CN105274218A - 指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒，其采用实时荧光定量PCR法测定肉苁蓉生药材四个基因的表达值，所用引物序列如下：SEQ1；SEQ2；SEQ3；SEQ4；其中基因SEQ2为与总苷含量呈正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关；基因SEQ4为内参基因。本发明采用二代测序技术及HPLC技术鉴定到三个和苁蓉总苷含量协同变化的基因，利用实时荧光定量PCR快速指示生药材主要药用成分含量的方法，为肉苁蓉生药材分级、高效的产品开发等应用提供指导及标准参考；具有特异性强、灵敏度高、高效快速的特点。

Description

指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，是一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒。

背景技术

肉苁蓉被称为“沙漠人参”，具有极高的药用价值，是广泛使用的中国传统的名贵中药材，早在1,800多年前的《神农本草经》就已有记载。肉苁蓉味甘、性温，具有补肾壮阳、增强免疫、养血润燥、延年益寿、保肝护肝等功效。肉苁蓉药食两用，在历史上就被西域各国作为珍品上贡朝廷，也是历代补肾壮阳类处方中使用频度最高的补益药物之一。肉苁蓉的宜食人群主要包括：体虚便秘、产后便秘、病后便秘及老年便秘者；患有男子遗精、早泄、阳痿、精子稀少不育等病症者；妇女带下、不孕症、四肢不温、月经不调、腰膝酸痛等病症患者以及高血压患者。忌食人群主要是经常大便溏薄者。

目前，家庭生活中，肉苁蓉主要用于泡酒、泡茶、煮粥、炖汤等，国内外都有众多的肉苁蓉制品投放市场，有肉苁蓉优质饮片、提取物、配方颗粒、肉苁蓉胶囊、茶包、速溶茶、肉苁蓉酒保健品等。近年来随着人民生活水平的提高和人口老龄化，人们对保健品的需求量也越来越大，因此肉苁蓉的用量也逐年增大。但是在肉苁蓉的生药材市场中，其来源混乱，主要药用成分差异不明确，分级开发及应用还有待提高和加强。

肉苁蓉的主要药用成分为苯乙醇苷(Phenylethanoidglycosides,PhGs)类化合物，随着分离提取和检测技术的飞速发展，至今已从肉苁蓉肉质茎中分离出20多种类型的苯乙醇苷，目前，对肉苁蓉的质量评价主要是对其所含的松果菊苷和毛蕊花糖苷进行测定，《中国药典》2010年版肉苁蓉项下也将上述两个成分定为药用价值指标。常用的测定方法有薄层色谱(TLC)分析和高效液相色谱法(HPLC)等。但是，对于肉苁蓉苯乙醇苷含量的检测，上述这些主要的检测方法，都需要将采挖回来的肉苁蓉，先进行至少半个月的晾干处理，晾干后进行研磨，该过程耗时长，且实验流程繁琐、复杂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在生药材采挖后提供一种简单有效的快速指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的方法；本发明还提供一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：采用实时荧光定量PCR法测定肉苁蓉生药材中下述引物序列所扩增基因的表达值：

SEQ1：正向引物GCAGCGCCATTATTTGAAC，反向引物AGAGGGGACATGAATCACC；

SEQ2：正向引物GCAGACATGGATGCCCTAC，反向引物TAATTTGGCTGCTCCAAGC；

SEQ3：正向引物GACGGCCAAGCTCTTAGTG，反向引物CTTCCAACATAGCCCACG；

SEQ4：正向引物CCCTTTACGCTCGTTTGG，反向引物TGAATCAAAGACGGTGGAAC；

其中基因SEQ2为与总苷含量呈正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关；基因SEQ4为内参基因。

本发明包括下述步骤：

(1)RNA提取及cDNA反转：提取待测肉苁蓉的总RNA，RNA经纯化后进行逆转录反应；

(2)PCR扩增：对提取RNA的SEQ1、SEQ2和SEQ3进行RT-qPCR反应，SEQ4作为内参基因；

(3)计算总苷含量：A、将生药材分别将分为3个等级，右旗为G₁0～2.5％、G₂2.5％～6.8％和G₃6.8％～14.6％,左旗为G₁0～1.2％、G₂1.2％～2.1％和G₃2.1％～6.0％；

B、根据PCR扩增得到的CT值，采用式(Ⅰ)计算SEQ1、SEQ2和SEQ3三个基因的ΔCT；记为分别与SEQ1、SEQ2、SEQ3对应的n₁、n₂、n₃；

n_i＝2^-ΔCT＝2^{-(CT(所测基因)-CT(内参基因))}(Ⅰ)

其中，T＝1、2、3，分别对应SEQ1、SEQ2、SEQ3；

C、将n₁、n₂、n₃分别与N_i1、N_i2、N_i3按照公式(Ⅱ)计算P_i；

$P_i=\sqrt{{(N_{i1}-n_1)}^2+{(N_{i2}-n_2)}^2+{(N_{i3}-n_3)}^2}---\left(II\right)$

其中，i＝1、2、3，分别对应G₁、G₂、G₃；

右旗中：N₁₁＝0.04、N₁₂＝3.33、N₁₃＝0.38，N₂₁＝0.01、N₂₂＝8.02、N₂₃＝0.06，N₂₁＝0、N₃₂＝21.33、N₃₃＝0.02；

左旗中：N₁₁＝0.02、N₁₂＝1.63、N₁₃＝0.01，N₂₁＝0.01、N₂₂＝4.50、N₂₃＝0.04，N₂₁＝0、N₃₂＝9.64、N₃₃＝0.01；

D、比较P₁、P₂、P₃，总苷含量处于最小P_i所对应的G_i的范围内。

本发明所述步骤(2)PCR扩增的反应条件为：95℃、2min，95℃、15s，然后56℃、30m，72℃、30s；共40个循环。

本发明试剂盒包括RT-qPCR反应液和一组引物，这组引物包括1个正相关变化基因SEQ2的正、反向引物，2个负相关变化基因SEQ1和SEQ3的正、反向引物，1个内参基因SEQ4的正、反向引物。

本发明试剂盒所述RT-qPCR反应液中包括RT-qPCR反应所需的试剂盒酶。

实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR，RT-qPCR)也称为qPCR、qRT-PCR，其基本原理是，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过监测反应过程中荧光信号的不断累积来监测整个PCR过程，待反应结束后通过标准曲线对样品中的底物模板DNA进行定量分析。CT值是每个PCR管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数，起始拷贝数越多，CT值越小。PCR体系中每种底物模板的CT值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系。由于已知标准品的起始拷贝数，可据此作出标准曲线，只要获得待测样品的CT值，就可以通过与标准曲线比较计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、检测耗时少等优势，整个过程可在2～3个小时内完成。采用该检测系统，结合我们已有的基因表达和肉苁蓉总苷含量的关系表，即可计算转换指示待测样本的总苷含量级别，是一种快速、有效并且操作简单的方法，整个检测过程可以缩短在一至两天内高通量实现。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明采用与肉苁蓉总苷含量协同变化的基因检测，能达到对左旗和右旗肉苁蓉生药材的总苷含量进行快速指示并分级的效果；只需提供极少量采挖出来的新鲜肉苁蓉样品，可在两天内完成检测，无需对新鲜生药材进行晾干，大大缩短了检测周期。

本发明采用二代测序技术及HPLC技术鉴定到三个和苁蓉总苷含量协同变化的基因，利用实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR，RT-qPCR)即可快速指示生药材主要药用成分含量范围的快速检测方法，为肉苁蓉生药材分级、高效的产品开发等应用提供指导及标准参考；具有特异性强、灵敏度高、高效快速的特点。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明右旗3个基因表达与总苷含量的协同变异图；

图2是本发明左旗3个基因表达与总苷含量的协同变异图；

图3是本发明协同变异正相关基因引物的特异扩增曲线图；

图4是本发明协同变异负相关基因引物的特异扩增曲线图。

具体实施方式

本指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒的设计过程如下所述：

首先，确定与肉苁蓉生药材总苷含量协同变异的基因。分别采集来自内蒙古阿拉善盟左旗和右旗两个肉苁蓉主产地的多份肉质茎材料，分别采用高通量测序获得肉质茎的转录本序列信息和基因表达信息，和采用高效液相色谱法(HPLC)测量获得对应肉苁蓉肉质茎样品的总苷(松果菊苷和毛蕊花糖苷)含量。通过转录本基因表达与总苷含量的协同变化分析，确定3个与肉苁蓉生药材总苷含量协同变化的基因。基因SEQ2为与总苷含量呈正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关，结果见附图1和附图2；协同变异正相关基因引物的特异扩增曲线见图3，协同变异负相关基因引物的特异扩增曲线见图4。

其次，设计三套特异性强、灵敏度高、可高效快速检测上述基因表达值的引物序列；3个与肉苁蓉生药材总苷含量协同变异的基因的引物序列见表1，其中Left和Right分别为正向引物序列和反向引物序列信息。

表1：引物序列信息

ID	Left	Right
			SEQ1	GCAGCGCCATTATTTGAAC	AGAGGGGACATGAATCACC
SEQ2	GCAGACATGGATGCCCTAC	TAATTTGGCTGCTCCAAGC
			SEQ3	GACGGCCAAGCTCTTAGTG	CTTCCAACATAGCCCACG
SEQ4	CCCTTTACGCTCGTTTGG	TGAATCAAAGACGGTGGAAC

最后，快速检测试剂盒的构建及检测方法的建立：本指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测试剂盒，包括RT-qPCR反应液和一组引物，这组引物包括1个正相关差异基因(SEQ2)的正、反向引物，2个负相关差异基因(SEQ1和SEQ3)的正、反向引物，1个内参基因(SEQ4)的正、反向引物；其中，RT-qPCR反应液还包括常规RT-qPCR反应所需的试剂盒酶。

本指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法的具体检测步骤如下所述：

(1)RNA提取：依照操作说明书使用TRIzol试剂盒提取肉苁蓉的总RNA，实验步骤如下：

(A)先将研钵用液氮遇冷，每次取适量水稻叶片组织放入加有液氮的研钵中，充分研磨组织块(成粉末状)。

(B)将研粹的粉末样品转入2mL离心管中，加入1mL的Trizol试剂悬浮，使其裂解，再加入0.5ml的Trizol试剂悬浮，使其充分裂解，保存于-80℃或进行RNA提取。

(C)向上述离心管中加入300μL(1/5体积)氯仿，充分混匀(用力不要十分剧烈)，萃取去除杂蛋白，冰上静置5分钟。(注：禁用漩涡震荡器，以免基因组DNA断裂，造成基因组DNA污染)

(D)4℃、13000转/分钟，离心15分钟，此时溶液分为三层：下层的酚-氯仿，白色浑浊的中间相多为变性蛋白，上层的是水相(RNA所在相)，转上清约900μL于另一干净2mL离心管中。

(E)向上清中加入等体积(约900μl)氯仿，充分混匀，室温静置5分钟。

(F)4℃、13000转/分钟，离心15分钟，转上清于另一干净2mL离心管中。

(G)加入等体积异丙醇和2μL20mg/ml糖原，充分混匀，-80℃沉淀4小时以上或沉淀过夜。

(H)4℃、14000转/分钟，离心30分钟，弃上清，加入1mL的75％乙醇，洗涤沉淀，4℃、14000转/分钟，离心5分钟。

(I)弃上清，室温晾干沉淀。

(J)加入适量体积(约20～50μL)RNasefree水溶解沉淀。

(K)应用琼脂糖电泳检测RNA的完整性，完整的RNA其28S亮度是18S的至少1倍；

(L)检测OD值：纯RNA样品的OD260/OD280值为1.9～2.1。

(2)RNA的纯化：采用DNaseI(RNase-free)消化所得RNA样本中的杂质,具体步骤如下：

(A)所得RNA每60μl中依次加入10μl的10×DNaselBuffer、2μl的RNaseInhibitor、2μl的DNasel、26μl的NF-Water，总体积为100μl；

(B)37℃水浴10min，洗涤沉淀；

(C)加入10μl的3M醋酸钠，330μl无水乙醇，2μl糖原，置于-80℃沉淀过夜；

(D)4℃，14000转/分钟，离心40min；

(E)加入1ml，75％乙醇，14000转/分钟，4℃，离心5min；

(F)晾干后加入NF-water溶解。

(3)cDNA反转：采用GoTaq2-StepRT-qPCRsystem试剂盒进行逆转录，配制如下反应体系如表2，所有操作均在冰上完成。反转录反应条件：42℃，15min的延伸与70℃，15min的反转录酶灭活。

表2：逆转录反应体系

(4)PCR扩增：逆转录的cDNA稀释10倍用于RT-qPCR，RT-qPCR反应体系见表3，反应条件为：95℃、2min，95℃、15s，然后56℃、30m，72℃、30s，共40个循环。反应在7500Real-TimePCRDetectionSystem上完成；SEQ4作为内参基因，实验结果利用7500softwarev2.3软件进行分析。

表3：RT-qPCR反应体系

(5)结果判定：

依据已获得的左旗和右旗产地肉苁蓉的基因表达和总苷含量(每克肉苁蓉粉末中的百分含量)的数据，可将生药材分别将分为3个等级，右旗为(0～2.5％)、(2.5％～6.8％)和(6.8％～14.6％)；左旗为(0～1.2％)、(1.2％～2.1％)和(2.1％～6.0％)，具体结果的判定方法如下：

A、根据PCR扩增得到的CT值，采用式(Ⅰ)计算SEQ1、SEQ2和SEQ3三个基因的2^-ΔCT；记为n₁、n₂、n₃，分别与SEQ1、SEQ2、SEQ3对应；

2^-ΔCT＝2^{-(CT(待测基因)-CT(内参基因))}(Ⅰ)

其中，T＝1、2、3，分别对应SEQ1、SEQ2、SEQ3；

B、将步骤1所得的(n₁，n₂，n₃)分别与(N₁₁，N₁₂，N₁₃)、(N₂₁，N₂₂，N₂₃)、(N₃₁，N₃₂，N₃₃)，根据所取肉苁蓉产地左旗或者右旗选择表4或者表5；按照下列公式计算P_i；计算公式见式(Ⅱ)：

$P_i=\sqrt{{(N_{i1}-n_1)}^2+{(N_{i2}-n_2)}^2+{(N_{i3}-n_3)}^2}---\left(II\right)$

其中，i＝1、2、3，分别对应G₁、G₂、G₃。

C、比较P₁、P₂、P₃的大小，判定总苷含量为Gi范围；总苷含量处于最小P_i所对应的G_i的范围内，即：

如果P₁最小，则判定该肉苁蓉总苷含量属于G₁(右旗0～2.5％，左旗0～1.2％)的范围；

如果P₂最小，则判定该肉苁蓉总苷含量属于G₂(右旗2.5％～6.8％，左旗1.2％～2.1％)的范围；

如果P₃最小，则判定该肉苁蓉总苷含量属于G₃(右旗6.8％～14.6％，左旗2.1％～6.0％)的范围。

表4：右旗RT-qPCR判定对照数据

右旗	2-ΔCт(N1)	2-ΔCт(N2)	2-ΔCт(N3)
				总苷含量	0～2.5(G1)	2.5～6.8(G2)	6.8～14.6(G3)
SEQ1	0.04(N11)	0.01(N21)	0(N31)
				SEQ2	3.33(N12)	8.02(N22)	21.23(N32)
SEQ3	0.38(N13)	0.06(N23)	0.02(N33)

表5：左旗RT-qPCR判定对照数据

左旗	2-ΔCт(N1)	2-ΔCт(N2)	2-ΔCт(N3)
				总苷含量	0～1.2(G1)	1.2～2.1(G2)	2.1～6.0(G3)
SEQ1	0.02(N11)	0.01(N21)	0(N31)
				SEQ2	1.63(N12)	4.50(N22)	9.64(N32)
SEQ3	0.01(N13)	0.04(N23)	0.01(N33)

实施例1：测试随机取样肉苁蓉的总苷含量(样品采集地：内蒙左旗)。

(1)RNA提取；

(2)RNA纯化；

(3)逆转录反应；

(4)RT-qPCR反应；

(5)根据PCR结果计算总苷含量范围：根据实验得到4个基因的CT值分别为：SEQ1为33.90369415，SEQ2为27.05919711，SEQ3为34.07738368，SEQ4为30.52809588，计算得到n₁、n₂、n₃：

n₁＝2^{-(CT(SEQ1)-CT(SEQ4))}＝0.096348214

n₂＝2^{-(CT(SEQ2)-CT(SEQ4))}＝11.0724208

n₂＝2^{-(CT(SEQ3)-CT(SEQ4))}＝0.085419674

根据公式(Ⅱ)计算得到P₁、P₂、P₂，利用表5的数据，左旗中：N₁₁＝0.02、N₁₂＝1.63、N₁₃＝0.01，N₂₁＝0.01、N₂₂＝4.50、N₂₃＝0.04，N₂₁＝0、N₃₂＝9.64、N₃₃＝0.01，最后比较3个P_i值：

$P_1=\sqrt{{(N_{11}-n_1)}^2+{(N_{12}-n_2)}^2+{(N_{13}-n_3)}^2}=9.443030648$

$P_2=\sqrt{{(N_{21}-n_1)}^2+{(N_{22}-n_2)}^2+{(N_{23}-n_3)}^2}=6.573144923$

$P_3=\sqrt{{(N_{31}-n_1)}^2+{(N_{32}-n_2)}^2+{(N_{33}-n_3)}^2}=1.437637112$

比较可知P₃最小，那么判定总苷含量的范围为G3(2.1％～6.0％)。

通过高效液相色谱法(HPLC)测量该样本的总苷含量为2.16％，可知，与通过本检测方法得到的总苷含量范围一致。

实施例2：测试随机取样肉苁蓉的总苷含量(样品采集地：内蒙右旗)。

(1)RNA提取；

(2)RNA纯化；

(3)逆转录反应；

(4)RT-qPCR反应；

(5)根据PCR结果计算总苷含量范围：根据实验得到4个基因的CT值分别为：SEQ1为32.59574763，SEQ2为28.58986219，SEQ3为34.18855667，SEQ4为29.99904887，计算得到n₁、n₂、n₃：

n₁＝2^{-(CT(SEQ1)-CT(SEQ4))}＝0.096348214

n₂＝2^{-(CT(SEQ2)-CT(SEQ4))}＝11.0724208

n₂＝2^{-(CT(SEQ3)-CT(SEQ4))}＝0.085419674

根据公式(Ⅱ)计算得到P₁、P₂、P₂，利用表4的数据，右旗中：N₁₁＝0.04、N₁₂＝3.33、N₁₃＝0.38，N₂₁＝0.01、N₂₂＝8.02、N₂₃＝0.06，N₂₁＝0、N₃₂＝21.33、N₃₃＝0.02，最后比较3个P_i值：

$P_1=\sqrt{{(N_{11}-n_1)}^2+{(N_{12}-n_2)}^2+{(N_{13}-n_3)}^2}=1.54064E-10$

$P_2=\sqrt{{(N_{21}-n_1)}^2+{(N_{22}-n_2)}^2+{(N_{23}-n_3)}^2}=2.655873958$

$P_3=\sqrt{{(N_{31}-n_1)}^2+{(N_{32}-n_2)}^2+{(N_{33}-n_3)}^2}=0.054806552$

比较可知P₁最小，那么判定总苷含量的范围为G1(0％～2.5％)。通过高效液相色谱法(HPLC)测量该样本的总苷含量为2.35％，可知，与通过本检测方法得到的总苷含量范围一致。

Claims (5)

1.一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法，其特征在于：采用实时荧光定量PCR法测定肉苁蓉生药材中下述引物序列所对应基因的表达：

SEQ1：正向引物GCAGCGCCATTATTTGAAC，反向引物AGAGGGGACATGAATCACC；

SEQ2：正向引物GCAGACATGGATGCCCTAC，反向引物TAATTTGGCTGCTCCAAGC；

SEQ3：正向引物GACGGCCAAGCTCTTAGTG，反向引物CTTCCAACATAGCCCACG；

SEQ4：正向引物CCCTTTACGCTCGTTTGG，反向引物TGAATCAAAGACGGTGGAAC；

其中基因SEQ2为与总苷含量呈正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关；基因SEQ4为内参基因。

2.根据权利要求1所述的指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法，其包括下述步骤：

(1)RNA提取及cDNA反转：提取待测肉苁蓉的总RNA，RNA经纯化后进行逆转录反应；

(2)PCR扩增：对提取RNA的SEQ1、SEQ2和SEQ3进行RT-qPCR反应，SEQ4作为内参基因；

(3)计算总苷含量：

A、将生药材分别分为3个等级，右旗为G₁0～2.5％、G₂2.5％～6.8％和G₃6.8％～14.6％,左旗为G₁0～1.2％、G₂1.2％～2.5％和G₃2.5％～6.0％；

B、根据PCR扩增得到的CT值，采用式(Ⅰ)计算SEQ1、SEQ2和SEQ3三个基因的ΔCT；记为分别与SEQ1、SEQ2、SEQ3对应的n₁、n₂、n₃；

n_i＝2^-ΔCT＝2^{-(CT(所测基因)-CT(内参基因))}(Ⅰ)

其中，T＝1、2、3，分别对应SEQ1、SEQ2、SEQ3；

C、将n₁、n₂、n₃分别与N_i1、N_i2、N_i3按照公式(Ⅱ)计算P_i；

$P_i=\sqrt{{(N_{i1}-n_1)}^2+{(N_{i2}-n_2)}^2+{(N_{i3}-n_3)}^2}---\left(II\right)$

其中，i＝1、2、3，分别对应G₁、G₂、G₃；

右旗中：N₁₁＝0.04、N₁₂＝3.33、N₁₃＝0.38，N₂₁＝0.01、N₂₂＝8.02、N₂₃＝0.06，N₂₁＝0、N₃₂＝21.33、N₃₃＝0.02；

左旗中：N₁₁＝0.02、N₁₂＝1.63、N₁₃＝0.01，N₂₁＝0.01、N₂₂＝4.50、N₂₃＝0.04，N₂₁＝0、N₃₂＝9.64、N₃₃＝0.01；

D、比较P₁、P₂、P₃，总苷含量处于最小P_i所对应的G_i的范围内。

3.根据权利要求2所述的指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)PCR扩增的反应条件为：95℃、2min，95℃、15s，然后56℃、30m，72℃、30s；共40个循环。

4.一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测试剂盒，其特征在于：其包括RT-qPCR反应液和一组引物，这组引物包括1个正相关变化基因SEQ2的正、反向引物，2个负相关变化基因SEQ1和SEQ3的正、反向引物，1个内参基因SEQ4的正、反向引物；其中，

SEQ1：正向引物GCAGCGCCATTATTTGAAC，反向引物AGAGGGGACATGAATCACC；

SEQ2：正向引物GCAGACATGGATGCCCTAC，反向引物TAATTTGGCTGCTCCAAGC；

SEQ3：正向引物GACGGCCAAGCTCTTAGTG，反向引物CTTCCAACATAGCCCACG；

SEQ4：正向引物CCCTTTACGCTCGTTTGG，反向引物TGAATCAAAGACGGTGGAAC。

5.根据权利要求4所述的指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测试剂盒，其特征在于：所述RT-qPCR反应液中包括RT-qPCR反应所需的试剂盒酶。