CN105296384B - 一株短小芽孢杆菌n2及其应用 - Google Patents
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Abstract
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2及其应用，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11071，保藏日期为2015年7月10日。该菌对抗生素进行降解，避免了混合微生物之间的竞争，也避免了不同微生物代谢产物之间的拮抗作用，同时由于采用单一微生物材料，降解条件更容易控制，便于管理。修复环境时短小芽孢杆菌N2作为优势菌群进行投加，具有受环境干扰因素小，受限制条件少等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株耐重金属的可降解抗生素的微生物及其在环境修复中的应用。
背景技术
畜禽有机肥因富含有机质及农作物生长所需的氮、磷等营养物质而被广泛用于农业生产，作为农田土壤的肥力来源及改良剂。但由于大量含重金属元素的饲料添加剂和抗生素类兽药的使用，使畜禽有机肥成分发生了质的变化，而重金属和抗生素因其生物利用率较低，绝大多数会随粪尿排出，施入农田土壤后可能带来土壤的重金属和抗生素的复合污染。
微生物降解被认为是抗生素进入环境中最主要的降解途径。目前国内外有关抗生素降解微生物的研究有很多，如光合菌、乳酸菌、放线菌、酵母菌、发酵丝状菌、芽胞杆菌和硝化细菌等，但是有关能够耐受重金属环境的抗生素降解菌的报道还较少。
土壤重金属和抗生素复合污染具有隐蔽性、潜伏时间长、污染因子间相互作用的协同性的特点。土壤环境中的重金属元素化学性质稳定，不能被降解而逐渐蓄积，残留时间长，具有不可逆性。当土壤中的重金属离子含量较高时，会破坏微生物的生理结构，使其彻底丧失分解有机物、修复土壤的功能。还有研究表明，进入土壤的抗生素可能会影响土壤生物的生存和繁殖、代谢功能和种群数量等，使生物量、群落结构和生物多样性发生改变，从而影响土壤元素生物地球化学过程和自净化能力等。当重金属和抗生素在土壤中共存时，土壤重金属通过共选择作用能够驱动抗生素抗性基因并促进水平转移扩散，致使复合条件下的污染物的环境行为与非复合污染环境中的相比更加复杂。
因此，现有技术中缺少一种能够耐受各种重金属环境的抗生素降解菌。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供了一株耐重金属的对抗生素具有降解作用的短小芽孢杆菌N2及其应用，对有效的降解抗生素奠定了物质基础。
技术问题：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11071，保藏日期为2015年7月10日。
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2在降解抗生素中的应用。
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2在重金属环境下降解抗生素中的应用。
所述重金属为铜或锌中的至少一种。
所述抗生素为庆大霉素、新霉素、链霉素、氨苄青霉素、青霉素钠、头孢霉素、磺胺噻唑中的至少一种。
所述降解选择环境温度为25～35℃，环境pH值为6～8的条件下进行。
一种降解抗生素的组合物，有效成分为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上于30℃恒温培养箱中培养2d后，菌落呈圆形，不透明，乳白色，表面有褶皱，边缘部分光滑，在显微镜下观察为杆状。生理生化测试发现，菌株为革兰氏阳性菌，不能还原硝酸盐，柠檬酸盐试验为阳性，吲哚反应、甲基红反应和伏普试验均呈阳性反应，淀粉水解酶呈阴性反应，产硫化氢气体，过氧化氢酶呈阳性，葡萄糖发酵和甘露醇发酵试验为阳性，乳糖发酵呈阴性。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2测序结果在GenBank中进行BLAST比对分析，结果发现与菌株S3的16S rDNA序列相似性最高的是Bacillus pumilus，其相似性达到94％。结合其形态学和生理生化特征，可以初步确定N2为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2可降解庆大霉素、新霉素、链霉素、氨苄青霉素、青霉素钠、头孢霉素、磺胺噻唑中的一种或其混合物，而且可以在Cu2+、Zn2+中的一种或其混合物添加的培养基中生长繁殖。
有益效果：本发明使用单一的微生物短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2对抗生素进行降解，避免了混合微生物之间的竞争，也避免了不同微生物代谢产物之间的拮抗作用，同时由于采用单一微生物材料，降解条件更容易控制，便于管理。修复环境时短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2作为优势菌群进行投加，具有受环境干扰因素小，受限制条件少等优点。
本发明对未来修复重金属和抗生素复合污染的生态系统、降低抗生素的生态危害具有重要的现实意义。
附图说明
图1是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2与Genbank中其他菌株的16S rRNA基因序列所构建的系统发育树。
图2是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2在400mg/LZn2+存在时菌体生长曲线和头孢霉素降解曲线；
图3是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2在400mg/LZn2+存在时菌体生长曲线和庆大霉素降解曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明技术方案作进一步具体的说明，但本发明不局限于以下所列举具体实施方式。
实施例1
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.11071，保藏日期为2015年7月10日。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2可在pH值为6～8环境中生长；适宜生长温度为25～35℃。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上于30℃恒温培养箱中培养2d后，菌落呈圆形，不透明，乳白色，表面有褶皱，边缘部分光滑，在显微镜下观察为杆状。生理生化测试发现，菌株为革兰氏阳性菌，不能还原硝酸盐，柠檬酸盐试验为阳性，吲哚反应、甲基红反应和伏普试验均呈阳性反应，淀粉水解酶呈阴性反应，产硫化氢气体，过氧化氢酶呈阳性，葡萄糖发酵和甘露醇发酵试验为阳性，乳糖发酵呈阴性。
将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2培养于50mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，分别添加庆大霉素、新霉素、链霉素、氨苄青霉素、青霉素钠、头孢霉素、磺胺噻唑的浓度为32mg/L、32mg/L、128mg/L、64mg/L、64mg/L、64mg/L、64mg/L，Cu2+、Zn2+浓度分别为200mg/L、400mg/L，震荡培养箱中120r/min，30℃避光培养3天后对抗生素的降解率达90％以上。菌体生长曲线和抗生素降解曲线参见图2、图3。
实施例2
本实施方式按以下步骤分离获得短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2。在江苏科技大学桑园采集土壤样品。按5点取样法采样，然后将收集到的所有土壤混匀，风干，过100目筛，可得土壤样品。然后用300mg/kg硫酸铜及1000mg/kg硫酸锌处理84天后。称取土壤样品1g加入到99mL无菌生理盐水中，25℃120r/min摇床振荡2h制成土壤10-4稀释液备用。取稀释液涂布平板，30℃培养2-4d。所述平板培养基为基础无机盐(MSM)培养基(g/L)：K2HPO45.8，KH2PO4 4.5，(NH4)2SO4 2.0，MgCl2 0.16，CaCl2 0.02，Na2MoO4·2H2O 0.0024，FeCl30.0018，MnCl2·2H2O 0.0015，琼脂18g，pH＝7.0，于121℃湿热灭菌20min。灭菌冷却至50℃左右时，向其中分别添加庆大霉素、新霉素、链霉素、氨苄青霉素、青霉素钠、头孢霉素和磺胺噻唑使其终浓度分别达到32mg/L、32mg/L、128mg/L、64mg/L、64mg/L、64及64mg/L，Cu2+、Zn2+浓度分别为200mg/L、400mg/L。挑取平板上的单菌落进行划线分离纯化，所用培养基仍为添加相应浓度的抗生素培养基。后经过3次单菌落划线培养，即得到耐Cu2+、Zn2+的抗生素抗性菌株。对该菌株进行生理生化鉴定及分子鉴定。将其命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)N2。
实施例3
本实施方式耐重金属的抗生素降解菌短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2，可用于重金属污染环境中抗生素的降解。
在受重金属和抗生素复合污染的环境中投加短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2，选择环境温度为25-35℃，环境pH值为6-8的条件下进行。本实施方式短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2可用于受污染的土壤或水体修复。
选取庆大霉素、新霉素、链霉素、氨苄青霉素、青霉素钠、头孢霉素和磺胺噻唑使其终浓度分别达到32mg/L、32mg/L、128mg/L、64mg/L、64mg/L、64及64mg/L，Cu2+、Zn2+浓度分别为200mg/L、400mg/L的复合污染土壤100g，将培养于牛肉膏蛋白胨液体培养基处于静止期初期的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2以20mL/kg比例，喷洒到模拟受重金属和抗生素复合污染的土壤中，加入3天后土壤中的抗生素含量开始明显下降。经一周的降解，土壤中抗生素仅有微量检出，说明短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2可有效地降解这些抗生素污染物。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2同样可以修复受污染水体，实验室水体修复效果与土壤修复过程基本相近。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11071，保藏日期为2015年7月10日。
2.权利要求1所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2在降解抗生素中的应用。
3.权利要求1所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)N2在重金属环境下降解抗生素中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述重金属为铜或锌中的至少一种。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述抗生素为庆大霉素、新霉素、链霉素、氨苄青霉素、青霉素钠、头孢霉素、磺胺噻唑中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述降解选择环境温度为25～35℃，环境pH值为6～8的条件下进行。
7.一种降解抗生素的组合物，其特征在于有效成分为权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)N2。
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