm处测定OD值。杀伤活力的计算公式为：

CD3AK细胞的杀伤活性(％)＝[1-(实验孔OD值-单独效应细胞组OD值)/单独靶细胞OD值]×100％

杀伤活性检测结果见图1。

从图1的结果可以看出：各组CD3AK细胞对K562细胞的杀伤活性随效靶比的增高而增强，各实验组的CD3AK细胞杀伤活力无明显差异，实验组3的结果最佳，而对照组的CD3AK细胞在不同的效靶比时杀伤活力均低于各实验组。

4、细胞培养后免疫表型的(CD3AK细胞的纯度)检测

用流式细胞仪检测CD3⁺CD8⁺T细胞上CD107a的表达，将培养7天后的CD3AK细胞收集，用PBS洗涤一次，加入FITC-CD3和PerCP-Cy5.5-CD8、APC-CD107a抗体，室温避光孵育15min后，离心洗涤一次，用0.5mLPBS重悬，调整细胞密度为10⁶个/mL，用流式细胞仪检测，检测具有相应免疫表型的细胞比例(％)检测结果见表3：

表3免疫表型检测结果

组别	CD3⁺CD8⁺(％)	CD107a(％)
			实验组1	86.7±0.31	78.5±0.30
实验组2	85.1±0.33	76.9±0.42
			实验组3	89.3±0.40	81.6±0.30
对照组	70.4±0.5	65.7±0.51

从表3的结果可以看出，各实验组CD3AK细胞的纯度均显著高于对照组。

结论：

从上述各实验检测结果来看，实验组的结果都优于对照组，说明本发明的培养方法优于常规的培养方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种CD3AK细胞培养组合物，其特征在于，包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素、血清和基础培养基。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中各组分用量为：

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述基础培养基为RPMI-1640基础培养基。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述血清为自体血清。

5.一种CD3AK细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中各组分用量为：

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞培养的条件为37℃、浓度为5％的CO₂。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PBMC的接种密度为(1～10)×10⁶个/mL。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述补液为：补加基础培养基、CDMcAb、IL-2、IL-15、田七皂苷、汉黄芩素，CDMcAb终浓度为10～50μg/mL，IL-2终浓度为100～300U/mL，IL-15终浓度为10～30U/mL，田七皂苷终浓度为10～50mg/mL，汉黄芩素终浓度为0.2～6.0mg/L，补液后细胞密度在(0.5～1.0)×10⁶个/mL。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞培养的天数为7～10天。