CN105273216B - 三维立体超褶皱聚乳酸微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种三维立体超褶皱聚乳酸微球及其制备方法与用途，所述维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法为采用Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的碳酸氢铵去离子水溶液作为内相，聚乳酸的二氯甲烷溶液作为中间相，聚乙烯醇的去离子水溶液作为外相，得到三维立体褶皱聚乳酸微球，通过碳酸氢铵产生的气体在乳液界面引入应变力不匹配，并在乳液内部加入纳米颗粒引入多重气化核心，成功实现三维立体褶皱聚乳酸微球的制备，得到的聚乳酸微球用于油水分离和细胞的吸附；本发明所述的三维立体褶皱聚乳酸微球具有多级孔结构、能有效增加比表面积，可以有效利用于油水分离，具有较好的生物相容性、可以有效实现细胞的粘附、具有优异的生物应用前景。

Description

三维立体超褶皱聚乳酸微球的制备方法

技术领域

本发明属于生物功能材料制备领域，尤其是三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法。

背景技术

自然界中存在着这样的神奇界面，如海底珊瑚，上皮组织，植物的叶子等，其表面具有独特的非平面褶皱特性。通过模拟自然界的非平面褶皱可以增强材料的表面功能并推进现今的平面二维应用。研究表明，三维立体褶皱由于其表面褶皱的增强功能和高效的能量摄入，可以广泛应用于如细胞迁移的调节，智能胶，可调谐器件，纳米有序模板，胶体和蛋白质自组装，和各向异性和/或可调的表面润湿性等领域。然而，传统制备方法依然局限于二维褶皱的制备，对于复杂的三维褶皱加工鲜有报道。目前，提出了三维方法褶皱的制作主要是基于硬模板与传统光刻和随后的表面处理(如紫外臭氧辐射(UVO)，反应离子刻蚀和电化学聚合)。但是传统方法制备的三维褶皱材料通常需要耗费大量的时间和精力，并极大地依赖聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)薄膜作为基地材料。一般而言，材料表面产生褶皱的前提是较软的材料基础上的一个薄的一个相对较硬的材料上施加一个临界应力诱导由膜的双层系统界面应力的不匹配。界面应力不匹配之后，再通过表面处理，如机械能和热能驱动的表层变形固化形成褶皱。然而，目前大多数的褶皱材料主要是基于平面或阶梯面处理，可能不适用于三维立体褶皱立体制作。因此，寻求新的简便方法在非平面表面制作可调控的三维立体褶皱微观结构十分迫切。

聚乳酸(PLA)是一种生物可降解，生物相容性良好的生物材料，已被广泛用于三维细胞支架，伤口敷料，抗菌、防污剂等领域。近年来，乳液软模板法，如多重乳液，皮克林乳液，单乳液，皮克林双乳液等，已经在二维材料制备基础上得以广泛应用。其中，W₁/O/W₂双乳液是一种拥有两个界面的微观结构，已被广泛应用于制备中空材料，多孔各向异性微/纳米颗粒等。通过调控在界面上的表面活性剂和微粒可以制备出多功能的PLA材料。虽然双乳液模板法是基于PLA的功能材料设计的一个功能强大的模板法，但是他们仍然局限于二维PLA材料的构建。

为了在双乳液基础上将目前常见的聚乳酸二维材料转变为三维立体褶皱材料，类似于双层系统的二维表面褶皱上的界面应变力不匹配必须被引入到双乳液界面中。一般来说，在软模板界面上，应变力不匹配可以通过增强的力差(即机械不稳定)来实现，并基于这样的二维结构转变为三维立体褶皱。气体形成双乳液关联法，起源于碳酸氢铵的分解，一直被视为一个多功能的工具制备具有内部交联孔室的多孔微球。文章Gas foamed openporous biodegradable polymeric microspheres(气体生成法制备多孔可降解聚合物微球).Biomaterials 2006,27,152-159，与Biodegradable polymeric microcarriers withcontrollable porous structure for tissue engineering(多孔可生物降解的聚合物载体在组织工程中的应用).Macromol.Biosci. 2009,9,1211-1218.证实了气体形成双乳液关联法可以通过控制碳酸氢铵分解形成多孔微球生物支架。此外，利用气体形成双乳液关联法制作不同孔径的改性聚乳酸微球。在溶剂蒸发过程中，碳酸氢铵的自发分解产生二氧化碳(CO₂)和氨气(NH₃)，不仅导致界面上“凸起”的产生，而且有利于多孔结构的最终形成。与此同时，内部气泡的生成有利于在乳液界面产生应变力不匹配，并帮助实现二维材料想三维立体褶皱材料的转变。但是由于气体的形成方法和限制挤压产生的固有的局限性，其内部气化核心有限，尽管内部交联的多孔聚乳酸微球已经成功制备出，他们依然局限于二维材料。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法，通

过碳酸氢铵产生的气体在乳液界面引入应变力不匹配，并在乳液内部加入纳米颗粒引入多重气化核心，成功实现三维立体褶皱聚乳酸微球的制备，得到的聚乳酸微球用于油水分离和细胞的吸附。

本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。

一种三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备二氧化硅包覆的核壳结构的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子；

S2、制备三维立体褶皱聚乳酸微球：加入S1中制备的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的碳酸氢铵去离子水溶液作为内相，聚乳酸的二氯甲烷溶液作为中间相，所述内相与中间相均化形成水包油型(W₁/O)初乳；聚乙烯醇的去离子水溶液作为外相，所述外相与所述初乳均化形成水包油包水型(W₁/O/W₂)双乳液，将所述的双乳液震荡，待所述双乳液中二氯甲烷挥发后，将所得的产物真空干燥后得三维立体褶皱聚乳酸微球。

进一步，S1所述的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的制备方法为包括如下步骤：

(1)将三氯化铁与醋酸钠混合在乙二醇中并于氮气保护下160℃搅拌1h，转入反应釜中 200℃反应10h，磁性分离、洗涤、干燥得四氧化三铁纳米粒子；

(2)将步骤(1)所述的四氧化三铁纳米粒子分散在含氨水的乙醇和水的混合液中，并在搅拌下加入原硅酸四乙酯反应12h，将获得的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子分离、洗涤、干燥。

在上述方案中，S2中所述的碳酸氢铵去离子水溶液的浓度为0.05g/mL；

S2中所述聚乙烯醇的去离子水溶液中聚乙烯醇的浓度为0.001g/mL；

S2中所述聚乳酸、二氯甲烷的用量比为(15.8～62.5)mg：(0.99～1.01)mL。

进一步，S2中所述内相与中间相体积比为5：16；所述初乳与所述外相的体积比为1： 25。

进一步，S2中所述Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的加入量与所述碳酸氢铵的去离子水溶液的用量比为(10～90)mg：(0.99～1.01)mL。

进一步，S2中所Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的加入量与所述碳酸氢铵的去离子水溶液的用量比10mg：1mL。

本发明还包括一种三维立体褶皱聚乳酸微球，其特征在于，所述聚乳酸微球的平均直径为50μm，表面褶皱，具有多级孔结构。

本发明还包括将所述的三维立体褶皱聚乳酸微球作为油水分离的用途。

本发明还包括将所述的三维立体褶皱聚乳酸微球作为粘附细胞的用途。

三维立体超褶皱聚乳酸微球的形成机理：

本发明所述的三维立体褶皱聚乳酸微球的形成机理：(1)反应结束后将双乳液震荡，内相中的碳酸氢铵溶液分解产生的气体，在乳液界面上“凸起”，由于外界表面活性的作用，内部的气泡无法突破油相；因此，随着油相溶剂的挥发，这些“凸起”得以保存，并且在大气压的作用下“凹进”。

(2)内部气体的生成在乳液的两个界面上引入应变力不匹配，随着溶剂的挥发，有利于在生成的微粒表面形成褶皱。

Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子在三维立体褶皱聚乳酸微球的制备过程中起到结构稳定剂、表面褶皱剂和多重气化核心的作用：(1)结构稳定剂，与不加Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子构建的内部微粒主导的气体形成双乳液关联法相比，加入Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子获得三维立体褶皱的聚乳酸微粒，而不加Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子获得片状褶皱聚乳酸微粒，因此在三维立体超褶皱的聚乳酸微粒形成过程中，Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子作为Pickering粒子可以有效地稳固获得的微粒的形貌，从而制备出理想的三维立体超褶皱聚乳酸微粒。

(2)表面褶皱剂：与不加Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子获得的片状褶皱聚乳酸微粒相比，加入 Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子后获得的三维立体超褶皱聚乳酸微粒不仅体现出三维立体构型，而且其表面的褶皱与片状聚乳酸微粒相比明显增加很多，因此在三维立体超褶皱的聚乳酸微粒形成过程中，Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子还可以有效起着表面褶皱剂的作用。

(3)多重气化核心：研究表明，在气体形成过程中，空气中的固体颗粒充当气化核心，诱导气体的生成。因此本发明构建的内部微粒主导的气体形成双乳液关联法，其内部加入Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子可以人为地引入多重气化核心，增加汽化位点，诱导气体的生成，从而在乳液界面上形成更多“凸起”，利于随后超褶皱形貌的形成。

本发明的有益效果：

(1)本发明所述的三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法与传统双乳液和皮克林双乳液相比，本发明中的内相中Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子主导的气体形成双乳液关联法制备的乳液微粒的内外界面分别由纳米颗粒和表面活性剂稳定，开辟了一个崭新领域，可以实现材料从二维向三维立体的转变。

(2)本发明所述的三维立体褶皱聚乳酸微球具有多级孔结构、能有效增加比表面积，可以有效利用于油水分离，具有较好的生物相容性、可以有效实现细胞的粘附、具有优异的生物应用前景。

附图说明

图1中A、B为本发明实施例1所述Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的透射电镜图及其局部放大图。

图2中A、B为本发明实施例1所述的三维立体褶皱聚乳酸微球的扫描电镜图及其局部放大图。

图3为本发明实施例1所述三维立体褶皱聚乳酸微球的透射电镜图及其局部放大图。

图4为本发明实施例1所述三维立体超褶皱聚乳酸微球中在内相中加入不同量Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子后的乳液图及其局部放大图。

图5中A、B、C分别为本发明实施例1所述三维立体超褶皱聚乳酸微球加入10mg、50mg 和90mg Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子制备的产物扫描电镜图，a、b、c分别为相应条件下制备出的三维立体超褶皱聚乳酸微球的表面放大图。

图6中A、B分别为本发明实施例1所述三维立体褶皱聚乳酸微球的动态接触角，及其应用于吸油的效果图。

图7为本发明实施例1所述三维立体褶皱聚乳酸微球粘附细胞后的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

上述技术方案中所述的三维立体超褶皱聚乳酸微球增强的表面性能测试具体为：

(1)油吸附和分离

5毫克本发明所述的三维立体褶皱聚乳酸微球加入8毫升含一滴油滴的小瓶子中震荡数分钟，而后在外界磁铁作用下牵引吸附油滴后的三维立体超褶皱聚乳酸微球并逐步从水溶液中分离出来。根据结果，计算出三维立体超褶皱聚乳酸微球吸油的效率为：

(2)细胞粘附行为研究：

将三维立体超褶皱聚乳酸微球用70％酒精浸泡过夜后与3×10⁷cell/mL成纤维细胞一起于培养基中一起培养24h后，将获得的微球梯度脱水用扫面电镜观察其表面形态变化。

实施例1

1、三维立体超褶皱聚乳酸微球的制备：

(1)制备二氧化硅包覆的核壳结构的Fe₃O₄(Fe₃O₄@SiO₂)纳米粒子：

将4.05g三氯化铁与7.2g醋酸钠混合在40mL乙二醇中并于氮气保护下160℃搅拌1h，转入反应釜中200℃反应10h。随后将获得的四氧化三铁纳米粒子磁性分离并用水和乙醇洗涤各三次。将所得产物进行60℃干燥12h，获得最终四氧化三铁纳米粒子。为了获得二氧化硅包覆的核壳结构的Fe₃O₄(Fe₃O₄@SiO₂)纳米粒子，将获得的四氧化三铁纳米颗粒(10mg) 进一步分散在含氨水的乙醇和水的混合液(9.0毫升水,40毫升乙醇,和1.0毫升氨水)中，并在搅拌下加入0.2毫升原硅酸四乙酯反应12h。将获得的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子分离、洗涤并真空干燥待用。

(2)三维立体超褶皱聚乳酸微球的制备：

将10毫克Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子加入0.05g/mL碳酸氢铵去离子水溶液作为内相，62.5毫克每毫升聚乳酸的二氯甲烷作为中间相，所述内相与中间相在室温反应90s形成水包油型 (W₁/O)初乳；0.001克每毫升聚乙烯醇的去离子水溶液作为外相，所述外相与所述初乳在室温反应60s形成水包油包水型(W₁/O/W₂)双乳液，将合成好的乳液放在30度水浴振荡器中半个小时，待所述双乳液中二氯甲烷挥发后将获得的微球真空干燥得三维立体超褶皱聚乳酸微球。

图1为Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的透射电镜图，由图可知，制备的MSNs-NH₂纳米粒子的平均粒径在500nm左右，且二氧化硅壳层厚度为20nm左右。

图2为三维立体褶皱聚乳酸微球的扫描电镜图及其表面放大图，由图中A可知，三维立体超褶皱聚乳酸微球的平均直径为50μm，且其表面超褶皱。由图中B可知，该三维立体超褶皱聚乳酸微球拥有多级孔结构。

图3为三维立体褶皱聚乳酸微球的投射电镜图，从图中可以看出，该三维立体超褶皱聚乳酸微球内部中空，且加入的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子留在微球内部并嵌在聚乳酸壳层上。

图4为三维立体褶皱聚乳酸微球中在内相中加入不同量Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子后的乳液图，图中A-F加入的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的量分别为0、10、30、50、70、90毫克每毫升，由图可知，不加入Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的时候制备出来的是片状聚乳酸微粒，而加入Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子后才可以获得三维聚乳酸微球，随着Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子加入量的增大，获得的三维立体超褶皱聚乳酸微球粒径分布多分散性增强，且形貌逐步塌陷，加入 Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的量为10毫克每毫升时三维立体褶皱聚乳酸微球形态最好。

图5中A、B、C分别为三维立体褶皱聚乳酸微球加入10、50和90毫克每毫升Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子制备的产物扫描电镜图，a、b、c分别为相应条件下制备出的三维立体超褶皱聚乳酸微球的表面放大图，从图中可以看出，随着Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子用量的增大，获得的微球形貌逐步坍塌。

2、吸附和释放性能研究

(1)取5毫克三维立体超褶皱聚乳酸微球加入8毫升含一滴油滴的小瓶子中震荡数分钟，而后在外界磁铁作用下牵引吸附油滴后的三维立体超褶皱聚乳酸微球并逐步从水溶液中分离出来。

结果表明：三维立体超褶皱聚乳酸微球吸油高达52克每克。

(2)将三维立体超褶皱聚乳酸微球用70％酒精浸泡过夜后与3×10⁷cell/mL成纤维细胞一起于培养基中一起培养24h后，将获得的微球梯度脱水用扫面电镜观察其表面形态变化。

结果表明：成纤维细胞可以很好地粘附在三维立体超褶皱聚乳酸微球上，且其在微球上的细胞形态良好。

图6中A、B分别为三维立体褶皱聚乳酸微球的动态接触角，及其应用于吸油的效果图，获得的三维立体褶皱聚乳酸微球动态水接触角为116°，体现了其一定的疏水性。与含苏丹红三号的二氯甲烷充分震荡后，三维立体超褶皱聚乳酸微球可以有效吸油并且可以应用于随后的磁性分离。

图7为三维立体褶皱聚乳酸微球粘附细胞后的扫描图，从图中可以看出，实施例1获得的三维立体超褶皱聚乳酸微球生物相容性好，无细胞毒性，且细胞可以很好地粘附在微球上，展现了三维细胞培养的效果。

实施例2

1、三维立体超褶皱聚乳酸微球的制备：

(1)制备二氧化硅包覆的核壳结构的Fe₃O₄(Fe₃O₄@SiO₂)纳米粒子：

将4.05g三氯化铁与7.2g醋酸钠混合在40mL乙二醇中并于氮气保护下160℃搅拌1h，转入反应釜中200℃反应10h。随后将获得的四氧化三铁纳米粒子磁性分离并用水和乙醇洗涤各三次。将所得产物进行60℃干燥12h，获得最终四氧化三铁纳米粒子。为了获得二氧化硅包覆的核壳结构的Fe₃O₄(Fe₃O₄@SiO₂)纳米粒子，将获得的四氧化三铁纳米颗粒(10mg) 进一步分散在含氨水的乙醇和水的混合液(9.0毫升水,40毫升乙醇,和1.0毫升氨水)中，并在搅拌下加入0.2毫升原硅酸四乙酯反应12h。将获得的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子分离、洗涤并真空干燥待用。

(2)三维立体超褶皱聚乳酸微球的制备：

将10毫克Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子加入0.05g/mL碳酸氢铵去离子水溶液作为内相，31.25毫克每毫升聚乳酸的二氯甲烷作为中间相，所述内相与中间相在室温反应90s形成水包油型 (W₁/O)初乳；0.001克每毫升聚乙烯醇的去离子水溶液作为外相，所述外相与所述初乳在室温反应60s形成水包油包水型(W₁/O/W₂)双乳液，将合成好的乳液放在30度水浴振荡器中半个小时，待所述双乳液中二氯甲烷挥发后将获得的微球真空干燥得三维立体超褶皱聚乳酸微球。

2、吸附和释放性能研究

(1)取5毫克三维立体超褶皱聚乳酸微球加入8毫升含一滴油滴的小瓶子中震荡数分钟，而后在外界磁铁作用下牵引吸附油滴后的三维立体超褶皱聚乳酸微球并逐步从水溶液中分离出来。

结果表明：三维立体超褶皱聚乳酸微球吸油高达45克每克。

(2)将三维立体超褶皱聚乳酸微球用70％酒精浸泡过夜后与3×10⁷cell/mL成纤维细胞一起于培养基中一起培养24h后，将获得的微球梯度脱水用扫面电镜观察其表面形态变化。

结果表明：成纤维细胞可以很好地粘附在三维立体超褶皱聚乳酸微球上，且其在微球上的细胞形态良好。

实施例3

1、三维立体超褶皱聚乳酸微球的制备：

(1)制备二氧化硅包覆的核壳结构的Fe₃O₄(Fe₃O₄@SiO₂)纳米粒子：

将4.05g三氯化铁与7.2g醋酸钠混合在40mL乙二醇中并于氮气保护下160℃搅拌1h，转入反应釜中200℃反应10h。随后将获得的四氧化三铁纳米粒子磁性分离并用水和乙醇洗涤各三次。将所得产物进行60℃干燥12h，获得最终四氧化三铁纳米粒子。为了获得二氧化硅包覆的核壳结构的Fe₃O₄(Fe₃O₄@SiO₂)纳米粒子，将获得的四氧化三铁纳米颗粒(10mg) 进一步分散在含氨水的乙醇和水的混合液(9.0毫升水,40毫升乙醇,和1.0毫升氨水)中，并在搅拌下加入0.2毫升原硅酸四乙酯反应12h。将获得的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子分离、洗涤并真空干燥待用。

(2)三维立体超褶皱聚乳酸微球的制备：

将10毫克Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子加入0.05g/mL碳酸氢铵去离子水溶液作为内相，15.8毫克每毫升聚乳酸的二氯甲烷作为中间相，所述内相与中间相在室温反应90s形成水包油型 (W₁/O)初乳；0.001克每毫升聚乙烯醇的去离子水溶液作为外相，所述外相与所述初乳在室温反应60s形成水包油包水型(W₁/O/W₂)双乳液，将合成好的乳液放在30度水浴振荡器中半个小时，待所述双乳液中二氯甲烷挥发后将获得的微球真空干燥得三维立体超褶皱聚乳酸微球。

2、吸附和释放性能研究

(1)取5毫克三维立体超褶皱聚乳酸微球加入8毫升含一滴油滴的小瓶子中震荡数分钟，而后在外界磁铁作用下牵引吸附油滴后的三维立体超褶皱聚乳酸微球并逐步从水溶液中分离出来。

结果表明：三维立体超褶皱聚乳酸微球吸油高达40克每克。

(2)将三维立体超褶皱聚乳酸微球用70％酒精浸泡过夜后与3×10⁷cell/mL成纤维细胞一起于培养基中一起培养24h后，将获得的微球梯度脱水用扫面电镜观察其表面形态变化。

结果表明：成纤维细胞可以很好地粘附在三维立体超褶皱聚乳酸微球上，且其在微球上的细胞形态良好。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备二氧化硅包覆的核壳结构的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子；

S2、制备三维立体褶皱聚乳酸微球：加入S1中制备的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的碳酸氢铵去离子水溶液作为内相，聚乳酸的二氯甲烷溶液作为中间相，所述内相与中间相均化形成水包油型（W₁/O）初乳；聚乙烯醇的去离子水溶液作为外相，所述外相与所述初乳均化形成水包油包水型（W₁/O/W₂）双乳液，将所述的双乳液震荡，待所述双乳液中二氯甲烷挥发后，将所得的产物真空干燥后得三维立体褶皱聚乳酸微球。

2.如权利要求1所述的三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，S1所述的Fe₃O₄@SiO₂ 纳米粒子的制备方法为包括如下步骤：

（1）将三氯化铁与醋酸钠混合在乙二醇中并于氮气保护下160℃搅拌1h，转入反应釜中200℃反应10h，磁性分离、洗涤、干燥得四氧化三铁纳米粒子；

（2）将步骤（1）所述的四氧化三铁纳米粒子分散在含氨水的乙醇和水的混合液中，并

在搅拌下加入原硅酸四乙酯反应12h，将获得的Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子分离、洗涤、干燥。

3.如权利要求1或2所述的三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，S2 中所述的碳酸氢铵去离子水溶液的浓度为0.05 g/mL；

S2 中所述聚乙烯醇的去离子水溶液中聚乙烯醇的浓度为0.001 g/mL；

S2 中所述聚乳酸、二氯甲烷的用量比为（15.8~62.5）mg：（0.99~1.01）mL。

4.如权利要求3所述的三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，S2 中所述内相与中间相体积比为5：16；所述初乳与所述外相的体积比为1：25。

5.如权利要求4所述的三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，S2中所述

Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子的加入量与所述碳酸氢铵的去离子水溶液的用量比为（10~90）mg：（0.99~1.01）mL。

6.如权利要求5所述的三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，S2 中所述Fe₃O₄@SiO₂ 纳米粒子的加入量与所述碳酸氢铵的去离子水溶液的用量比10 mg：1mL。

7.如权利要求1~6中任意一项所述的三维立体褶皱聚乳酸微球的制备方法得到的三维立体褶皱聚乳酸微球，其特征在于，所述聚乳酸微球的平均直径为50 μm，表面褶皱，具有多级孔结构。

8.如权利要求7所述的三维立体褶皱聚乳酸微球作为油水分离的用途。

9.如权利要求7所述的三维立体褶皱聚乳酸微球作为粘附细胞的用途。