CN105294773B - 一种离子型磷光铱配合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种离子型磷光铱配合物及其制备方法和应用，具体涉及一类用于检测L‑抗坏血酸的磷光铱配合物。该类配合物材料由环金属配体，金属中心和氮氧自由基修饰的辅助配体组成，结构通式如下式所示。由于所述铱配合物具有低生物毒性、容易进入细胞浆中以及长的磷光发射寿命，因此其在抗坏血酸检测、细胞成像及时间分辨技术方面有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于有机光电功能材料技术领域，具体涉及一种含氮氧自由基的磷光铱配合物材料及其制备方法和应用。
技术背景
维生素C，又称抗坏血酸(AA)，是一种具有抗氧化作用的有机酸，也是生命所必需的一种水溶性营养物，它作用于多项人体机能。在人的生理环境中，抗坏血酸不仅作为一种辅酶因子，也是与神经递质相关酶的一种重要的组成成分，并且在维持正常细胞的生长以及调控胆固醇和甘油三酯的合成等生理活动中发挥重要作用。缺乏维生素C将导致坏血病或引发中风等心血管疾病，但是研究表明过量摄入维生素C也会导致腹泻、胃酸过多症和肾脏结石。
目前检测抗坏血酸的方法众多，液相色谱法、分光光度法、ESR光谱法以及电化学的方法，但是以上的方法各自存在一些不足之处，比如液相色谱法的操作步骤复杂且时间较长，分光光度法因其检测中影响因素较多导致准确性差，ESR光谱法则存在成本较高，数据处理难度大的问题，电化学的方法也因与抗坏血酸氧化还原电位类似的尿酸等物质干扰大，以致检测的灵敏性较差。
目前实现抗坏血酸检测的探针多为荧光染料，然而，这些有机分子由于光稳定性差，背景荧光干扰大，细胞毒性大等缺点限制了其在生物成像领域的应用。相比于荧光检测信号，磷光铱配合物除了能应用其自旋—轨道耦合提高电致发光的量子效率外，其相对较长的磷光寿命使之成为一种非常理想的生物荧光成像标记染料。由于不同于有机分子，磷光过渡金属铱配合物具有以下几大特点：具有较大的Stokes位移和较长的发射寿命，长的发射寿命有利于使用时间分辨技术使磷光信号与背景的荧光信号区分开，具有优越的光稳定性便于长时间观测。
由此可见，找到一种稳定性更好、细胞毒性更低的可用于生物体检测的长寿命抗坏血酸检测探针是本领域亟待解决的问题。
发明内容
1、技术问题
为了克服现存技术中，荧光探针光稳定性差、细胞毒性大等问题，本发明提供了一类可用于检测抗坏血酸的磷光发射的铱配合物。
本发明的另一目的在于给出所述磷光发射铱配合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提出所述磷光发射铱配合物在抗坏血酸检测、生物标记与细胞成像领域中的应用。
2、技术方案
本发明提供了一种离子型磷光铱配合物，所述铱配合物的辅助配体上含有氮氧自由基，该铱配合物具有如下结构通式：
其中，C^N配体为下列结构中的一个：
本发明还提供了一种所述离子型磷光铱配合物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)4,4’-二甲基-2,2’-联吡啶经过氧化、甲氧基化、酯的还原、氢溴酸取代四步反应得到N^N辅助配体；
(2)将所述步骤1得到的辅助配体与铱二氯桥((C^N)2Ir(μ-Cl)2Ir(C^N)2)通过配位反应制备得到配合物中间体，其中C^N为所述C^N配体中的一种；
(3)将所述步骤2得到的配合物中间体与4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基以及碳酸钾粉末溶解于N-甲基吡咯烷酮溶液中反应，得到目标铱配合物。
本发明还提供了一种所述离子型磷光铱配合物在抗坏血酸检测上的应用。
所述离子型磷光铱配合物还可用于细胞成像和时间分辨技术上。
3、有益效果
本发明合成的材料用作抗坏血酸检测磷光探针，在抗坏血酸存在下磷光发射增强，为turn-on型磷光探针，检测效果显著。
本探针材料具有低生物毒性，且容易进入细胞胞浆中，长的磷光发射寿命可使用时间分辨技术与背景荧光信号相区分以降低信噪比，使得这类探针可通过寿命成像和时间门技术成像实现细胞内抗坏血酸检测，提高检测精度。
附图说明
图1为实施例2中配合物Ir-2[Ir(ppy)2-bpy-NO]+PF6 -的MALDI-TOF谱图；
图2为实施例3中磷光探针Ir-2在PBS缓冲溶液中的磷光发射光谱对抗坏血酸(Vc)的响应性；
图3为实施例3中磷光探针Ir-2在PBS缓冲溶液中的磷光发射强度与初始强度比与不同当量抗坏血酸(Vc)的线性拟合曲线；
图4为实施例4中磷光探针Ir-2在PBS缓冲溶液中的寿命对抗坏血酸的响应性。
图5为实施例5中磷光探针Ir-2应用于活细胞抗坏血酸检测的共聚焦成像照片。
具体实施方式
为了更好地理解本发明专利的内容，下面通过具体的实例来进一步说明本发明的技术方案。但这些实施实例并不限制本发明。
实施例1：配合物Ir-1[Ir(ppy)2-bpy-Br]+PF6 -的合成
(1)4,4’-二溴甲基-2,2’-联吡啶的合成
Ⅰ)氧化：取4,4’-二甲基-2,2’-联吡啶5g加入带搅拌子的250mL单口瓶，加入80mL浓H2SO4置于水浴条件下剧烈搅拌，缓慢(保证温度不会剧烈上升)加入17g K2Cr2O7，然后将其置于65℃搅拌6h，冷却至室温，加水抽滤，干燥得白色粉末。Ⅱ)甲氧基化：取Ⅰ所得产物2g与10mL H2SO4，100mL CH3OH加入带搅拌子的单口瓶中，105℃回流过夜，反应结束加至大量水中出现白色絮状沉淀，加入NaOH溶液调pH约9.0，用CH2Cl2萃取保留有机相，无水Na2SO4干燥，旋尽溶剂得到白色晶体，产率88％。Ⅲ)酯的还原：取Ⅱ所得产物630mg与NaBH41g加入带搅拌子的250mL单口瓶中，加入80mL重蒸的乙醇溶液，80℃回流3h，反应结束加入20mL饱和NH4Cl溶液，旋除乙醇，用乙酸乙酯与水进行萃取，保留乙酸乙酯层，加无水Na2SO4干燥，旋除溶剂，真空干燥得到白色粉末。Ⅳ)氢溴酸取代：取Ⅲ中所得中间产物100mg，6mL 48％HBr溶液加至带搅拌子的单口瓶，缓慢加入9mL浓H2SO4，原料溶解，置于100℃油浴搅拌锅中回流6h，反应结束，加入少量水，边搅拌边加KOH调pH至7.0，产生白色沉淀，抽滤，CH2Cl2溶解产物，用无水Na2SO4干燥，过滤旋除溶剂，真空干燥得到4,4’-二溴甲基-2,2’-联吡啶，产率45％。
(2)配合物Ir-1[Ir(ppy)2-bpy-Br]+PF6 -的合成
取苯基吡啶合铱氯桥二聚体200mg，140mg 4,4’-二溴甲基-2,2’-联吡啶，六氟磷酸钾(KPF6)300mg，二氯甲烷20mL，无水甲醇10mL，依次加入带搅拌子的两口烧瓶中，通氮气，回流搅拌24h，用二氯甲烷稀释反应液，过滤得橙红色二氯甲烷澄清液，减压旋干后，用二氯甲烷/乙酸乙酯(V:V＝20:1)柱层析得橙色粉末即为铱配合物Ir-1，产率86％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):8.65(m；2H)；7.91-7.88(m；4H)；7.76(t；J＝8.00Hz；2H)；7.68(d；J＝7.60Hz；2H)；7.53-7.51(m；3H)；7.46(dd；J1＝1.20Hz；J2＝5.60Hz；1H)；7.09-7.02(m；4H)；6.92(t；J＝7.20Hz；2H)；6.27(d；J＝7.60Hz；2H)；4.80(s；2H)；4.63(s；2H)。
(3)配合物Ir-2[Ir(ppy)2-bpy-NO]+PF6 -的合成
称取铱配合物Ir-1(1mmol)，4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基(3mmol)和过量碳酸钾粉末加入带搅拌子的双颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。注入5mL蒸过的N-甲基吡咯烷酮溶液，80℃搅拌回流10h。反应结束后，用石油醚沉降除去溶剂，二氯甲烷溶解浓缩提纯，得到红色固体产物即为铱配合物Ir-2。
[m/e](M,MALDI-TOF)理论值:1023.32，实验值:1023.06，如图1所示。
实施例2：磷光探针Ir-2的发射光谱对抗坏血酸的响应性
将铱配合物Ir-2配成1.0×10-2mol/L的DMSO溶液，移取10μL溶液到1000μL PBS缓冲溶液中，使其浓度稀释至1.0×10-5mol/L进行测试，逐次加入抗坏血酸(或称Vc)水溶液，每次滴加抗坏血酸后，在37℃恒温水浴中加热搅拌5分钟，使抗坏血酸与铱配合物Ir-2充分反应，随后测试其荧光发射光谱，如图2所示。在614nm处，铱配合物Ir-2溶液本身发光很弱，随着抗坏血酸的加入，铱配合物Ir-2溶液的荧光光谱发生了变化，伴随着抗坏血酸滴加浓度的升高，铱配合物Ir-2的荧光强度逐渐升高并发生蓝移。当抗坏血酸的滴加浓度当量达到4eq.时，滴定达到终点，再继续滴加抗坏血酸，光谱则不再发生变化。配合物Ir-2的磷光发射强度与初始强度比与不同当量抗坏血酸(Vc)的线性拟合曲线如图3所示。
实施例3：磷光探针Ir-2的寿命对抗坏血酸的响应性
将铱配合物Ir-2配成1.0×10-2mol/L的DMSO溶液，移取10μL溶液到1000μL PBS缓冲溶液中，使其浓度稀释至1.0×10-5mol/L进行测试，加入抗坏血酸前测试配合物Ir-2的寿命，继而向Ir-2的PBS缓冲液中加入超过反应当量的抗坏血酸溶液，充分反应再次进行寿命测试，配合物前后的寿命变化如图4所示。
实施例4：磷光探针Ir-2应用于活细胞成像实验
Hela细胞按照American Type Tissue Culture Collection规定进行培养。Hela细胞用20μM铱配合物Ir-2溶液在37℃下孵育30分钟，用培养液洗涤3次，配合物Ir-2标记的Hela细胞分别用低浓度和高浓度抗坏血酸(Vc)溶液在37℃条件下各孵育30分钟，之后均用培养基洗涤3次，用405nm波长激发细胞进行共聚焦成像，照片显示活细胞胞浆内有明显可见的磷光，且高浓度抗坏血酸孵育的Hela细胞中的磷光强度比低浓度孵育的细胞中的磷光强度高，如图5所示，此结果表明磷光探针Ir-2具有较好的细胞穿透性，主要分布在细胞质区域，可用于活细胞内抗坏血酸检测，且磷光探针本身的寿命比自发荧光寿命长，而细胞内的磷光探针与待检测物作用之后的寿命变长，在自发荧光衰减之后再测定磷光探针寿命的信号，即可应用时间分辨技术实现较高灵敏度的检测。
Claims (1)
1.一种离子型磷光铱配合物，其特征在于，所述铱配合物的辅助配体上含有氮氧自由基，该铱配合物具有如下结构通式：
其中，C^N配体为下列结构中的一个：
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