CN105294666B - 一种丹参素衍生物及其制备方法和医药应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丹参素衍生物及其制备方法和医药应用。所述丹参素衍生物具有通式I的结构：

Description

一种丹参素衍生物及其制备方法和医药应用

技术领域

本发明属于药物领域，涉及一种丹参素衍生物及其制备方法和医药应用。

背景技术

心脑血管疾病，包括例如冠心病、心绞痛、心肌梗塞、脑梗塞、脑痴呆和脑出血，是一种严重威胁人类尤其是中老年人健康的常见病。因此，研究开发新的预防和治疗心脑血管疾病药物是非常必要的。

丹参素(DSS)为中药丹参的主要活性成分之一。丹参在我国很早就被用作治疗心血管疾病，具有活血化淤等作用。天然丹参素是右旋体，在临床上广泛应用于治疗心血管病、改善心功能、冠脉循环、抗凝血、改善微循环等。丹参素不仅在治疗心脏疾病方面有明确的疗效，还具有抗炎、抗肿瘤、抗脑血栓和保肝等作用。

丹参素结构中有邻二酚羟基及α-羟基羧酸的结构，非常容易发生氧化变质，给保管与贮藏带来不便。丹参素结构中的极性基团，能够和葡萄糖醛酸等键合随尿液排出体外，故其体内的半衰期非常短，生物利用度仅为9.53-14.18％，需要反复给药，限制了临床应用(王庭芳，药学实践杂志，29(2)：83-87，2011)。

川芎嗪(又称四甲基吡嗪，tetramethylpyrazine，TMP)是从中药伞形科植物川芎中提取的生物碱，是川芎的有效成分之一，广泛用于心脑血管疾病(Liao,et al.,Neurosci.Lett.372:40-45,2004；Guo,et al.,Planta Med.47(2):89,1983)。TMP药理活性很多，与治疗缺血性脑中风相关的研究主要集中在以下几个方面：TMP抗凝作用明显。TMP可以明显抑制LPS诱导的PAI-1蛋白及其mRNA在内皮细胞的表达(Song,et al.,ChineseMedical J.113:136,2000)。TMP低剂量时抑制磷脂肌醇的分解和TXA₂的形成，高剂量时通过结合糖蛋白IIb/IIIa抑制血小板聚集(Sheu,et al.,Thromb Res.88:259,1997)。

TMP可以直接溶栓。大鼠动脉和静脉血栓模型均证明TMP具有抗血栓作用(Liu andSylvester,Thromb Res.58:129,1990)，其抗血栓作用可能与TMP抑制血小板活性有关，包括抑制胞内Ca²⁺活性，抑制磷酸二酯酶活性，提高胞内cAMP水平以及减少血小板表面糖蛋白IIb/IIIa的暴露等(Liu and Sylvester,Thromb Res.75:51,1994)。TMP可以显著降低ADP诱导的急性肺栓塞小鼠死亡率，静脉注射TMP可以显著延长肠系膜动脉切断大鼠的流血时间达1.5倍，证明TMP具有显著的体内抗血栓活性(Sheu et al.,Thromb Res.88:259,1997)。

TMP保护神经细胞作用明显。TMP显著改善MCAo引起的大鼠脑细胞缺血损伤，TMP显著清除人中性粒细胞产生的自由基。TMP还通过调节Bcl-2和Bax表达减少细胞调亡从而保护神经细胞(Hsiao,et al.,Planta Med.72:411-417,2006；Kao,et al.,NeurochemInt.48:166,2006)。

TMP是一种钙通道阻滞剂，对平滑肌的松弛作用与异搏定特性相似，再灌注时，川芎嗪可抑制钙内流，显著改善脑缺血后再灌注的能量代谢、电生理及线粒体功能，有效保护神经元。其涉及的机制包括了促进钾通道开放，抑制钙离子内流，抑制自由基生成，超氧化物歧化酶(SOD)活性增强，抑制脂质过氧化反应，抑制炎症反应(Zhu,et al.,Eur JPharmacol.510:187,2005)。

H₂S是继发现一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后，人们开始关注的一种新的气体信号分子。H₂S是含硫氨基酸代谢产物，生理浓度H₂S对神经系统特别是海马的功能具有调节作用，并可以调节消化道和血管平滑肌张力。作为一种气体递质，H₂S不借助任何特殊的运输工具就可以快速通过细胞膜，可以对一系列生物靶点施加生物影响，产生细胞毒性效应和细胞保护作用。实验表明，向健康人体中注入低剂量的H₂S是没有危险的。越来越多的证据表明H₂S抑制剂或者H₂S供体对各种动物模型的发炎、再灌注损伤和循环性休克具有重要的影响。

H₂S在细胞内的产生途径

内源H₂S通常是在胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)两种酶催化作用下由L-半胱氨酸产生的(Szabo,Nat.Rev.Drug Discov.,6:917,2007)。也可以由L-蛋氨酸的硫化作用内源合成，而高半胱氨酸在此过程中作为中间体，半胱氨酸是由蛋氨酸代谢生成(Mancardi et al.,Biochim et Biophys Acta,1787:864,2009)。大部分组织器官都能产生H₂S，但主要由脑、心血管系统、肾和肝等器官产生，在心血管系统中(主要是肺动脉、主动脉、肠系膜动脉、尾动脉以及门静脉等血管的管壁组织和心肌组织)主要是在胱硫醚-γ-裂解酶催化作用下产生的，而胱硫醚-β-合成酶主要分布于肝脏、胰腺、肾脏、大脑和肺部，而且在神经系统中占主导作用。

作为一种内源性气体信号分子，H₂S的生理学作用已有许多报道，例如舒张血管(Mueller,Nat.Chem.Bio.,2:185,2006)、参与炎症反应(Lane,Nature,443:901,2006；Cunha et al.,Eur.J.Pharmacol.,590:127,2008)、调节胃肠道和肝功能(Mancardi etal.,Biochim.et Biophys.Acta,1787:864,2009)、细胞保护(Rose et al.,WorldJ.Gastroentero.11:3990,2005)和抑制血管平滑肌细胞增殖(Baskar et al.,Eur.J.Pharmacol.,594:1,2008)等作用；其含量也与心脏病(Zhu et al.,J.Appl.Physiol.,102:261,2007)，肝硬化(Jeney et al.,Free Radical Bio.Med.,46:616,2009；Fiorucci et al.,Hepatology,42:539,2005)、糖尿病(Yang et al.,J.Physiol.,569:519,2005；Kaneko et al.,Diabetes,55:1391,2006)以及高血压等疾病有关(Li et al.,Curr.Opin Pharmacol.,6:125,2006)。

H₂S的血管舒张作用与高血压

实验结果表明，当用NaHS灌注大鼠离体心脏时，对左心室的舒张功能表现为浓度依赖性抑制作用，左心室压力也呈浓度依赖性降低.预先用1.4x10^-4mol/L的KATP通道阻断剂灌注阻断KATP通道，可大部分阻断NaHS对离体心脏的抑制效应(Geng et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,313:362,2006)。由于其对KATP通道的抑制作用，H₂S可以抑制胰腺胰岛素的分泌，结果是降低了ATP浓度水平，从而打开INS-1E细胞的KATP通道。NO供体可以增加内源H2S的产生，低浓度H₂S明显增加了NO供体硝普钠的血管舒张作用，这种作用可能是由于H2S促进了血管内皮细胞和硝普钠中NO释放，从而增加了L-半胱氨酸转变成硫化物的量；也可能是通过细胞和/或调节cGMP依赖的蛋白激酶活性增加了半胱氨酸的吸收(cGMP是CSE活性一种刺激物)从而增加了血管平滑肌CSE的表达。

H₂S与细胞保护

H2S具有细胞保护作用。多项研究表明，在微物质的量浓度下，H₂S对细胞有保护作用(Rinaldi et al.,Lab Invest.,86:391,2006)，它能中和多种活性粒子，例如氧自由基(Szabo,Nat.Rev.Drug Discov.,6:91,2007)、过氧亚硝酸盐(Mancardi et al.,Biochim.et.Biophys.Acta,1787:864,2009)等。低浓度H2S可以提高内源性抗氧化酶系统活和对已知的抗氧化剂发挥协同效应，包括N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶。H₂S的细胞保护机理也有报道，Zhang等认为H₂S可以引起细胞保护基因上调(Zhang et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,317:30,2004)，Kimura等认为H2S是通过增强γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性以提高细胞谷胱甘肽水平来发挥细胞保护作用的(Kimura et al.,FASEB.J.,18:1165,2004)。

H₂S的心血管保护作用

H₂S对心肌缺血和再灌注损伤具有保护作用。Sivarajah等报道用H₂S供体化合物预处理心脏可以减少25％的心肌梗死面积(Sivarajah et al.,Shock,26:154,2006)。对体内急性心肌梗死模型的进一步研究表明，灌注同时注射H2S具有可减小心肌梗死面积和保护左心室功能的作用(Elrod et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104:15560,2007)。其涉及的机理包括了抑制线粒体游离钙超载和线粒体活性氧的产生，抑制线粒体通透性转换的发生，提高复氧心肌细胞膜电位，保护线粒体超微结构的完整(Lefer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104:17907,2007)，减少线粒体细胞色素C的释放；激活ATP敏感性钾通道的开放抑制线粒体钙超载和活性氧产生；激活PI3K-Atk-GSK3β信号通路，磷酸化GSK3β(ser9)抑制线粒体通透性转换的发生等(蔡文杰，中国药理学通报.25(7):854-856,2009；于水，中国药理学通报.26(6):759-764,2010)。4-(3-thioxo-3H-1,2-dithiol-4-yl)benzoic acid是硫化氢释放基团，在体内酶的作用下能够持续的释放出硫化氢(Marutani,et al.,J Biol Chem.287(38):32124,2012)。

另外，由CSE过表达调节产生的内源性H₂S可以明显降低心脏的伤害程度。受损伤的心脏用H₂S治疗后可以恢复本来的颜色，表明H2S对心脏具有保护作用。目前，基于H₂S的心脏保护作用，一些医药公司正在研制可释放H2S的药物用于治疗一些疾病，如用于防止心脏病发作(Leslie et al.,Science,320:1155,2008)。

H₂S的其它作用

此外，H₂S在体浓度水平还与多种疾病有关：如肝硬化、心脏病、糖尿病、老年痴呆和唐氏综合症等。例如CSE在肝星状细胞内表达，而在肝窦内皮细胞内不表达；星状细胞的活化可以下调CSE mRNA的表达，导致H2S的合成减少，从而抑制I,III型胶原的合成，这对于肝硬化和门静脉高压症的形成具有重要的影响。老鼠患糖尿病时胰腺和肝脏中H₂S的浓度增加，肝脏中CSE和CBS的mRNAs也增加，胰岛素治疗可以恢复H2S的代谢.在患链脲霉素诱导糖尿病的老鼠胰腺和肝脏中H₂S代谢可以被改变，糖尿病可以扰乱H₂S的生物合成，表明H₂S和糖尿病之间存在着一定的关系。Eto等研究发现患阿尔茨海默氏病(老年痴呆症)的患者脑中H₂S的浓度水平与对照组相比降低了约55％(Eto et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,293:1485,2002)。

如下文所述，本发明提供了一种既能解决现有丹参素性质上的缺陷问题，又能通过偶联川芎嗪、硫化氢供体等活性基团而达到显著增强药效的目的。但是，本文所述的发明内容并不限于只是用来克服上述缺陷或仅仅能够通过后文所述的具体方式来实施以达到其在医疗和制药方面的目的。

发明内容

本发明涉及丹参素衍生物或其药学上可接受的盐，还涉及包含丹参素衍生物及其药学上可接受的盐的药物组合物。另外，本发明也涉及丹参素衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法。再有，本发明还涉及丹参素衍生物在医药包括制备预防或治疗疾病的药物中的应用。

本发明所提供的丹参素衍生物及其药学上可接受的盐，相对于原有药物而言，具有增加脂溶性，改变吸收性能，增加稳定性，提高药效，降低毒副作用等特点。

一方面，本发明提供了新的丹参素衍生物，具有如下通式I的结构：

其中：

R₁与R₂相同或不同，各自独立地选自羟基，烷氧基，有机酸酸根，天然α氨基酸酸根；

R₃选自氢，饱和或不饱和的烷基，取代或未取代的酰基，氨酰基，以及硫化氢供体基团；

R₄与R₅相同或不同，各自独立地选自氢，饱和或不饱和的烷基或环烷基，但R₄与R₅不能同时为氢。

优选地，在通式I所述的上述化合物中：

在R₁与R₂所选自的基团群组中，所述有机酸酸根为C₂-C₆、C₂-C₅、C₂-C₄或C₂-C₃的有机酸酸根；

在R₄与R₅所选自的基团群组中，所述饱和或不饱和的烷基或环烷基为C₁-C₆、C₁-C₅、C₁-C₄或C₁-C₃的饱和或不饱和的烷基或环烷基。

优选地，在通式I所述的上述化合物中：

在R₁与R₂所选自的基团群组中，所述有机酸酸根为乙酸根，所述天然α氨基酸酸根为甘氨酸酸根、精氨酸酸根或半胱氨酸酸根。

优选地，在通式I所述的上述化合物中：

在R₃所选自的基团群组中，所述氨酰基为甘氨酰基。

优选地，在通式I所述的上述化合物中：：

在R₃所选自的基团群组中，所述硫化氢供体基团为大蒜素基、半胱氨酰基、三硫酮基、环硫磷基、硫酮基或硫辛酰基。优选地，所述硫化氢供体基团为三硫酮基。

优选地，在通式I所述的上述化合物中：

在R₄与R₅所选自的基团群组中，所述烷基为甲基，乙基，丙基或烯丙基。

优选地，在通式I所述的上述化合物中，R₄与R₅相同为-CH₂CH＝CH₂，亦即所述丹参素衍生物具有通式II的结构：

优选地，在通式II的结构中：R₃为氢，乙酰基或硫化氢供体基团，所述硫化氢供体基团为如下基团之一：

在上述结构的化合物中，优选地，R₃为所述丹参素衍生物为下述化合物之一：

优选地，在通式II的结构中：

R₁和R₂相同为氢、乙酸根、丙酸根、丁酸根，或以下基团之一：

R₃为氢，乙酰基，甘氨酰基，或

在上述的结构中，优选地，R₁和R₂相同为氢或乙酸根，R₃为氢或乙酰基，所述丹参素衍生物为下述化合物之一：

或者，优选地，R₁和R₂相同为乙酸根或甘氨酸酸根，R₃为氢、乙酰基或甘氨酰基，所述丹参素衍生物为下述化合物之一：

另一方面，本发明还提供了所述丹参素衍生物的合成方法，其合成路线大体是2,3,5,6-四甲基吡嗪(TMP)经过氧化成醛或酯，然后与烷基溴化镁反应生成在羟甲基部位单取代或双取代的2-羟甲基-3,5,6-三甲基吡嗪衍生物，此中间体分别与丹参素或丹参素衍生物分子的羧基缩合生成酯，得到酯键附近有取代的丹参素-川芎嗪偶联物。这些偶联物可以直接或者脱去保护基后，使丹参素裸露的的酚羟基或醇羟基与氨基酸、或与硫化氢供体等反应成酯，得到相应的目标产物。所述合成路线如下所示。

本发明还提供了一种药物组合物，包含药学上有效剂量的上述任一化合物或其药学上可接受盐，以及药学上可接受的载体。所述有效剂量为0.1mg-10g。

本发明所提供的化合物与现有技术相比，具有包括以下方面的创新性：

(1)在丹参素衍生物的酯键位置引入了位阻较大的基团，所获得的新型的丹参素衍生物具有更高的稳定性，在羧酸酯酶中的半衰期大大延长。

(2)发现在丹参素的酯键位置引入了位阻较大的基团后，所获新型丹参素衍生物比没有位阻的丹参素衍生物具有更高的生物活性。这为丹参素的结构修饰提供了理论和实践指导。

(3)将硫化氢供体植入丹参素-川芎嗪偶联物中，协同作用使其生物活性增强。

本发明针对丹参素衍生物制备方法所涉及的研究设计考虑了包括但不限于如下的因素：其一，为了找到活性强、半衰期延长的丹参素衍生物，将其结构中易变的酚羟基、α-羟基羧酸进行保护，使药物在体内的代谢稳定性增强。进入体内，在酯酶的作用下，保护基团离去，原药发挥药效；其二，为了增强丹参素衍生物的疗效，同时增强其在羧酸酯酶中的的稳定性，在丹参素衍生物的酯键位置引入了位阻较大的基团；其三，对以上的化合物进行药理活性实验包括细胞实验和动物实验，进行构效关系研究，构效关系研究的结果可进一步指导化学合成，寻找活性更强，化学性质更稳定的可用于临床的新药物。

本发明还针对新的丹参素衍生物及其药学上可接受的盐进行了药理作用方面的实验。丹参素具有抗氧化作用，通过清除自由基而对细胞与组织发生保护作用。因此，首先测定了新化合物对自由基的反应活性。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种自由基，被广泛用于测定化合物的抗自由基能力。实验发现，新的丹参素化合物具有很强的抗自由基能力。二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD)，该脱氢酶广泛存在于各种组织细胞中，它是一种电子接受体，能抑制羟自由基生成。本实验发现，新的丹参素化合物的活性强于丹参素。

本发明还测定了所述新化合物对大鼠原代心肌细胞的保护作用。实验结果发现，许多新化合物的活性强于丹参素。

前期我们曾发明了丹参素衍生物ADTM，其活性比天然丹参素(DSS)强至少10倍以上，比丹参酚酸B(Sal B)强2至4倍，丹参素衍生物ADTM对大鼠急性心肌缺血有强大的保护作用。在本发明中建立了大鼠急性心肌缺血模型，以ADTM为对照之一，并测定了这些化合物对心肌缺血的保护作用。

另一方面，本发明所提供的的丹参素衍生物及其药学上可接受盐，以及相应的药物组合物可用于治疗疾病和制备相应药物。所述疾病包括因钙离子超载和氧化应激引起的疾病，心与心血管系统疾病，以及脑与脑血管系统疾病。所述因钙离子超载和氧化应激引起的疾病包括因钙离子超载和氧化应激引起的心、肝、肾、脑及眼器官疾病；所述心与心血管系统疾病包括心肌梗死、心肌缺血、心脏缺血再灌注、冠心病，心绞痛、心力衰竭、心律失常、心室纤维化、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化；所述脑与脑血管系统疾病包括：脑缺血，帕金森症，阿尔茨海默症，肌肉萎缩性侧索硬化症，共济失调毛细血管扩张症，牛海绵状脑病，克雅二氏病，顿舞蹈症，小脑萎缩症，多发性硬化症，原发性侧索硬化，脊髓性肌萎缩症。

附图说明

图1是描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1009，D1010的合成。

图2是描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1014的合成。

图3描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1016的合成。

图4描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1029的合成。

图5描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1009，D1010，D1014，D1016对心肌细胞的保护作用的实验结果。以本实验前期发现的丹参素衍生物ADTM为对照药。###：ADTM与模型组相比P＜0.001；*：丹参素衍生物与ADTM组相比P＜0.05；**：丹参素衍生物与ADTM组相比P＜0.01；***：丹参素衍生物与ADTM组相比P＜0.001。

图6描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1016，D1019，D1021，D1023，D1029的抗氧化细胞实验。以本实验前期发现的丹参素衍生物ADTM为对照药。#：ADTM与模型组相比P＜0.05；###：ADTM与模型组相比P＜0.001；*：丹参素衍生物与ADTM组相比P＜0.05；**：丹参素衍生物与ADTM组相比P＜0.01；***：丹参素衍生物与ADTM组相比P＜0.001。

图7描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1029、丹参素(DSS)、川芎嗪(TMP)、D1027以及丹参素/川芎嗪/D1027混合物(Mix)的抗氧化细胞实验。*：D1029与DSS组相比P＜0.0001；#：D1029与TMP组相比P＜0.0001；$：D1029与D1027组相比P＜0.0001；&：D1029与Mix组相比P＜0.0001；^：D1029与空白组相比P＜0.001。

图8描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1029、丹参素(DSS)、丹参酚酸B(SAB)的抗氧化细胞实验。*：D1029与DSS组相比P＜0.05；$：D1029与DSS组相比P＜0.0001。#：D1029与SAB组相比P＜0.001。

图9描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1017、D1018、D1021、D1035的抗氧化细胞实验。*：与ADTM组相比P＜0.05；**：与ADTM组相比P＜0.01；***：与ADTM组相比P＜0.001；

图10描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1029对抗阿霉素诱导的心肌毒性试验。A：丹参素衍生物D1029对阿霉素诱导的心肌细胞LDH释放量的试验。B：丹参素衍生物D1029对阿霉素诱导的心肌细胞存活率的试验。**：模型组与空白组相比P＜0.01；##：D1029与模型组相比P＜0.001。

图11描述根据本发明的实施方式所提供的丹参素衍生物D1016,D1017和D1031对大鼠急性心肌缺血保护作用。IN/LV:梗死面积/左心室面积。

具体实施方式

定义

以下定义用以阐明和界定该发明中所用到的各种术语的含义以及范围。

本文所用的术语“烷氧基”是指未被取代的或被取代的直链烷氧基、支链烷氧基。直链烷氧基包括如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、正戊氧基、正己氧基、正庚氧基和正辛氧基。支链烷氧基包括如异丙氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基。烷氧基可被一个或多个取代基取代。上述取代基的非限定性例子包括OH，F，Cl，Br，I，NH₂，NO₂，ONO₂。

本文所用的术语“烷基”是指未被取代的或被取代的直链、支链或环形的多至15个碳原子的烷基碳链。直链烷基包括如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基。支链烷基包括如异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、新戊基。单环烷基包括如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。烷基亦可是含有不饱键的烷基，不饱和键的非限定性例子包括双键，三键，共轭双键。

本文所用的术语“酰基”包括乙酰基，丙酰基，正丁酰基，正戊酰基，氨基乙酰基。

本文所用的术语“H₂S供体基团”是指在体内生理条件，能够释放出H₂S的基团。例如：

本文所用的术语“天然α氨基酸”包括甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，苏氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸。

本文使用的术语“药学上可接受的”指的是在化合物如盐中不具有不能接受的毒性。药学上可接受的盐包括无机阴离子，例如氯离子、硫酸根、亚硫酸根、硝酸根、亚硝酸根、磷酸根、磷酸氢根等。有机阴离子包括乙酸根、丙酸根、肉桂酸根、苯甲磺酸根、柠檬酸根、乳酸根、葡萄糖酸根等。

本发明涉及的丹参素衍生物可以以一种药学可接受的盐或药物组合物的形式对患者给药。某个复合物需与适当载体或赋形剂混合形成药物组合物从而保证达到有效治疗剂量。“有效治疗剂量”是指丹参素衍生物达到治疗效果所必须的剂量。

所述丹参素衍生物及其含有该类化合物的组合物可以制成多种剂型，包括固体剂型，半固体剂型，液体制剂和气雾剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company(1995),Philadelphia,PA,19^th ed)。这几类剂型中的具体剂型包括片剂、丸剂、糖锭剂、颗粒剂、凝胶剂、膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂以及喷雾剂。这些剂型既能用于局部或全身给药又能用于速释或缓续给药。

当丹参素衍生物及其含有这些化合物的组合物注射给药时，可以用水溶性或脂溶性的溶剂将此类化合物配制成溶液剂，悬浊剂和乳剂。脂溶性溶剂具体包括植物油及类似油类，合成脂肪酸甘油酯，高级脂肪酸酯以及乙二醇酯(proylene glycol)。这类化合物更易溶于乙醇溶液，微量DMSO溶液。

当丹参素衍生物及其含有这些化合物的组合物口服给药时，可以采用常用技术将其与药学可接受的赋形剂制成复合物。这些赋形剂可以将这些化合物制成多种可以被病人剂型，如片剂、丸剂、混悬剂、凝胶剂等。口服制剂的配制有多种方法，如先把化合物和固体赋形剂混匀，充分研磨混合物，添加适当的辅料，加工处理成颗粒。可以用于制成口服剂型的辅料包括：糖类如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素类如玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄薯胶、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素纳、聚乙烯吡咯酮等。

本发明涉及的丹参素衍生物及其含有这些化合物的组合物也可以制成喷雾剂，此种剂型是通过一个加压器和一个喷雾器或者一个干粉吸入装置而实现的。可以用作喷射器里合适的喷射剂如二氯二氟甲烷、氟三氯甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳和二甲醚等。气雾剂给药的剂量可以通过喷射器的阀门来调节。

本发明涉及的各种剂型都关系到丹参素衍生物及其含有这些化合物的组合物的有效治疗剂量。该类化合物的有效治疗剂量取决于接受治疗的患者。在决定适宜的剂量时，患者的体重、病情、服药方式以及处方医师的主观判断因素都要纳入考虑。丹参素衍生物及其含有这些化合物的组合物的治疗有效量应该由有能力和丰富经验的处方医师决定。

尽管丹参素类衍生物及其含有这些化合物的组合物的有效治疗剂量会根据患者情况发生变化，但是通常适当的给药剂量范围是10mg-10g。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：本发明提供了一种全新结构的化合物，稳定性增强、活性显著增加，可用于制备预防或治疗心、脑血管系统疾病等的药物。

实施例

下面的实施例用来针对本发明的实施进行说明，但是不应该被解释为本发明会受到这些实施例的限制。

实施例1、化合物D1009的合成

化合物D1009的合成包括以下7步反应。

化合物D1003的合成：向250mL圆底烧瓶中加入TMP(30g，0.22mol)和60mL冰醋酸，加热至70℃，充分搅拌溶解完全后，缓慢滴加30％H₂O₂(37mL，0.36mol)，反应过夜。TLC监测反应进程，待产物量无明显增加后，停止加热，自然冷却至室温。反应液转移到500mL烧杯中，加入200mL冷水，冰浴下加入氢氧化钠颗粒不断搅拌调节pH至10。用氯仿萃取三次，无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩即可得到TMP氮氧化物D1001，不经纯化直接用于下一步反应。

取100mL圆底烧瓶，加入上步反应得到的TMP氮氧化物和40mL醋酸酐，充分搅拌溶解，加热回流，反应约2.5h。反应结束后，冷却至室温，减压浓缩除去过量的醋酸酐，此时得到化合物D1002的粗品。向D1002的粗品中，加入150mL冷水，充分搅拌下加入氢氧化钠颗粒调节pH至12，搅拌2-4h。反应液用氯仿萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)分离得到化合物D1003(16g，产率48％)，黄色固体。

化合物D1004的合成：向100mL圆底烧瓶加入D1003(2g，13.2mmol)和40mL乙醇，待溶解后，再加入二氧化锰(5g，57.4mmol)。加热回流2-4h，TLC监测反应进程，待D1003完全转化后，将反应液冷却至室温，过滤、滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液经减压浓缩后，经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)分离纯化，得到目标产物(4g，产率80％)，黄色固体D1004。

化合物D1005的合成：向25mL两口圆底烧瓶中加入D1004(200mg，1.33mmol)和10mL无水四氢呋喃，氮气保护，充分搅拌溶解后，将反应瓶置于冰水浴中冷却。向反应体系中缓慢滴加3mol/L的甲基溴化镁乙醚溶液(0.7mL，2.0mmol)，滴加完毕后，室温继续反应。TLC监测反应进程，待反应结束后，加入10mL氯化铵饱和水溶液充分水解。乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，浓缩液经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)分离纯化，得到化合物D1005(170mg，产率77％)，无色液体。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ1.37(d,3H,CH₃),2.40(s,3H,CH₃),2.42(s,3H,CH₃),2.48(s,3H,CH₃),4.89(p,1H,CH),5.06(d,1H,OH)；¹³C NMR(DMSO-d₆,75MHz)δ20.73,21.48,21.52,22.33,66.81,147.54,147.79,149.41,152.85；MS(ESI)[M+H]⁺m/z167.0.

化合物D1006的合成：向50mL两口圆底烧瓶中加入D1004(230mg，1.53mmol)和20mL无水THF充分搅拌溶解，反应体系处于氮气环境，圆底烧瓶置于冰水浴中冷却，往体系中缓慢注射1mol/L的烯丙基溴化镁乙醚溶液(2.3mL，2.3mmol)，滴加完毕，反应体系转移至室温继续搅拌，TLC监测反应进程，待反应结束后，加入20mL氯化铵饱和水溶液充分水解，随后用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩，浓缩液经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)分离得到目标产物(250mg，产率85％)，无色油状。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ2.34(m,2H,CH₂),2.46(s,3H,CH₃),2.48(s,6H,CH₃),4.32(d,1H,OH),4.86(t,1H,CH),5.08(m,2H,＝CH₂),5.83(ddt,1H,CH＝)；MS(ESI)[M+H]⁺m/z193.4.

化合物D1007的合成：向150mL圆底烧瓶中加入丹参素钠(10g，45.4mmol)和40mL醋酸酐，室温下搅拌均匀，随后缓慢滴加1mL高氯酸。TLC监测反应，待反应结束后，将反应液倒入盛有100mL冰水的烧杯中，搅拌至室温后用乙酸乙酯萃取，合并有机相。用水洗有机相两次，再用饱和氯化钠水溶液洗两次，用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩，浓缩液经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)分离纯化得到化合物D1007，白色粉末(12.5g，产率84％)。

化合物D1008的合成：取50mL圆底烧瓶，称取D1007(323mg，1mmol)，加入10mL无水二氯甲烷，室温条件充分搅拌溶解，另加0.1ml干燥的DMF作催化剂，随后缓慢滴加草酰氯(0.3mL，3mmol)，滴加完毕，瓶口装上盛有无水氯化钙的干燥管，室温继续搅拌4h。减压浓缩，除去反应溶剂以及过量的草酰氯，得到的浓缩液立即投入下一步反应。

化合物D1009的合成：向250mL圆底烧瓶中加入化合物D1008(350mg，1.02mmol)，15mL无水二氯甲烷和1mL无水三乙胺。随后向烧瓶中加入D1005(100mg，0.6mmol)，室温搅拌反应，TLC监测反应进程，反应结束后，往反应液中加入20mL冷水。乙酸乙酯萃取，合并有机相后、用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥有机相、减压浓缩，浓缩液经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)分离得到化合物D1009(230mg，产率80％)，粘稠状无色液体。¹HNMR(DMSO-d₆,300MHz)δ1.46(dd,3H,CH₃),2.01(s,3H,CH₃),2.26(s,6H,CH₃),2.43(s,9H,CH₃),3.09(m,2H,CH₂),5.16(m,1H,CH),5.97(m,1H,CH),7.12(m,3H,CH,arom.)；¹³C NMR(DMSO-d₆,75MHz)δ18.50,19.02,20.39,20.69,20.79,21.57,21.66,35.88,70.65,72.51,123.66,124.80,127.81,135.04,141.22,142.03,147.40,147.85,149.05,151.13,168.56,168.65,168.91,170.25；MS(ESI)[M+H]⁺m/z473.1,[M+Na]⁺m/z495.1；Analysis calcd for(C₂₄H₂₈N₂O₈):C,61.01；H,5.97；N,5.93.Found:C,60.98；H,6.12；N,5.58。

实施例2、化合物D1010的合成

向250mL圆底烧瓶中加入化合物D1008(350mg，1.02mmol)，15mL无水二氯甲烷和1mL无水三乙胺。搅拌均匀后，向烧瓶中加入上述得到的化合物D1006(100mg，0.5mmol)，室温搅拌反应，TLC监测反应进程。反应结束后，向反应液中加入20mL冷水。乙酸乙酯萃取、合并有机相、饱和氯化钠水溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥有机相。有机相经减压浓缩后，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)分离，得到化合物D1010(190mg，产率73％)，粘稠状无色液体。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ2.07(s,3H,CH₃),2.29(s,6H,CH₃),2.53(m,9H,CH₃),2.76(m,2H,CH₂),3.10(m,2H,CH₂),5.13(m,2H,CH₂),5.21(m,1H,CH),5.72(ddt,1H,CH),5.97(m,1H,CH),7.08(m,3H,CH,arom.)；¹³C NMR(CDCl₃,75MHz)δ20.47,20.53,20.67,20.77,21.57,21.69,35.86,37.53,72.37,72.91,118.89,123.62,124.74,127.78,133.48,134.96,141.22,142.01,146.78,147.76,149.29,151.24,168.53,168.63,168.91,170.16；MS(ESI)[M+H]⁺m/z499.0,[M+Na]⁺m/z521.1；Analysis calcd for(C₂₄H₂₈N₂O₈):C,62.64；H,6.07；N,5.62.Found:C,62.42；H,6.14；N,5.44。

实施例3、化合物D1014的合成

化合物D1014的合成由下面4步反应组成。

化合物D1011的合成：向250mL圆底烧瓶中加入TMP(5g，36mmol)和150mL冷水，室温条件下充分搅拌溶解后，向烧瓶中加入KMnO₄(7g，44mmol)。将反应液加热到50℃搅拌反应10h。过滤，滤饼用冷水洗涤。滤液用乙酸乙酯萃取除去未反应的TMP，水层调pH至2-3，随后用乙酸乙酯萃取水层5次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后即得粗品化合物D1011(2.5g)，不经进一步纯化直接投入下一步反应。

化合物D1012的合成：向50mL圆底烧瓶中加入上一步反应得到的D1011粗品(200mg，1.2mmol)，10mL无水乙醇，待化合物溶解后，加入DMAP(180mg，1.4mmol)，EDCI(281mg，1.4mmol)，室温搅拌反应。TLC监测反应进程，待反应结束后，蒸去部分乙醇，向浓缩液中加入15mL冷水，用稀盐酸调节pH至4-5。用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，浓缩液经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)分离得到化合物D1012(140mg，产率60％)，无色油状液体。¹HNMR(CDCl,300MHz)δ1.44(t,3H,CH₃),2.57(d,6H,CH₃),2.75(s,3H,CH₃),4.47(q,2H,CH₂)；MS(ESI)[M+H]⁺m/z194.9。

化合物D1013的合成：向50mL两口圆底烧瓶中加入上述反应得到的化合物D1012(1.5g，7.7mmol)和25mL无水四氢呋喃，冰水浴中充分搅拌溶解。氮气保护，向反应液中缓慢滴加3mol/L的甲基溴化镁乙醚溶液(13mL，39mmol)。滴加完毕后，将反应液转移至室温继续搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，将反应液倒入盛有40mL氯化铵饱和水溶液的100mL烧杯中，待水解完全，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，随后用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩，浓缩液经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)分离得到化合物D1013(1.2g，产率85％)，无色油状液体。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ1.59(s,6H,CH₃),2.51(s,6H,CH₃),2.65(s,3H,CH₃),6.05(s,1H,OH)；¹³C NMR(CDCl₃,75MHz)δ21.05,21.10,23.21,28.73,70.48,145.97,146.38,149.51,153.91；MS(ESI)[M+H]⁺m/z180.8,[M+Na]⁺m/z203.4。

化合物D1014的合成：向100mL圆底烧瓶中加入上述得到的化合物D1008(350mg，1.02mmol)，20mL无水乙腈，DMAP(75mg，0.6mmol)。搅拌均匀后，加入D1013(75mg，0.4mmol)。反应液加热回流，TLC监测反应的进程。待反应结束后，将反应液自然冷却至室温。加入20mL冷水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。有机相用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，浓缩液经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)分离得到化合物D1014(85mg，产率42％)，粘稠液体，略显黄绿色。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ1.60(s,3H,CH₃),1.68(s,3H,CH₃),2.00(s,3H,CH₃),2.27(d,6H,2×CH₃),2.41(s,6H,2×CH₃),2.47(s,3H,CH₃),3.16(ddd,2H,CH₂),5.25(dd,1H,CH),7.22(m,3H,3×CH,arom.)；¹³C NMR(DMSO-d₆,75MHz)δ20.72,20.80(2C),21.35,21.60,22.29,26.09,27.28,35.97,72.30,84.31,123.78,124.90,127.95,135.30,141.28,142.13,146.51,147.06,149.56,151.30,167.87,168.64,168.70,170.15；MS(ESI)[M+H]⁺m/z487.0,[M+Na]⁺m/z509.4；Analysis calcd for(C₂₅H₃₀N₂O₈):C,61.72；H,6.22；N,5.76.Found:C,62.08；H,6.31；N,5.59。

实施例4、化合物D1016的合成

化合物D1016的合成由下面2步反应组成。

化合物D1015的合成：向50mL两口圆底烧瓶中加入化合物D1012(194mg，1mmol)和10mL无水四氢呋喃，冰水浴中充分搅拌溶解。氮气保护，向烧瓶中体系中缓慢滴加1mol/L的烯丙基溴化镁乙醚溶液(3mL，3mmol)。滴加完毕，将反应液转移至室温继续搅拌，TLC监测反应进程。反应结束后，将反应液倒入盛有10mL氯化铵饱和水溶液的50mL烧杯，待水解完全，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，随后用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩，浓缩液经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝6：1)分离得到化合物D1015(190mg，产率80％)，无色油状液体。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ2.40(d,6H,2×CH₃),2.54-2.71(m,7H,CH₃,2×CH₂),4.92(m,4H,2×CH₂),5.41(s,1H,OH),5.63(ddt,2H,2×CH)；¹³CNMR(DMSO-d₆,75MHz)δ21.25,21.46,23.46,44.64(2C),76.63,117.85(2C),134.79(2C),146.31,148.10,148.78,152.74；MS(ESI)[M+H]⁺m/z233.0,[M+Na]⁺m/z255.6；Analysiscalcd for(C₁₄H₂₀N₂O):C,72.38；H,8.68；N,12.06.Found:C,72.40；H,8.85；N,11.86。

化合物D1016的合成：向50mL两口圆底烧瓶加入上述得到的化合物D1015(200mg，0.86mmol)和10mL无水四氢呋喃，溶解后，将反应体系置于氮气保护环境中，用冰水浴冷却。向反应体系中缓慢逐滴加入1.6mol/L正丁基锂正己烷溶液(0.6mL，0.96mmol)，搅拌0.5h。向反应体系中体系中加入现备的化合物D1008的无水四氢呋喃溶液(350mg D1008溶于15mL无水四氢呋喃中)。滴加完毕，将反应体系转移至室温继续搅拌反应，TLC监测反应进程。待反应结束后，将反应液倒入盛有30mL冷水的100mL烧杯中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，硫酸钠干燥，减压浓缩，浓缩液经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝3：2)分离得到化合物D1016(310mg，产率67％)，粘稠液体，略显黄绿色。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ2.05(s,3H,CH₃),2.30(s,6H,2×CH₃),2.49(s,6H,2×CH₃),2.62(s,3H,CH₃),2.96-3.28(m,6H,3×CH₂),5.06(m,4H,CH₂),5.28(dd,1H,CH),5.58(m,2H,2×CH),7.10-7.14(m,3H,CH,arom.)；¹³C NMR(CDCl₃,75MHz)δ20.51,20.65(2C),21.33,21.46,21.78,36.87,40.09,40.33,72.24,77.22,88.03,119.12,119.24,123.37,124.31,127.25,132.19,132.28,135.19,141.03,141.91,147.10,147.23,149.21,167.57,168.18,168.26,170.02；MS(ESI)[M+H]⁺m/z539.2；Analysis calcd for(C₂₅H₃₀N₂O₈):C,64.67；H,6.36；N,5.20.Found:C,64.20；H,6.32；N,4.60。

实施例5、化合物D1017的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1016(538mg，1mmol)，用1：1的甲醇/水溶解，加入碳酸钠(318mg，3mmol)，室温下搅拌4h，之后减压蒸馏除去大部分溶剂后，使用EA萃取三次，浓缩后柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)分离得到目标产物(227mg，产率50％)，黄褐色油状。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ2.03(s,3H,CH₃),2.50(d,J＝6.9Hz,9H,CH₃),2.90(dd,J＝14.4,9.4Hz,1H,CH₂),3.21-2.98(m,5H,CH₂),4.95-5.15(m,4H,CH₂),5.26(dd,J＝9.4,3.9Hz,1H,CH),5.43-5.69(m,2H,CH),6.57-6.81(m,3H,arom.)；MS(ESI)[M+H]⁺m/z455.2。

实施例6、化合物D1018的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1016(538mg，1mmol)，用适量2：1的甲醇/水溶解，加入碳酸钠(318mg，3mmol)，室温下搅拌4h，之后减压蒸馏除去大部分溶剂后，使用乙酸乙酯萃取，浓缩后柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)分离得到目标产物(206mg，产率50％)，浅黄色油状。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ2.50(d,J＝18.7Hz,9H,CH₃),2.88-3.32(m,6H,CH₂),4.19(t,J＝10.1Hz,1H,CH),5.11(d,J＝24.4Hz,4H,CH₂),5.49(ddd,J＝18.0,13.2,7.3Hz,1H.CH),5.80-5.61(m,1H,CH),6.75(d,J＝21.8Hz,3H,arom.)；MS(ESI)[M+H]⁺m/z413.3。

实施例7、化合物D1019的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1018(412mg，1mmol)，用适量无水THF溶解，加入三乙胺0.1mL，室温下搅拌均匀，用冰浴将反应体系温度降至0℃，N₂保护下，向其中加入酰化剂乙酸酐(0.2mL，2.12mmol)，在室温和磁力搅拌条件下反应2h。再加入适量水洗，用乙酸乙酯萃取，将萃取液用无水硫酸钠干燥后旋干，溶解后以硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)分离得到目标产物(297mg，产率60％)，无色油状。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ2.29(s,6H,CH₃),2.42-2.59(m,9H,CH₃),2.84(dd,J＝14.3,9.5Hz,1H,CH₂),3.11(ddt,J＝21.7,14.6,5.5Hz,5H,CH₂),4.38(dd,J＝9.4,3.3Hz,1H,CH),4.97-5.16(m,4H,CH₂),5.42-5.72(m,2H,CH),7.17(ddd,J＝15.3,10.9,5.0Hz,3H,arom.)；¹³C NMR(CDCl₃,75MHz)δ20.65,21.25,21.49,22.68,40.04,40.17,40.44,71.23,87.92,119.25,119.32,123.22,124.32,127.58,132.05,132.31,136.35,140.85,141.84,146.61,147.48,149.31,149.57,168.35,172.38；MS(ESI)[M+H]⁺m/z497.2。

实施例8、化合物D1020的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1017(454mg，1mmol)，用适量无水二氯甲烷溶解，加入HOBT(400mg，3mmol)，EDCI(573mg，3mmol)，DIEA0.3mL，Boc-甘氨酸(350mg，2mmol)，室温下反应2h后，用少量水洗后乙酸乙酯萃取，有机相除水后柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)分离得到目标产物(290mg，产率40％)，浅黄色油状。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.46(d,J＝10.1Hz,18H,CH₃),2.52(d,J＝17.0Hz,9H,CH₃),2.84(dd,J＝14.3,9.6Hz,1H,CH₂),2.98-3.26(m,5H,CH₂),4.14(d,J＝6.5Hz,4H,CH₂),4.38(d,J＝8.9Hz,1H,CH),5.07(dd,J＝13.2,10.6Hz,4H,CH₂),5.42-5.73(m,4H,CH,NH),7.10-7.26(m,3H,arom.)；MS(ESI)[M+H]⁺m/z769.15。

实施例9、化合物D1021的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1020(768mg，1mmol)，加入适量25％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液，室温下搅拌2h后，蒸出溶剂，加入无水二氯甲烷反复蒸出溶剂，直至没有酸味后，置于真空泵上处理24h后得到化合物，白色泡沫状化合物(716mg，产率90％)。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ2.00(d,J＝5.9Hz,3H,CH₃),2.42(s,9H,CH₃),3.01(dt,J＝12.0,10.6Hz,5H,CH₂),3.29(dd,J＝15.0,3.7Hz,1H,CH₂),4.21(s,4H,CH₂),5.06(dd,J＝15.3,7.8Hz,4H,CH₂),5.34(dd,J＝9.7,3.9Hz,1H,CH),5.56(m,2H,CH),7.33(m,3H,arom.)；MS(ESI)[M+Na]⁺m/z591.06。

实施例10、化合物D1022的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1018(538mg，1mmol)，用适量无水二氯甲烷溶解，加入HOBT(400mg，3mmol)，EDCI(573mg，3mmol)，DIEA0.3mL，Boc-甘氨酸(350mg，2mmol)室温下反应2h后，用少量水洗后乙酸乙酯萃取，有机相除水后柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)分离得到目标产物(290mg，产率40％)，浅黄色油状。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ1.46(d,J＝10.1Hz,18H,CH₃),2.52(d,J＝17.0Hz,9H,CH₃),2.84(dd,J＝14.3,9.6Hz,1H,CH₂),2.98-3.26(m,5H,CH₂),4.14(d,J＝6.5Hz,4H,CH₂),4.38(d,J＝8.9Hz,1H,CH),5.07(dd,J＝13.2,10.6Hz,4H,CH₂),5.42-5.73(m,4H,CH₂,NH),7.10-7.26(m,3H,arom.),8.56(s,6H)；MS(ESI)[M+H]⁺m/z727.2。

实施例11、化合物D1023的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1022(726mg，1mmol)，加入适量25％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液，室温下搅拌2h后，蒸出溶剂，加入无水二氯甲烷反复蒸出溶剂，直至没有酸味后，置于真空泵上处理24h后得到化合物，白色泡沫状化合物(678mg，产率90％)。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ2.42(d,J＝3.7Hz,6H,CH₃),2.48(s,3H,CH₃),2.71-3.20(m,6H,CH₂),4.14-4.40(m,4H,CH₂),5.03(t,J＝11.0Hz,4H,CH₂),5.38-5.79(m,2H,CH),7.16-7.46(m,3H,arom),8.70(s,6H)；¹³C NMR(DMSO-d₆,75MHz)δ21.28,21.63,22.66,71.26,85.84,118.90,119.55,123.35,124.53,128.97,132.66,132.96,138.47,139.78,140.90,146.97,147.07,149.29,150.06,158.97,159.42,166.39,166.51,171.98；MS(ESI)[M+H]⁺m/z527.0。

实施例12、化合物D1029的合成

化合物D1029的合成由以下5步反应实现。

化合物D1025的合成：称取化合物4-异丙基苯甲酸D1024(5g，0.03mol)溶于125ml的乙醇中，浓硫酸0.38ml缓慢加入体系中。100℃下反应过夜。次日，待反应体系冷却后，减压蒸出溶剂，用二氯甲烷萃取。有机相用饱和的碳酸氢钠水溶液洗一遍，有机相用无水硫酸钠除水后，柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：10)分出化合物。

化合物D1026的合成：硫(1.2g)搅拌下在146℃下溶解后，滴加化合物D1025(940mg，5.16mmol)，之后体系升温至220℃反应24h。之后，温度降至110℃，加入3ml甲苯，7ml丙酮，持续搅拌4h，冷却至室温，过滤出去硫，滤液减压浓缩后柱层析(二氯甲烷：环己烷＝3：2)分出化合物。

化合物D1027的合成：化合物D1026(0.5g)溶于27ml乙酸中，稀硫酸(9M，4,5ml)缓慢加入反应体系中，100℃下反应4h。冷却至室温后，加入适量的水，用二氯甲烷：甲醇＝9：1的有机相萃取，无水硫酸钠除水后，蒸出溶剂得到化合物。

化合物D1028的合成：取25mL圆底烧瓶，适量二氯甲烷，加入D1027(381mg，1.5mmol)，DCC(463mg，2.25mmol)，冰浴下反应2h，加入D1022(726mg，1mmol)，催化量DMAP，室温下反应6h，蒸出溶剂，加入少量EA过滤，滤液浓缩后柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)分离得到目标产物(288mg，产率30％)，红黄色油状。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ1.42-1.47(m,18H,CH₃),2.46(s,6H,CH₃),2.60(d,J＝9.2Hz,3H,CH₃),2.97-3.40(m,6H,CH₂),4.13(dd,J＝11.0,6.6Hz,4H,CH₂),4.96-5.11(m,4H,CH₂),5.26-5.39(m,1H,CH),5.41-5.71(m,4H,CH₂,NH),7.08-7.23(m,3H,arom.),7.48-7.80(m,2H,arom.),7.96-8.27(m,2H,arom.),8.45-8.59(m,1H)；MS(ESI)[M+H]⁺m/z963.38。

化合物D1029的合成：取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1028(962mg，1mmol)，加入适量25％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液，室温下搅拌2h后，蒸出溶剂，加入无水二氯甲烷反复蒸出溶剂，直至没有酸味后，置于真空泵上处理24h后得到化合物(685mg，产率90％)，红色粉末状吸潮化合物。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ2.42(s,6H,CH₃),2.55(s,3H,CH₃),2.97(s,6H,CH₂),4.05-4.32(m,4H,CH₂),4.98-5.14(m,4H,CH₂),5.42-5.58(m,3H,CH,CH₂),7.24-7.59(m,3H,arom.),7.85(dd,J＝70.1,8.4Hz,4H,arom),8.57(s,6H,NH₂,COOH),9.17-9.39(m,1H,CH)；MS(ESI)[M-H]^-m/z761.21。

实施例13、化合物D1030的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1019(496mg，1mmol)，用适量无水二氯甲烷溶解，室温下搅拌均匀，加入催化量DMAP，EDCI(286mg，1.5mmol)，用冰浴将反应体系温度降至0℃，N₂保护下，向其中加入N-Boc甘氨酸(262mg，1.5mmol)，在室温和磁力搅拌条件下反应2h。再加入适量水洗，用乙酸乙酯萃取，将萃取液用无水硫酸钠干燥后旋干，溶解后以硅胶柱层析，(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)的混合溶液为洗脱剂洗脱，所得目标产物组分溶液旋去得无色至浅黄色油状化合物。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ1.43(s,9H),2.28(d,J＝2.1Hz,6H),2.47(s,6H),2.59(s,2H),2.98-3.28(m,6H),3.93(d,J＝5.0Hz,1H),5.02-5.08(m,2H),5.31(dd,J＝10.1,3.1Hz,0H),5.46-5.64(m,1H),7.09(s,3H),7.12(s,2H)；¹³C NMR(CDCl₃,75MHz)δ20.60,20.68,21.33,21.45,22.70,26.89,28.28,36.83,39.97,40.26,42.14,72.81,79.86,88.11,119.20,119.30,123.47,124.49,127.29,132.09,132.23,134.75,141.11,141.91,147.01,147.23,149.27,149.34,155.50,166.93,168.20,168.29,169.51.MS(ESI)[M+Na]⁺m/z676.0。

实施例14、化合物D1031的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1030(653mg，1mmol)，加入适量25％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液，室温下反应2h，之后减压蒸出溶剂，反复加二氯甲烷蒸出溶剂，直至没有酸味后，置于真空泵下处理24h，得到泡沫状化合物(587mg，90％)。MS(ESI)[M+H]⁺m/z554.4。

实施例15、化合物D1032的合成

取50ml圆底烧瓶，加入化合物N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸(358mg，0.68mmol)，用DCM溶解后接着依次加入HOBt(55.5mg，0.408mmol)，EDCI(97.8mg，0.51mmol)，反应约十分钟后加入D1018(140mg,0.34mmol)，再隔4-5分钟后加入DIEA(87.8mg，0.68mmol)，反应2h后用少量水洗涤两次，有机层用无水Na₂SO₄干燥，硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝3：2)分离得到目标化合物(200mg，产率41％)，无色透明油状液体。

实施例16、化合物D1033的合成

取25ml圆底烧瓶，加入D1032(671.47mg，0.47mmol)，用二氯甲烷混溶后再加入三氟乙酸(4ml)，在室温条件下反应36h后，将溶剂减压蒸除，剩余残余物用乙醚纯化后得到目标产物(200mg，产率58％)，白色固体。

实施例17、化合物D1034的合成

取25mL圆底烧瓶，适量二氯甲烷，加入D1027(381mg，1.5mmol)，DCC(463mg，2.25mmol)，冰浴下反应2h，加入D1019(496mg，1mmol)，催化量的DMAP，室温下反应6h，蒸出溶剂，加入少量EA过滤，滤液浓缩后柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)分离得到目标产物(366mg，产率50％)，红黄色油状。MS(ESI)[M+H]+m/z733.1。

实施例18、化合物D1035的合成

取25mL圆底烧瓶，加入化合物D1034(732mg，1mmol)，用适量3：1的乙腈/水溶解，加入碳酸钠(318mg，3mmol)，室温下搅拌4h，之后减压蒸馏至大部分溶剂除去后，使用乙酸乙酯萃取，浓缩后柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)分离得到目标产物(259mg，产率50％)，浅黄色油状。MS(ESI)[M+H]+m/z649.0。

实施例19、在心肌细胞中抗氧化活性筛选

150μmol·L^-1叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导H9c2心肌细胞损伤，随机分为对照组、t-BHP组、丹参素组、丹参素衍生物组。H9c2细胞接种在96孔板中，使用含10％FBS的高糖DMEM培养基，于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养生长48h。按实验分组加入药物保护1h，加入150μmol·L^-1的t-BHP氧化损伤12h，终止损伤后加入MTT继续培养4h，最后每孔加入150μLDMSO溶解，使用酶标仪在490nm波长条件下测定吸光度数值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝样品组吸光度/空白对照组吸光度×100％。

实施例20、化合物D1029、丹参素(DSS)、川芎嗪(TMP)、D1027以及丹参素/川芎嗪/D1027混合物(Mix)的抗氧化细胞实验

使用含10％FBS的DMEM培养基培养H9c2心肌细胞，以1×10⁴/孔的细胞密度接种在96孔板中，于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养生长24h。加入相同浓度(50μM)的不同化合物D1029、丹参素、川芎嗪、D1027以及丹参素/川芎嗪/D1027混合物预保护1h后，再加入150μmol·L^-1的t-BHP处理12h，加入MTT(1mg/mL)继续培养4h，最后吸除上清夜，每孔加入100μLDMSO溶解，使用酶标仪在490nm波长条件下测定吸光度数值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝样品组吸光度/空白对照组吸光度×100％。

实施例21、化合物D1029、丹参素(DSS)、丹参酚酸B(SAB)的抗氧化细胞实验

使用含10％FBS的DMEM培养基培养H9c2心肌细胞，以1×10⁴/孔的密度接种在96孔板中，于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养生长24h。加入不同浓度(2μM，10μM，50μM，250μM)的D1029、丹参素、川芎嗪、丹参酚酸B预保护1h后，加入150μmol·L^-1的t-BHP处理12h，之后加入MTT继续培养4h，最后吸除上清夜，每孔加入150μL DMSO溶解，使用酶标仪在490nm波长条件下测定吸光度数值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝样品组吸光度/空白对照组吸光度×100％。

实施例22、化合物D1017、D1018、D1021、D1035的抗氧化细胞实验

使用含10％FBS的DMEM培养基培养H9c2心肌细胞，以1×10⁴/孔的密度接种在96孔板中，于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养生长24h。加入不同浓度(10μM，30μM，100μM，300μM)的D1029、丹参素、川芎嗪、丹参酚酸B预保护1h后，加入150μmol·L^-1的t-BHP处理12h，之后加入MTT继续培养4h，最后吸除上清夜，每孔加入150μL DMSO溶解，使用酶标仪在490nm波长条件下测定吸光度数值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝样品组吸光度/空白对照组吸光度×100％。

实施例23、化合物D1029对抗阿霉素诱导的心肌毒性试验

药物处理前24小时，将H9c2细胞以1×10⁴/孔的细胞密度接种于96孔板中，于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养生长48h。将细胞分为正常组，阿霉素模型组，阿霉素与D1029组，阿霉素与右丙亚胺(Dex)组和D1029单独加药组。按照实验分组，同时加入1μM的阿霉素与不同浓度的化合物处理24小时后，取50μL上清液，按照LDH试剂说明书测定各组细胞毒性。在细胞存活率实验中，药物处理后每孔再加入100μL MTT溶液(1mg/mL)，避光孵育4h后吸掉MTT溶液，加入100mL DMSO，用酶标仪检测OD值(570nm)。

实施例24、丹参素衍生物D1016,D1017和D1031对大鼠急性心肌缺血保护作用

大鼠腹腔注射5％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后固定。分离气管连接小动物呼吸机(呼吸频率80次/分，潮气2ml/100g，吸呼比1:1。连接心电记录仪，记录肢体Ⅱ导联。剪开胸部皮肤，逐层分离肌肉，在左侧第3、4肋间打开胸腔，暴露心脏，剪破心包膜，在肺动脉圆锥左缘与左心耳右缘之间，平左心耳下缘2mm处进针，进针深度1-2mm，宽度2-3mm，用5/0无损伤缝合线结扎冠状动脉左前降支，以心电图ST段抬高作为心肌缺血的标志。假手术组只穿线不接扎。结扎10min后，尾静脉注射给药。心肌缺血24小时后，由腹主动脉逆行注入0.5g/L的伊文思蓝2mL，待心脏非缺血区充分染成蓝色后，摘取心脏，用冰生理盐水(4℃)将心脏清洗干净，剪去心底组织、心耳及右心室，置于-80℃冰箱速冻20min，然后自心尖向心底平行于房室沟方向将左室切成1-2mm厚的薄片。将心脏切片置于pH为7.4的1％TTC磷酸盐缓冲液中，37℃孵育15min。冷盐水冲洗去游离染料，10％甲醛固定48小时。染成蓝色的区域代表非缺血区，红色区域(含白色区)代表缺血区，白色区域代表梗塞区。比较不同颜色区域面积大小，分别以心肌梗塞区面积(infarct weight，IW)、缺血区面积(weight of risk，WR)占左室面积(weight of left ventricular，WLV)的百分比(IW/WLV)％、(WR/WLV)％反映心肌梗塞范围、心肌缺血范围。

本文结合一些具体实施方式和实施例对本发明的化合物及其制备方法和应用进行了描述，并且还针对许多细节做了陈述和说明。然而应当理解的是，本文所提供的具体实施方式和实施例只是示例性的，对本发明的保护范围不起限制作用。事实上，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以通过采用其它的具体方式来实施，相应所作的修饰、变更或调整并不脱离本发明的精神和主旨，从而均应被视为包含于本发明的范围之内。

Claims (19)

1.一种丹参素衍生物及其药学上可接受的盐，所述丹参素衍生物具有通式I的结构：

其中：

R₁与R₂相同或不同，各自独立地选自羟基，烷氧基，有机酸酸根，天然α氨基酸酸根；

R₃选自氢，烷基，酰基，氨酰基，以及硫化氢供体基团；

R₄与R₅相同或不同，各自独立地选自氢，烷基或环烷基，但R₄与R₅不能同时为氢；

其中，所述烷基为直链或支链的C1-C15烷基，其可以是含有不饱键的烷基，所述不饱和键为双键、三键或共轭双键；所述环烷基为环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基；所述有机酸酸根为C2-C6有机酸酸根；所述酰基为乙酰基、丙酰基、正丁酰基或正戊酰基；所述天然α氨基酸为甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，苏氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸；所述硫化氢供体基团为如下基团之一：

2.根据权利要求1所述的丹参素衍生物，其中：

所述烷基为C1-C6烷基。

3.根据权利要求1所述的丹参素衍生物，其中：

在R₁与R₂所选自的基团群组中，所述有机酸酸根为乙酸根，所述天然α氨基酸酸根为甘氨酸酸根、精氨酸酸根或半胱氨酸酸根。

4.根据权利要求1所述的丹参素衍生物，其中：

在R₃所选自的基团群组中，所述氨酰基为甘氨酰基。

5.根据权利要求1所述的丹参素衍生物，其中：

在R₃所选自的基团群组中，所述硫化氢供体基团为

6.根据权利要求1所述的丹参素衍生物，其中：

在R₄与R₅所选自的基团群组中，所述烷基为甲基，乙基，丙基或烯丙基。

7.根据权利要求1所述的丹参素衍生物，其具有下述通式II的结构：

8.根据权利要求7所述的丹参素衍生物，在通式II的结构中：R₃为氢，乙酰基或硫化氢供体基团。

9.根据权利要求8所述的丹参素衍生物，其为下述化合物之一：

10.根据权利要求7所述的丹参素衍生物，其中：

R₁和R₂相同为羟基、乙酸根、丙酸根、丁酸根，或以下基团之一：

R₃为氢，乙酰基，甘氨酰基，或

11.根据权利要求10所述的丹参素衍生物，其为下述化合物之一：

12.根据权利要求10所述的丹参素衍生物，其为下述化合物之一：

13.权利要求1-12任一项所述的丹参素衍生物的制备方法，包括：将2,3,5,6-四甲基吡嗪(1)经过氧化生成醛或酯，然后与烷基溴化镁反应生成在羟甲基部位单取代或双取代的2-羟甲基-3,5,6-三甲基吡嗪衍生物中间体(2)，所述吡嗪衍生物中间体(2)与丹参素或其衍生物分子中间体(3)的羧基缩合生成酯，得到酯键附近有取代的丹参素-川芎嗪偶联物(4)；所述偶联物可以直接或者脱去保护基后，使丹参素裸露的的酚羟基或醇羟基与氨基酸或与硫化氢供体反应成酯，得到相应的目标产物(I)；所述方法的合成路线如下所示：

其中，R₁至R₅的定义如权利要求1所述。

14.一种药物组合物，其含有权利要求1-12任一项所述的丹参素衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

15.权利要求1-12任一项所述的丹参素衍生物及其药学上可接受的盐在药物制备中的用途，所述药物用于治疗因钙离子超载和氧化应激引起的疾病。

16.根据权利要求15所述的用途，所述因钙离子超载和氧化应激引起的疾病为因钙离子超载和氧化应激引起的心、肝、肾、脑及眼器官疾病。

17.权利要求1-12任一项所述的丹参素衍生物及其药学上可接受的盐在药物制备中的用途，所述药物用于治疗心与心血管系统疾病或脑与脑血管系统疾病。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述心与心血管系统疾病为：心肌梗死、心肌缺血、心脏缺血再灌注、冠心病，心绞痛、心力衰竭、心律失常、心室纤维化、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化。

19.根据权利要求17所述的用途，其中所述脑与脑血管系统疾病为：脑缺血，帕金森症，阿尔茨海默症，肌肉萎缩性侧索硬化症，共济失调毛细血管扩张症，牛海绵状脑病，克雅二氏病，顿舞蹈症，小脑萎缩症，多发性硬化症，原发性侧索硬化，脊髓性肌萎缩症。