CN105277628B

CN105277628B - 通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法

Info

Publication number: CN105277628B
Application number: CN201410243678.2A
Authority: CN
Inventors: 朱丽君; 崔金凤; 李纬; 范婧; 黄海燕; 李战
Original assignee: CHANG'AO SCIENCE AND TECHNOLOGY OF MEDICAL INDUSTRY Co Ltd NANJING
Current assignee: CHANG'AO SCIENCE AND TECHNOLOGY OF MEDICAL INDUSTRY Co Ltd NANJING
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2034-07-07
Also published as: CN105277628A

Abstract

本发明公开了一种通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法，采用以下方式：色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％三乙胺溶液‑乙腈为流动相，检测波长210～310nm，柱温20～45℃，流动相速度0.5～2.0ml/min，其中三乙胺溶液为含体积分数0.1％的三乙胺，用磷酸调节pH值至3.0～7.5；样品溶液配制：采用极性溶剂分别配制含雷美替胺及其杂质各0.01～2.0mg/ml的溶液；测定：将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。利用本发明的方法可以准确的进行原料药雷美替胺及其制剂的有关物质的定量分析，从而保证了雷美替胺及其制剂的质量可控性。

Description

通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法。

背景技术

雷美替胺(Ramelteon)是日本武田公司(TAKEDA)开发的用于治疗难以入睡型失眠症和慢性失眠和短期失眠的新分子药物，是目前唯一上市的用于治疗难入睡型失眠症褪黑素受体激动剂，对慢性失眠和短期失眠也有确切疗效。由于本品无依赖性和药物滥用倾向，FDA将其列为不受管制的催眠药物。雷美替胺于2005年在美国上市，商品名：ROZEREM，2008年在日本上市，商品名：ロゼレム

雷美替胺的化学名为(S)-N-[2-(1，6，7，8-四氢-2H-茚并-[5，4-b]呋喃-8-基)乙基]丙酰胺，分子式：C₁₆H₂₁NO₂，结构式如下：

雷美替胺的常见不良反应为头痛、疲劳、嗜睡，可能由其中的杂质引起。雷美替胺合成过程中的起始原料、中间体、终产物类似物及降解产物等均可能成为杂质，从而影响产品的质量。因此，对原料药及制剂进行质量控制是药物研发工作中的重点和难点。

雷美替胺相关的杂质包括：LM-1、S-IBU(S-布洛芬)、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、雷美替胺对映异构体，其结构式和化学式等信息如下表所示：

杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、对映异构体为雷美替胺合成过程中较易引入的杂质，LM-1、S-IBU为合成雷美替胺的起始原料。对映异构体采用手性色谱条件分离控制。因此，对杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、LM-1、S-IBU这八个相关物质的定量控制具有重要意义。

专利申请CN200580038847.8公开了光学活性的胺衍生物的制备方法，并记载了以pH7.0磷酸盐缓冲液-乙腈体系为流动相用高效液相色谱法分离测定原料药雷美替胺中的杂质1和杂质2的含量。

文献“Stability-indicating uplc method for determination of ramelteonand their degradation products in active pharmaceutical ingredients,Journalof Liquid Chromatography&Related Technologies,2012,35(5):688-699”公开了利用超高效液相色谱法对雷美替胺中的杂质进行定性推断和定量分析的方法，涉及的杂质包括未成盐的LM-1及合成LM-1的工艺路线中的各步中间体等4个杂质。

目前尚未见关于雷美替胺与上述八个杂质的分离测定方法的文献报道，寻找一种能够分离测定雷美替胺与该八个杂质的方法对于控制雷美替胺的质量、提高药品疗效、降低毒副作用迫在眉睫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法以克服现有技术的不足，可以对雷美替胺原料药或其制剂进行相关杂质的分离测定。

本发明是通过以下技术手段实现的：

一种通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法，采用以下方式进行：

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以三乙胺溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，检测波长210～310nm，柱温20～45℃，流动相速度0.5～2.0ml/min，其中三乙胺溶液为含体积分数0.1％的三乙胺并用磷酸调节pH值至3.0～7.5；

样品溶液配制：采用极性溶剂分别配制含雷美替胺及其杂质各0.01～2.0mg/ml的溶液；

测定：将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。

所述的通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法，其中所述梯度洗脱为初始流动相中0.1％三乙胺溶液和乙腈的体积比为63:37～73:27，最终流动相中0.1％三乙胺溶液和乙腈体积比为63:37～73:27。

进一步，流动相中0.1％三乙胺溶液和乙腈的体积比随时间变化如下：

时间(分钟)	0.1％三乙胺溶液(％)	乙腈(％)
			0	63～73	37～27
25	63～73	37～27
			30	30～40	70～60
50	30～40	70～60
			60	63～73	37～27

以上所述的通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法，检测波长优选230nm。

以上所述的通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法，柱温优选30℃。

以上所述的通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法，流动相速度优选1.0ml/min。

以上所述的通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法，样品溶液配制采用的极性溶剂优选甲醇、50％乙腈水溶液或乙腈。

以上所述的通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法，样品溶液配制成含雷美替胺1.0mg/ml,杂质各0.01mg/ml的溶液。

本发明的有益效果：采用本发明的方法控制雷美替胺中的杂质含量，可以实现雷美替胺与各杂质的完全分离，其与各杂质的分离度均大于2.0，理论板数按雷美替胺峰计算达到7139。且检测灵敏度非常高，雷美替胺、LM-1、S-IBU、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6的检测限分别为0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.2ng(0.002％)、0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.19ng(0.002％)。利用本发明的方法可以准确的进行原料药雷美替胺及其制剂的有关物质的定量分析，从而保证了雷美替胺及其制剂的质量可控性。

附图说明

图1：实施例1雷美替胺及其杂质分离的图谱；

图2：实施例1雷美替胺杂质测定的图谱；

图3：实施例1雷美替胺片杂质测定的图谱；

图4：实施例1雷美替胺片杂质测定的空白辅料图谱；

图5：实施例2雷美替胺系统适用性溶液分离的图谱；

图6：实施例2雷美替胺杂质测定的图谱；

图7：实施例2雷美替胺片杂质测定的图谱；

图8：实施例2雷美替胺片杂质测定的空白辅料图谱；

图9：实施例3雷美替胺系统适用性溶液分离的图谱；

图10：实施例3雷美替胺杂质测定的图谱；

图11：实施例3雷美替胺片杂质测定的图谱；

图12：实施例3雷美替胺片杂质测定的空白辅料图谱；

图13：参考例1雷美替胺及其杂质分离的图谱。

具体实施方式

以下实施例仅对本发明内容做进一步说明，并不限定本发明。

以下实施例所用的LM-1购自上海皓源化学科技有限公司；S-IBU购自萨恩化学技术(上海)有限公司；雷美替胺对照品、雷美替胺供试品、雷美替胺片、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6均为南京长澳医药科技有限公司自制。

实施例1

仪器：戴安U3000PDA型高效液相色谱仪；

色谱柱：AgilentZORBAXSB-AQC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：流动相A为0.1％三乙胺溶液(用磷酸调节pH6.0)，流动相B为乙腈，照下表进行梯度洗脱：

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：230nm。

定位溶液的配制：取LM-1、S-IBU、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、雷美替胺对照品各适量，分别加50％乙腈溶液溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为定位溶液。

雷美替胺与杂质混合溶液的配制：取雷美替胺供试品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入上述各杂质定位溶液0.1ml，再用50％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

雷美替胺系统适用性溶液的配制：取杂质6对照品约10mg，置10ml量瓶中，加50％乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液。取雷美替胺对照品约10mg，置10ml量瓶中，精密加入上述母液0.1ml，加50％乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

雷美替胺供试品溶液的配制：精密称取雷美替胺供试品适量，用50％乙腈溶液溶解并稀释制成1.0mg/ml的溶液。

雷美替胺片供试品溶液的配制：精密称取雷美替胺片粉适量，用50％乙腈溶液溶解并稀释制成1.0mg/ml的溶液，过0.45μm的有机滤膜，即得。

雷美替胺片空白辅料溶液的配制：精密称取雷美替胺制剂的空白辅料适量，用50％乙腈溶液溶解并稀释制成相应浓度的溶液，过0.45μm的有机滤膜，即得。

测定：取定位溶液各10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果S-IBU、LM-1、杂质1、杂质6、雷美替胺、杂质2、杂质4、杂质5和杂质3依次出峰,保留时间分别为4.530min、7.103min、9.813min、11.533min、12.157min、16.053min、33.603min、37.217min、37.677min。取雷美替胺与杂质的混合溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，雷美替胺峰与杂质6峰和杂质2峰的分离度分别为2.06和9.39，其他相邻杂质峰间分离度依次为14.15、7.72、5.71、58.52、18.44、1.81，均符合要求。取雷美替胺供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2，按自身对照法计算，雷美替胺的总杂质含量为0.10％，杂质6含量为0.03％，其它各已知杂质均未检出。取雷美替胺片制剂供试品溶液和空白辅料溶液各10μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果分别见图3和4，结果显示空白辅料无干扰，按自身对照法计算，雷美替胺片的总杂质含量为0.14％，杂质6含量为0.03％，其它各已知杂质均未检出。所以本法可以用于雷美替胺原料及制剂的质量控制。

实施例2

仪器：戴安U3000高效液相色谱仪；

色谱柱：DikmaC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：流动相A为0.1％三乙胺溶液(用磷酸调节pH3.0)，流动相B为乙腈，照下表进行梯度洗脱：

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：230nm。

溶液配制方法及测定方法照实施例1进行，雷美替胺系统适用性溶液、雷美替胺供试品溶液、雷美替胺片溶液、雷美替胺片空白辅料溶液的图谱分别见图5、6、7、8。

实施例3

仪器：Agilent1200HPLC；

色谱柱:Phenomenex luna-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：流动相A为0.1％三乙胺溶液(用磷酸调节pH7.5)，流动相B为乙腈，照下表进行梯度洗脱：

柱温：30℃；

流速：1.5ml/min；

检测波长：230nm。

溶液配制方法及测定方法照实施例1进行，雷美替胺系统适用性溶液、雷美替胺供试品溶液、雷美替胺片粉溶液、雷美替胺片空白辅料溶液的图谱分别见图9、10、11、12。

实施例4专属性试验

本发明人对雷美替胺进行了破坏降解试验，用强光照射、高温、酸(碱)水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解途径及降解产物，考察所产生的降解产物与主峰的分离情况，并采用光二极管阵列检测器进行主峰纯度检查。

a.样品溶液：取本品适量，精密称定，加50％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液，摇匀。

b.光破坏溶液：取本品适量，置紫外光灯下(254nm)放置24小时后，精密称取适量，用50％乙腈溶解并稀释制成1.0mg/ml的溶液，摇匀。

c.热破坏溶液：取本品适量，于105℃烘箱内放置16小时后，精密称取适量，用50％乙腈溶解并稀释制成1.0mg/ml的溶液，摇匀。

d.酸破坏溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入1mol/L的盐酸2ml，80℃放置4小时后，取出，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH值至中性，用50％乙腈溶解并稀释制成1.0mg/ml的溶液，摇匀。

e.碱破坏溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，80℃放置4小时后，取出，用0.1mol/L盐酸调节pH值至中性，用50％乙腈溶解并稀释制成1.0mg/ml的溶液，摇匀。

f.氧化破坏溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入30％双氧水80℃放置4小时后，取出，用50％乙腈溶解并稀释制成0.5mg/ml的溶液，摇匀。

精密量取上述溶液各10μl注入液相色谱仪，同时使用DAD检测器对各溶液进行200～400nm的UV波长扫描，结果见表：

结果显示，本品固体状态下对高温较稳定，在酸+热、碱+热、氧化+热、光条件下降解较明显。在此色谱条件下，本品经过各种强力破坏后，主峰前后的杂质峰与本品主峰均能达基线分离，空白溶剂均无干扰。经过全波长扫描的主峰纯度分析可知主峰纯度均达990以上，因此本色谱条件专属性良好。

实施例5检测限试验

取雷美替胺、LM-1、S-IBU、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6各适量，精密称定，用50％乙腈溶解并逐渐稀释制成一系列低浓度的溶液，分别进样，直至S/N≥3时，即为检测限，结果：雷美替胺、LM-1、S-IBU、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6的检测限分别为0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.2ng(0.002％)、0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.4ng(0.004％)、0.19ng(0.002％)。参考例1参考专利CN200580038847.8的实施例3中的分析方法

仪器：戴安U3000PDA型高效液相色谱仪；

色谱柱:Agilent ZORBAXSB-AQC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：流动相A为0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)/乙腈(4:1)的混合溶液，流动相B为0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)/乙腈(3:7)的混合溶液，按下表进行梯度洗脱；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：230nm。

溶液配制方法及测定方法照实施例1进行，结果显示，以上色谱条件中杂质3和杂质5均不出峰，其他各杂质与雷美替胺主峰间及各杂质间均可分离，出峰顺序依次为：LM-1、S-IBU、杂质1、杂质6、雷美替胺、杂质2、杂质4，雷美替胺与杂质混合溶液的图谱见图13。

Claims

1.一种通过高效液相色谱法分离测定雷美替胺及其杂质的方法，所述杂质为LM-1、S-IBU(S-布洛芬)、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6和雷美替胺对映异构体，所述杂质结构式为：

其特征在于，采用以下方式进行：

色谱条件：检测波长230nm，柱温30℃，流动相速度0.5～2.0ml/min，以0.1％三乙胺溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，其中三乙胺溶液为含体积分数0.1％的三乙胺并用磷酸调节pH值至3.0～7.5，流动相中0.1％三乙胺溶液和乙腈的体积比随时间变化如下：

样品溶液配制：采用极性溶剂分别配制含雷美替胺及其杂质各0.01～2.0mg/ml的溶液；测定：将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相速度为1.0ml/min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，样品溶液配制采用的极性溶剂为甲醇、乙腈或50％乙腈水溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，样品溶液配制为含雷美替胺1mg/ml,杂质各0.01mg/ml的溶液。