CN110404114B - 一种具有表面凹坑可降解高分子微球及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有表面凹坑可降解高分子微球及其制备方法与应用，制备方法包括以下步骤：将可降解高分子物质溶于有机溶剂得到可降解高分子溶液；加入含表面活性剂的水溶液中，对溶液上部开始进行磁力搅拌，然后加入磁性固体颗粒，再开始对溶液下部进行磁力搅拌，逐步形成微球；待微球固化后，停止搅拌，通过磁场将磁性固体颗粒及嵌入有磁性固体颗粒的微球分离出来；对处理后得到的未嵌入和未包覆有磁性颗粒的微球进行清洗后，干燥后即得。该方法工艺简单可行，原料易得，成本低廉，易于实现产业化生产；制备的微球不仅具有良好的生物相容性及可降解性，还具有适合细胞黏附的表面凹坑，可用于组织缺损的修复和重建。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种具有表面凹坑可降解高分子微球及其制备方法与应用。
背景技术
高分子微球通常指直径在纳米至微米尺度，形状为球形的高分子聚集体。高分子微球作为一种新型功能材料，在许多领域具有广阔的应用前景，近年来高分子微球在生物工程、医学、环境、食品和功能材料等多个领域均取得了较好的成果。目前，应用于微球的材料主要分为无机材料、天然高分子材料及合成的高分子材料。按降解性能又可分为可降解类材料及非可降解类材料。其中，人工合成的可降解高分子材料可以通过改变其原材料化学组成、材料结构及表面性质等，来设计其生物应答特性。聚酯类是目前研究最多、应用最广泛的可生物降解的合成高分子材料，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚ε-己内酯、聚β-羟基丁酸、聚β-羟基戊酸及其共聚物。
与普通微球相比，具有特定形貌的可降解高分子微球具有更大的表面积，而对于组织的修复，除了必须对组织、细胞无毒，且要有适当的表面结构可供细胞的黏附、长入；进一步地，具有诱导组织生长、修复的功能则更佳。体内细胞处于一个由微米、纳米结构组成的细胞外基质环境，细胞外基质能够影响和调节细胞的多项功能活动。对于体外基底上的细胞，影响细胞活性的一个重要因素是材料的表面形貌。基底表面形貌主要包括材料粗糙度以及纹理结构，目前表面形貌多指特征形貌。材料粗糙度对细胞的影响结果还存在争论，但其对细胞增殖、分化的确有显著影响。目前，多数研究认为粗糙度的增加有利于细胞分化和基质合成，同时，伴随着细胞增殖活力的减弱，许多研究涉及基底表面各种特征形貌对细胞行为的影响。通常来说，细胞会沿着凹槽方向伸长、排列，这是著名的接触引导现象。对于微米级形貌，其不仅影响细胞的取向、迁移等行为，甚至能影响细胞的基因表达和信号通路。虽然目前关于基底表面形貌与细胞相互作用关系的研究十分丰富，但是所采用的基底较为单一，绝大多数为片材、膜材。受加工水平限制，在三维基底表面(如球形或不规则多孔结构体)还难以生成可控、规则的纹理特征。由于三维基底更能满足实际组织修复需要，因此，有必要探索三维基底形貌与细胞的相互作用。
近来，相关研究表明表面具有凹坑的高分子微球具有适当的表面结构可供细胞的黏附、长入且具有诱导组织生长、修复的功能，在组织修复领域中具有良好的应用前景。中国专利申请文件CN109897202A公开了大粒径琼脂糖微球及其制备方法；中国专利申请文件CN109821513A公开了一种靶向过滤癌细胞的细胞印迹聚合物微球及其制备方法；中国专利申请文件CN109837774A公开了一种多孔纤维素微球改性的染色的棉混纺织物的一步染色方法。曾俊等[1]报道了通过Pickering乳液聚合合成了表面凹坑结构的单分散多孔微球；李斌等[2]报道了一种表面具有小凹坑的凝沉型淀粉微球；慈颖等[3]报道了具有表面凹坑的明胶基微球。但上述现有技术制得的微球普遍存在以下问题：1)组分多，应用时性能演变难以被预测；2)制备得到多孔微球而非表面凹坑微球，微球内部结构的改变对其降解速率造成难以预测的影响；3)制备工艺复杂、难以产业化的问题。
参考文献：
[1]曾俊.乳液模板法构建多孔材料吸附LC和Cu(Ⅱ)的行为及机理研究，江苏科技大学，2016.硕士学位论文.
[2]冼学权，黎演明，杨辉，潘丽霞，李秉正.壳聚糖多孔微球的制备与表征,河南工业大学学报(自然科学版)，2017.3.25-30,37.
[3]慈颖，葛军，王小峰，陈文浩，郭燕川，陈丽娟.明胶基多孔碳球电极材料的制备及电化学性能研究，功能材料，2017.23.365-368.
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种可用于组织修复且具有表面凹坑的可降解高分子微球的制备方法。
本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种上述方法制得的具有表面凹坑可降解高分子微球。
本发明所要解决的第三个技术问题是：提供一种上述具有表面凹坑可降解高分子微球的应用。
为了解决上述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种具有表面凹坑可降解高分子微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、将可降解高分子物质溶于有机溶剂得到可降解高分子溶液；
S2、将所述可降解高分子溶液加入含表面活性剂的水溶液中，对溶液上部开始进行磁力搅拌，然后加入磁性固体颗粒，再开始对溶液下部进行磁力搅拌，逐步形成微球；
S3、待微球固化后，停止搅拌，通过磁场将磁性固体颗粒及嵌入有磁性固体颗粒的微球分离出来；
S4、对步骤S3处理后得到的未嵌入和未包覆有磁性颗粒的微球进行清洗后，干燥后得到具有表面凹坑可降解高分子微球。
进一步地，所述磁性固体颗粒包括二氧化三铁或四氧化三铁中的至少一种。
进一步地，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中的至少一种。
进一步地，所述可降解高分子物质包括聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚3-羟基烷酸酯、聚(3-羟基丁酸酯)、聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯、聚三亚甲基碳酸酯或聚丁二酸丁二酯中的至少一种。
进一步地，所述可降解高分子与有机溶剂的质量体积比为((0.05～0.5)：1)g/ml。
进一步地，所述步骤S2中，所述表面活性剂包括明胶、甲基纤维素或聚乙烯醇中的至少一种；优选地，所述含表面活性剂水溶液中表面活性剂的质量浓度为(0.5～1.5)％。
进一步地，对溶液上部进行磁力搅拌时，转速为(200～1000)rpm，开始对溶液上部进行磁力搅拌与加入磁性固体颗粒操作的时间间隔为(30～120)min。
进一步地，磁性固体颗粒与可降解高分子溶液的质量体积比为((0.05～0.3)：1)g/ml。
进一步地，对溶液下部进行磁力搅拌时，转速为(200～1000)rpm，微球固化的时间为(6～10)h。
优选地，对溶液下部进行磁力搅拌的转速不小于对溶液上部进行磁力搅拌的转速。
进一步地，所述步骤S4中，所述干燥操作的方式为冷冻干燥，干燥时间为(24～48)h。
本发明的有益效果在于：本发明使用磁性固体颗粒来制造微球的表面凹坑，微球固化成型后通过外在磁场分离磁性固体颗粒和嵌入磁性固体颗粒的微球，使制造微球表面凹坑的媒介不至于残留于微球。本发明使用磁力搅拌器便可控制磁性固体颗粒的运动，同时可选择与溶液下部和下部相同或相反的运转方向，可灵活地控制微球与磁性固体颗粒之间的碰撞；该制备方法工艺简单，对设备的要求不高，原料均已产业化、来源易得，成本低廉，易于实现产业化。
为了解决上述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种通过上述方法制得的具有表面凹坑可降解高分子微球。
为了解决上述第三个技术问题，本发明采用的技术方案为：上述具有表面凹坑可降解高分子微球在制备组织修复或组织填充材料中的应用。
本发明的有益效果在于：提供一种可用于组织修复的具有表面凹坑可降解高分子微球，根据实际应用领域，在高分子微球固化成型过程中加入磁性固体颗粒，通过外在磁场的作用下使高分子微球和磁性固体颗粒发生碰撞，从而制得具有表面凹坑的高分子可降解微球，制备的微球不仅具有良好的生物相容性及可降解性，还具有适合细胞黏附的表面凹坑，在组织缺损的修复和重建领域中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1～7及对比例1制得的微球在体外成骨诱导时碱性磷酸酶活性对比图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明的实施例一为：一种具有表面凹坑的可降解高分子微球的制备方法，包括以下步骤：称取1.5g聚己内酯溶于10ml易挥发性有机溶剂(三氯甲烷)中；将该聚己内酯溶液加入到500ml浓度为1.2％的(1788型-聚乙烯醇)的水溶液中，室温下使用置顶式搅拌器进行搅拌，转速为600rpm；60min后加入1.5g四氧化三铁颗粒，启动置底式磁力搅拌器，转速为1000rpm；其中，置顶式搅拌器与置底式磁力搅拌器的转动方向相反。8h后，停止搅拌，使用磁铁分离出磁性固体颗粒及嵌入磁性固体颗粒的微球；对剩下的微球进行水洗并离心(1500rpm，10min)后冷冻干燥(36h)后得到具有表面凹坑聚己内酯微球。
本发明的实施例二为：一种具有表面凹坑的可降解高分子微球的制备方法，包括以下步骤：称取5.0g聚三亚甲基碳酸酯溶于10ml乙酸乙酯中；将该聚三亚甲基碳酸酯溶液加入到500ml浓度为1.2％的(124型-聚乙烯醇)的水溶液中，室温下使用置顶式搅拌器进行搅拌，转速为1000rpm；100min后加入3.0g三氧化二铁颗粒，启动置底式磁力搅拌器，转速为600rpm；其中，置顶式搅拌器与置底式磁力搅拌器的转动方向相同。9h后，停止搅拌，使用磁铁分离出磁性固体颗粒及嵌入磁性固体颗粒的微球；对剩下的微球进行水洗并离心(2000rpm，8min)后冷冻干燥(24h)得到具有表面凹坑聚三亚甲基碳酸酯微球。
本发明的实施例三为：一种具有表面凹坑的可降解高分子微球的制备方法，包括以下步骤：称取1.0g乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml二氯甲烷中；将该乳酸-羟基乙酸共聚物溶液加入到500ml浓度为1.0％的明胶水溶液中，室温下使用置顶式搅拌器进行搅拌，转速为300rpm；45min后加入0.5g四氧化三铁颗粒，启动置底式磁力搅拌器，转速为200rpm；其中，置顶式搅拌器与置底式磁力搅拌器的转动方向相反。10h后，停止搅拌，使用磁铁分离出磁性固体颗粒及嵌入磁性固体颗粒的微球；对剩下的微球进行水洗并离心(1500rpm，10min)后冷冻干燥(36h)得到具有表面凹坑乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
本发明的实施例四为：一种具有表面凹坑的可降解高分子微球的制备方法，包括以下步骤：称取3.0g聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯溶于10ml四氢呋喃中；将该聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯溶液加入到500ml浓度为1.0％的1799型聚乙烯醇水溶液中，室温下使用置顶式搅拌器进行搅拌，转速为500rpm；120min后加入1.0g三氧化二铁颗粒，启动置底式磁力搅拌器，转速为400rpm；其中，置顶式搅拌器与置底式磁力搅拌器的转动方向相反。6h后，停止搅拌，使用磁铁分离出磁性固体颗粒及嵌入磁性固体颗粒的微球；对剩下的微球进行水洗并离心(1500rpm，10min)后冷冻干燥(48h)得到具有表面凹坑聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯微球。
本发明的实施例五为：一种具有表面凹坑的可降解高分子微球的制备方法，包括以下步骤：称取0.5g聚丁二酸丁二酯溶于10ml二氯甲烷中；将该聚丁二酸丁二酯溶液加入到500ml浓度为0.5％的甲基纤维素的水溶液中，室温下使用置顶式搅拌器进行搅拌，转速为200rpm；30min后加入0.5g四氧化三铁颗粒，启动置底式磁力搅拌器，转速为200rpm；其中，置顶式搅拌器与置底式磁力搅拌器的转动方向相同。7h后，停止搅拌，使用磁铁分离出磁性固体颗粒及嵌入磁性固体颗粒的微球；对剩下的微球进行水洗并离心(1000rpm，10min)后冷冻干燥(24h)得到具有表面凹坑聚丁二酸丁二酯微球。
本发明的实施例六为：一种具有表面凹坑的可降解高分子微球的制备方法，包括以下步骤：称取1.0g乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml二氯甲烷中；将该乳酸-羟基乙酸共聚物溶液加入到500ml浓度为1.0％的明胶水溶液中，室温下使用置顶式搅拌器进行搅拌，转速为300rpm；45min后加入0.5g四氧化三铁颗粒，启动置底式磁力搅拌器，转速为200rpm；其中，置顶式搅拌器与置底式磁力搅拌器的转动方向相同。10h后，停止搅拌，使用磁铁分离出磁性固体颗粒及嵌入磁性固体颗粒的微球；对剩下的微球进行水洗并离心(1500rpm，10min)后冷冻干燥(36h)得到具有表面凹坑乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
本发明的实施例七为：一种具有表面凹坑的可降解高分子微球的制备方法，包括以下步骤：称取1.0g乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml二氯甲烷中；将该乳酸-羟基乙酸共聚物溶液加入到500ml浓度为1.0％的明胶水溶液中，室温下使用置顶式搅拌器进行搅拌，转速为300rpm；45min后加入0.5g四氧化三铁颗粒，启动置底式磁力搅拌器，转速为400rpm；其中，置顶式搅拌器与置底式磁力搅拌器的转动方向相反。10h后，停止搅拌，使用磁铁分离出磁性固体颗粒及嵌入磁性固体颗粒的微球；对剩下的微球进行水洗并离心(1500rpm，10min)和冷冻干燥(36h)后得到具有表面凹坑乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
本发明的对比例一为：一种可降解高分子微球的制备方法，包括以下步骤：称取1.0g乳酸-羟基乙酸共聚物溶于10ml二氯甲烷中；将该乳酸-羟基乙酸共聚物溶液加入到500ml浓度为1.0％的明胶水溶液中，室温下使用置顶式搅拌器进行搅拌，转速为300rpm。10h后，停止搅拌，对微球进行水洗并离心(1500rpm，10min)后冷冻干燥(36h)得到乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
取上述实施例1～7及对比例1制得的微球进行性能测试
1.体外细胞毒性评价
取制得的微球，按GB/T 16886.5的要求进行评价和计分。实验结果如下表1所示：
表1实施例及对比例所制得微球的体外细胞毒性计分表
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | 对比例1 | |
| 计分 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
2.体外干细胞成骨诱导分化性能检测
取24孔板每个孔的底部铺上250μl的1％无菌的琼脂糖，在其完全凝固前加入微球，使微球固定于孔板。然后将微球浸渍于70％的乙醇溶液2h，随后吸去乙醇，用PBS洗涤5遍，在紫外灯下照射20min。随后，每个孔加入500μl的培养液，将孔板放入培养箱中24h。将孔板中的培养液以及微球表面的培养液吸出，把50μl的细胞(小鼠骨髓间充质干细胞)悬液(2*108细胞数/ml)均匀地滴加在微球上。滴加完毕后，将孔板放入培养箱3h，待大部分细胞黏附于微球上以后，在每个孔中添加额外的750μl培养液。种植细胞的支架材料继续在温度为37℃且5％二氧化碳气氛下的培养箱中培养。利用磷酸对硝基苯酯(ρ-nitrophenylphosphate，pNPP)法进行测定，具体步骤如下：种植有细胞的微球用PBS溶液洗涤后，浸没于含有0.1M甘氨酸、1mM氯化镁以及0.05％曲拉通X-100的PBS溶液(该溶液可以将微球上的细胞溶解)。待细胞溶解后，将溶解液与对硝基苯磷酸二钠盐均匀混合，将混合液置于37℃下30min。随后，将混合液滴加到96孔板，用酶标仪测定405nm波长下各孔的吸光值。根据吸光度值计算出每个支架上细胞中实际的碱性磷酸酶含量(活性)，如图1所示。
由实施例及对比例的体外细胞毒性评价结果(表1)可知，本发明方法所制备的微球均无细胞毒性。由体外干细胞成骨诱导分化性能检测结果(即图1)可知，与对比例1相比，本发明方法制得的微球分泌的碱性磷酸酶显著多于对比例1方案，由此表明，具有表面凹坑结构对干细胞的分化有更佳的促进作用。对比实施例3与实施例6和7的结果，采用相反转向且置顶式搅拌器的搅拌速度大于置底式搅拌器的转速制得的表面凹坑的微球上的干细胞的成骨分化趋势更为明显，由于磁性颗粒密度大，而可降解高分子乳液滴及微球的密度小，如若不使用底部的磁力搅拌器或底部磁力搅拌器的速度更大，则使得磁性颗粒直接或更多的掺入到反应装置底部，几乎或大量不参与微球表面坑洞的形成，导致坑洞较小，效果与对比例1基本相同。
本发明巧妙地利用磁性颗粒及磁场，在可降解微球表面产生坑洞；所利用磁性颗粒及磁场，仅在可降解微球表面产生坑洞，而不影响微球的内部构造。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种具有表面凹坑可降解高分子微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将可降解高分子物质溶于有机溶剂得到可降解高分子溶液；
S2、将所述可降解高分子溶液加入含表面活性剂的水溶液中，对溶液上部开始进行磁力搅拌，然后加入磁性固体颗粒，再开始对溶液下部进行磁力搅拌，逐步形成微球；
S3、待微球固化后，停止搅拌，通过磁场将磁性固体颗粒及嵌入有磁性固体颗粒的微球分离出来；
S4、对步骤S3处理后得到的未嵌入和未包覆有磁性颗粒的微球进行清洗后，干燥后得到具有表面凹坑可降解高分子微球。
2.根据权利要求1所述的具有表面凹坑可降解高分子微球的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的具有表面凹坑可降解高分子微球的制备方法，其特征在于：所述可降解高分子与有机溶剂的质量体积比为((0.05～0.5)：1)g/ml。
4.根据权利要求1所述的具有表面凹坑可降解高分子微球的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述表面活性剂包括明胶、甲基纤维素或聚乙烯醇中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的具有表面凹坑可降解高分子微球的制备方法，其特征在于：所述含表面活性剂的 水溶液中表面活性剂的质量浓度为(0.5～1.5)％。
6.根据权利要求1所述的具有表面凹坑可降解高分子微球的制备方法，其特征在于：对溶液上部进行磁力搅拌时，转速为(200～1000)rpm，开始对溶液上部进行磁力搅拌与加入磁性固体颗粒操作的时间间隔为(30～120)min。
7.根据权利要求1所述的具有表面凹坑可降解高分子微球的制备方法，其特征在于：磁性固体颗粒与可降解高分子溶液的质量体积比为((0.05～0.3)：1)g/ml。
8.根据权利要求1所述的具有表面凹坑可降解高分子微球的制备方法，其特征在于：对溶液下部进行磁力搅拌时，转速为(200～1000)rpm，微球固化的时间为(6～10)h。
9.一种通过如权利要求1～8任一项所述的方法制得的具有表面凹坑可降解高分子微球。
10.一种如权利要求9所述的具有表面凹坑可降解高分子微球在制备组织修复或组织填充材料中的应用。
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| "Fabrication of covered porous PLGAmicrospheres using hydrogen peroxide for controlled drug delivery and regenerative medicine";Soon Eon Bae等;《Journal of Controlled Release》;20080919;第133卷;第37-43页 * |
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