CN105294695A

CN105294695A - 一种分离自臭辣树的化合物及其抗虫用途

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Publication number: CN105294695A
Application number: CN201510592092.1A
Authority: CN
Inventors: 刘志龙; 刘昕超; 刘奇志; 石旺鹏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2015-09-17
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-09-17
Also published as: CN105294695B

Abstract

本发明涉及分离自臭辣树的化合物及其抗虫用途。所述化合物具有杀线虫活性，其结构式如图1所示。制备方法为：以臭辣树为原料进行分离提纯，所述分离提纯包括乙醇浸提、三氯甲烷萃取和硅胶柱层析。以本发明化合物或其盐为活性成分制备抗虫制品，可有效杀灭线虫，与杀线虫化合物呋喃丹的活性相当。由于本发明分离获得的新化合物是从臭辣树植物中提取而得，在自然条件下易分解，因此不会引起生物富集现象，并且对人畜安全，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。

Description

一种分离自臭辣树的化合物及其抗虫用途

技术领域

本发明涉及植物病害防治技术，具体涉及分离自臭辣树的化合物及其抗虫用途。

背景技术

臭辣树(Tetradiumglabrifolium)，芸香科四数花属，为落叶乔木，多生于向阳的山坡地上，湿润树丛中，分布于江西、浙江及长江上、下游各地。臭辣树以果入药，主治麻疹后咳嗽。目前对于臭辣树果实的认识仅仅是具有药用活性，未曾有研究报道过臭辣树果实的抗虫活性。

南方根结线虫(Meloidogyneincognita)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫，雌雄异体，主要危害各种蔬菜的根部，表现为侧根和须根较正常增多，并在幼根的须根上形成球形或圆锥形大小不等的白色根瘤，有的呈念珠状，被害株地上部分生长矮小、缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。目前，对南方根结线虫的防治主要采用化学防治的方法，常用杀线虫剂多为有机磷或氨基甲酸酯类的单剂或复配制剂，如噻唑磷、硫线磷、涕灭威、克百威等。化学防治在根结线虫的防治过程中占有重要地位，见效快、防效好，是果农、菜农深受青睐的方法。但目前使用的化学杀线剂存在毒性大、环境污染严重、易产生抗药性等诸多问题。因此,随着农民环保意识的增强和线虫抗药性的增加，化学杀线虫剂的应用前景黯淡。因此，需要开发一种毒性小、不易使线虫产生抗药性的环保型药物，提高蔬菜的产量和品质，保护人类健康。

发明内容

为满足上述领域的需求，本发明提供一种从臭辣树的乙醇浸膏中分离的新化合物，该化合物能够有效杀灭根结线虫。本发明请求保护的技术方案如下：

如式(I)所示的化合物：

权利要求1所述的化合物与无机酸或有机酸形成的盐。

权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在防治线虫中的用途。

权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在制备抗虫制品中的用途。

一种抗虫制品，其特征在于，其抗虫活性成份包含权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐。

所述抗虫制品的制备方法，包括以下步骤：以臭辣树为原料进行分离提纯并获得权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐。

所述分离提纯包括采用乙醇浸提、三氯甲烷萃取和硅胶柱层析。

臭辣树在防治线虫中的用途。

一种抗虫制品，其特征在于，其药效成分为臭辣树的乙醇浸膏。

本发明提供一种新化合物，其结构如图1所示，所述新化合物是采用硅胶柱层析方法从臭辣树乙醇浸膏中分离而得。经鉴定，该化合物是一种生物碱，为无色针状结晶，碘化铋钾反应显阳性，分子式为C₁₇H₁₅N₃O，分子量为277，其化学命名是7,8,13,14-tetrahydrobenzo[3,4][1,5]diazonino[6,7-b]indol-5(6H)-one。将所述化合物对南方根结线虫二龄幼虫进行室内毒力测定，结果表明该化合物具有杀线虫活性。与杀线虫化合物呋喃丹相比，新化合物的LD₅₀是阳性对照呋喃丹的1.8倍，与阳性对照的杀线活性相当，有望成为新一代生物农药。

本发明分离获得的新化合物，可使用二甲苯、甲苯、C₁₀芳烃、乙醇、乙腈等作为溶剂，加入吐温、甘油等作为助溶剂，制成抗虫制品，用于杀灭线虫，提高蔬菜的产量和品质。由于本发明分离获得的新化合物是从臭辣树植物中提取而得，在自然条件下易分解，因此不会引起生物富集现象，并且对人畜安全，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。在本发明的一些实施例中，所述抗虫制品也可以包含化学上相容的其它的本领域已知的具有抗虫活性的化合物，从而增强抗虫效果。

在本发明的一些实施例中，将本发明的新化合物与无机酸或有机酸形成生理上可接受的盐，使化合物结构更加稳定，有利于保存和制备抗虫制品，发挥抗虫活性。

实验证明，臭辣树的乙醇浸膏也具有杀线虫活性，可将其粗提物直接用于杀灭线虫，或与适合的溶剂及辅助试剂一起制成抗虫制品。在本发明的一些实施例中，可以将臭辣树的乙醇浸膏与本领域公知的具有杀虫活性的其它化合物同时使用，发挥综合的抗虫作用。

附图说明

图1.式(I)化合物的结构式

图2.式(I)化合物的¹H-NMR谱图

图3.式(I)化合物的¹³C-NMR谱图

图4.式(I)化合物的HMBC谱图

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施方式仅作为解释说明，而不构成对本发明保护范围的任何限制。

生物材料：

臭辣树：采自浙江温州丽水。

南方根结线虫：为中国农业大学昆虫系人工饲养。

实验仪器：

BrukerACF300和AMX500超导核磁共振仪，瑞士Bruker公司；

玻璃色谱柱：直径与长度85×550mm，40×400mm、35×400mm、30×400、25×400mm、20×350mm，购于北京博美玻璃有限公司。

材料与试剂：

层析硅胶(200-300目)采自青岛海洋研究所；

薄层层析硅胶板(GF254)购于青岛海洋化工有限公司；

石油醚、乙酸乙酯、乙醇、丙酮等均购自国药集团化学试剂有限公司；

95％酒精采购自北京广达恒益有限公司。

本实施例未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可通过本领域常规方法配制而得，或商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、式(I)化合物的分离

1、臭辣树乙醇浸膏的制备

将干燥的臭辣树果实依次用95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和蒸馏水分别浸泡3天，在50℃水浴锅中旋转蒸发器浓缩至没有酒精流出，然后经过三氯甲烷萃取，将水相弃去，留三氯甲烷相在40℃水浴锅中进行减压蒸发浓缩至没有酒精流出，除去三氯甲烷，即得到三氯甲烷萃取物，即本发明中的臭辣树果实乙醇浸膏。

2、提取物的一级硅胶柱层析分离

(1)确定起始洗脱剂

首先采用薄层层析确定起始洗脱剂，具体步骤为：取1μL步骤1获得的乙醇浸膏，用丙酮稀释，用毛细管点样于GF254薄层色谱板上，在层析缸中加入1mL按一定比例配比(100:2～0:100)的石油醚:乙酸乙酯洗脱剂。将点好样品的薄层板放入展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.3～0.5cm，盖上缸盖，待展开至距薄层板上沿0.5～1.0cm时，取出薄层板，用电吹风吹干溶剂，在紫外灯下观察展开情况，并将薄层板放入碘缸中显色，当最前沿斑点的Rf值在0.2～0.3时，即可确定此展开剂为起始洗脱剂。最后确定的起始洗脱剂的石油醚:乙酸乙酯配比是100:2。

(2)装柱

采用湿装法装柱，将玻璃色谱柱(85×550mm)垂直固定在铁架台上，在柱的下端塞少许脱脂棉花，倒入一药匙石英砂，防止硅胶泄漏。将200～300目硅胶放入烧杯中，加入适当量的起始洗脱剂，经充分搅拌，将硅胶内的气泡除去后再加入柱内，一边沉降一边添加。硅胶加完后，仍使起始洗脱剂流一段时间，然后使色谱柱中高于硅胶面上的起始洗脱剂几乎全部流入接受瓶内。然后用橡皮塞在色谱柱外敲打，将硅胶柱内的气泡赶净。色谱柱装好后，使其静置过夜，以压实硅胶，提高分离效果。

(3)加样

样品的加入，采用干法加样。待硅胶柱静置过夜后，先将色谱柱中硅胶面上的多余洗脱剂放出。用丙酮溶解样品，加入适当量的200-300目硅胶拌匀，用吹风机吹干溶剂成粉末状，用小勺将拌匀后的样品缓慢加入色谱柱中。样品加入后，用滴管吸取少量起始洗脱剂缓缓冲洗色谱柱壁，打开活塞将洗脱剂慢慢放出，待柱面上没有洗脱剂时，将一块脱脂棉平铺于柱面，压上玻璃棒，防止加入洗脱剂时破坏色谱柱面，加入洗脱剂后，开始分离。

(4)洗脱

洗脱剂采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇，按极性从小到大梯度洗脱(100:2:0,100:5:0,100:10:0,100:20:0……100:100:0,100:100:2,100:100:5……100:100:50)，采用等馏分收集法(500mL)收集，使用旋转蒸发仪回收溶剂，在回收过程中将馏分经薄层层析(TLC)检验后将成分相同或相似者合并。洗脱时先加起始洗脱剂，每个洗脱剂梯度一般收集5-6个500mL馏分，按从小到大增加洗脱剂(石油醚：乙酸乙酯：无水乙醇)极性。加到50％无水乙醇后，当收集5-6个收集瓶后，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，收集5-6个收集瓶时，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入水洗脱，洗脱下来的溶液用三氯甲烷萃取，萃取液经旋转蒸发仪回收试剂。臭辣树乙醇浸膏经一级柱层析分离，并通过薄层层析检测合并相同的组分，然后继续进行细分离。

3、提取物的二级硅胶柱层析分离

(1)确定起始洗脱剂：采用薄层层析检验，确定各部分起始洗脱剂，方法同一级硅胶柱层析分离。

(2)装柱：采用湿法装柱，玻璃色谱柱规格为35×400mm，30×400mm，40×400mm，其余同一级硅胶柱层析分离。

(3)加样：样品的加入，采用干法加样，方法同一级硅胶柱层析分离。

(4)洗脱：二级柱层析分离采用等梯度洗脱，按等馏分收集法(150mL)收集，使用旋转蒸发仪回收溶剂，经薄层层析(TLC)检验后将成分相同或相似者合并。当活性成分成功洗脱后，洗脱液不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，收集4-5个收集瓶后，洗脱液不再倒回色谱柱内，直到没有洗脱液可收集。

4、NMR和MS分析

将样品用氘代氯仿(CDCl3)溶解，加入核磁管，由北京师范大学分析测试中心核磁共振实验室应用BrukerDRX500核磁共振波谱仪测定¹H-NMR，¹³C-NMR和HMBC。由北京师范大学放射性药物教育部重点实验室应用QuattroMicro串联四级杆质谱仪测定ESI。

实验结果：

NMR和MS的测定结果如下所示，分析鉴定出的新结构化合物是一种生物碱，为无色针状结晶，碘化铋钾反应显阳性，分子式为C₁₇H₁₅N₃O，分子量为277，其结构如图1所示，化学命名为7,8,13,14-tetrahydrobenzo[3,4][1,5]diazonino[6,7-b]indol-5(6H)-one。

mp:223-225℃；ESI-MSm/z:579.29[2M+Na]+，301.14[M+Na]+；¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ(ppm):3.26(2H,dd,J＝6.8、6.4Hz,6-H),4.61(2H,dd,J＝6.8、6.4Hz,5-H),7.20(1H,t,J＝7.5Hz,10-H),7.35(1H,t,J＝7.5Hz,11-H),7.45(1H,d,J＝8.0Hz,9-H),7.46(1H,t,J＝7.8Hz,18-H),7.65(1H,d,J＝8.0Hz,12-H),7.66(1H,d,J＝8.0Hz,16-H),7.71(1H,t,J＝8.0Hz,17-H),8.33(1H,d,J＝8.0Hz,19-H),9.54(1H,brs,N-H).¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ(ppm):19.7(C-6),41.2(C-5),112.1(C-12),120.2(C-10),120.2(C-20),120.6(C-7),120.6(C-9),125.3(C-11),126.3(C-8),126.6(C-18),127.4(C-19),127.4(C-16),134.8(C-17),138.9(C-13),145.1(C-2),145.1(C-15),161.1(C-1).

实施例2、式(I)化合物及臭辣树乙醇浸膏对南方根结线虫的毒力测定

试验药物：实施例1中获得的式(I)化合物及臭辣树乙醇浸膏。

试虫：南方根结线虫。

试验方法：

以无水乙醇为溶剂配制浓度为10mg/250μL的式(I)化合物母液备用。试验中用含有1％无水乙醇的蒸馏水溶液作为稀释剂，配制浓度分别为400ppm、200ppm、100ppm、50ppm、25ppm的式(I)化合物溶液各4ml，每个浓度重复三次。将试虫放置在24孔培养板内，每孔放入40-60头均一大小的南方根结线虫。记录放入活虫数，每个重复加入1mL已配制好的式(I)化合物溶液，加入溶液时从培养板边沿缓慢加入，以免对试虫造成不利影响。将培养板置于温度为25℃恒温培养箱内，72h后检查活虫数，即得死亡虫数。判断方法为：卷曲或者游动均为活。利用SPSS软件计算得到式(I)化合物的致死中浓度。以呋喃丹作为阳性对照。

臭辣树乙醇浸膏的毒力测定步骤与化合物相同，只是母液配制为20mg/250μL，并稀释为800ppm、400ppm、200ppm、100ppm、50ppm。

死亡率(％)＝100×死虫数/试虫数

校正死亡率(％)＝100×处理组死亡率-对照组死亡率/1-对照组死亡率

半致死剂量(LD₅₀)即引起50％试虫死亡率的剂量，使用Probit软件包计算得到半致死剂量。

实验结果：

式(I)化合物对南方根结线虫的毒性测定结果如表1所示。

表1式(I)化合物及对南方根结线虫的毒性

处理	测试浓度(μg/mL)	LD₅₀(μg/mL)	95％置信区间	Χ²(卡方值)
					乙醇浸膏	50.0-800.0	292.08	260.37-328.28	9.50
新化合物	25.0-400.0	130.62	100.24-174.21	4.22
					呋喃丹	25.0-400.0	72.29	37.86-117.97	13.57

呋喃丹作为阳性对照对根结线虫的LD₅₀为72.29μg/mL，新化合物的LD₅₀是阳性对照呋喃丹的1.8倍，与阳性对照的杀线活性相当。从表1可以看出，臭辣树的乙醇浸膏也具有杀线虫活性。

本发明分离获得的式(I)化合物是从臭辣树植物中提取，在自然条件下易分解，不会引起生物富集现象，并且对人畜安全，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。

Claims

1.如式(I)所示的化合物：

2.权利要求1所述的化合物与无机酸或有机酸形成的盐。

3.权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在防治线虫中的用途。

4.权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在制备抗虫制品中的用途。

5.一种抗虫制品，其特征在于，其抗虫活性成份包含权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐。

6.权利要求5所述的抗虫制品的制备方法，包括以下步骤：以臭辣树为原料进行分离提纯并获得权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐。

7.根据权利要求6所述的制备方法，所述分离提纯包括采用乙醇浸提、三氯甲烷萃取和硅胶柱层析。

8.臭辣树在防治线虫中的用途。

9.一种抗虫制品，其特征在于，其药效成分为臭辣树的乙醇浸膏。