CN105263855A - 使用聚合物点进行Western印迹分析 - Google Patents

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Abstract

提供了使用与生物分子偶联的发色聚合物点来分析目标分子的方法、系统、组合物和试剂盒。与现有技术相比，使用发色聚合物点改善了的检测灵敏度和稳定性。在一些方面中，提供了在Western印迹分析中使用与生物分子偶联的发色聚合物点来检测目标蛋白质的方法、系统和试剂盒。还提供了相关方法、系统、组合物和试剂盒。

Description

使用聚合物点进行Western印迹分析
交叉参考
本申请要求2013年3月5日提交的美国临时申请号61/773,044的权益，该申请通过引用全文纳入本文用于所有目的。
有关联邦资助的研究的声明
本发明在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)的合同号GM085485和国家科学基金会(NationalScienceFoundation)的合同号CHE-0924320下由美国政府支持完成。
背景
Western印迹是一种广泛使用的用于蛋白质分析的实验室技术。在该技术中，蛋白质通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并随后转移至疏水性膜上；随后使用多种标记方法使这些蛋白质可见。
传统的化学发光成像方法基于使用辣根过氧化物酶标记蛋白质。最近荧光检测受到欢迎，因为其灵敏度高且具有多重功能。然而，用于Western印迹的荧光染料往往经历快速光漂白，其降低了重复印迹成像的灵敏度。量子点(Qdots)是一种替代性荧光观察来源，可用于Western印迹分析的应用中。然而，使用量子点的技术需要相对复杂的设置和分析，无法在大多数生物化学实验室中容易地使用。
因此，需要改进的技术来显示蛋白质和肽作为Western印迹分析的一部分。
发明内容
在一些实施方式中，本发明提供了使用聚合物点(或“Pdot”)进行分析的方法和系统。在某些方面中，本发明提供了用于检测蛋白质的聚合物点的组合物，包括但不限于Western印迹分析。本发明还提供了可包含聚合物点的试剂盒，且在一些实施方式中，提供了适用于使用聚合物点进行Western印迹分析的封闭剂。该封闭剂可用于例如在将聚合物点应用于Western印迹分析时改变非特异性吸附/相互作用。本发明还提供了使用Pdot分析蛋白质或肽样品的系统。
在多个方面中，本发明提供了进行Western印迹分析的方法，该方法包括：使用凝胶分离蛋白质；将分离的蛋白质转移至膜上；使含有分离的蛋白质的膜接触包含聚合物点的溶液，该聚合物点与特异性针对至少一些分离的蛋白质的生物分子偶联；以及检测来自聚合物点的至少一种信号，该至少一种信号对应于分离的蛋白质。
在多个方面中，本发明提供了检测蛋白质或肽的方法，该方法包括：从混合物中分离蛋白质或肽；使分离的蛋白质或肽接触包含聚合物点的溶液，该聚合物点与特异性针对至少一些分离的蛋白质或肽的生物分子偶联；以及检测来自聚合物点的至少一种信号，该至少一种信号对应于分离的蛋白质或肽。
在多个方面中，本发明提供了包含用于Western印迹分析的偶联的聚合物点的组合物和包含该组合物的试剂盒。
在多个方面中，本发明提供了进行Western印迹分析的试剂盒，该试剂盒包含聚合物点、偶联生物分子和封闭剂。
在多个方面中，本发明提供了检测蛋白质或肽的系统，该系统包括：与生物分子偶联的聚合物点；蛋白质或肽分离平台；电磁辐射源；检测器；以及包含存储装置并储存可执行命令的计算机，这些命令在由处理器执行时导致处理器运行检测器获取图像、储存图像并分析图像。
在多个方面中，本发明提供了进行Western印迹分析的系统，该系统包括：与生物分子偶联的聚合物点；凝胶；电泳平台；电磁辐射源；检测器；以及包含存储装置并储存可执行命令的计算机，这些命令在由处理器执行时导致处理器运行检测器获取图像、储存图像并分析图像。
附图说明
所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实施方式和附图：
图1A显示0.1％聚乙二醇(PEG)20mMHEPES缓冲液中CN-PPVPdot和CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物(CNPPV-Strep)的吸收(虚线)和发射(实线)光谱以及CN-PPV聚合物的结构。
图1B显示来自英杰公司(Invitrogen)的Qdot605-链霉亲和素偶联物的吸收和发射光谱。
图1C显示CN-PPVPdot和CN-PPV-链霉亲和素Pdot的示例性TEM图像；比例尺代表长度50mm。
图1D显示CN-PPV和CN-PPV-链霉亲和素Pdot的示例性动态光散射测量。
图2A-2B显示与Qdot605-链霉亲和素(图2A)和CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物(图2B)孵育的抗小鼠IgG-生物素点印迹的图像。图2C和2D分别显示图2A和2B中所示相应点印迹的经标准化积分强度。
图3A和3B显示不存在相应一抗的情况下(图3A)转铁蛋白和(图3B)胰蛋白酶抑制剂点印迹的图像。CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物的浓度是1nM。在这些点印迹中没有检测到荧光，因此表明这些Pdot和蛋白质之间不存在明显的非特异性结合。
图3C-3F显示转铁蛋白(图3C和3E)和胰蛋白酶抑制剂(图3D和3F)的点印迹图像和相应的经标准化背景扣除积分强度。将点印迹与相应生物素化抗体和CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物孵育。
图4A和4B显示与相应生物素化抗体和CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物孵育的山羊抗小鼠IgG(图4A)和转铁蛋白(图4B)点印迹在孵育后第14天的经标准化背景扣除积分强度(样品在6℃下储存于TTBS缓冲液中)。
图5A-5D显示完整的Western印迹过程(SDS-PAGE分离，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封闭并与相应生物素化抗体和CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物孵育)后转铁蛋白(图5A和5C)和胰蛋白酶抑制剂(图5B和5D)的图像和相应的经标准化背景扣除积分强度。
发明详述
本发明提供了使用聚合物点进行分析的方法、组合物、试剂盒和系统。在多个方面中，本发明提供了进行蛋白质的Western印迹分析的方法、组合物和试剂盒。
在本发明的一些方面中，提供了方法、系统、组合物和试剂盒以使用与生物分子偶联的发色聚合物点检测和分析目标分子。与现有技术相比，使用聚合物点提供了改进的检测灵敏度和稳定性。
本文所用术语“烷基”指直链或支链的饱和的脂族基团，其具有指定数量的碳原子。例如，C1-C6烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基基团包括但不限于：庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可包括任何数目的碳，如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6。该烷基基团通常是单价的，但可以是二价的，例如当烷基基团将两个部分连接到一起时。本文所用术语“杂烷基”指直链或支链的饱和的碳原子脂族基团，其中至少一个碳原子被杂原子(如N、O或S)替换。其他杂原子也可以是有用的，包括但不限于B、Al、Si和P。
术语“低级”在上文和后文中与有机基团或化合物联用，分别限定特定化合物或基团，其可以是支链或非支链的且具有大于等于7个碳原子，优选大于等于4个碳原子和(在非支链时)1或2个碳原子。
本文所用术语“亚烷基”指与至少两个基团相连的上文所定义的烷基，即二价烃基基团。与亚烷基相连的两个部分可以与亚烷基的相同或不同原子连接。例如，直链亚烷基可以是-(CH2)n-的二价基团，其中n是1、2、3、4、5或6。亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基和亚己基。
本发明所述基团可以是取代或未取代的。烷基和杂烷基基团(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是多种各种基团，例如烷基、芳基、氰基(CN)、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸、羟基或卤化物。取代基可以是反应性基团，例如但不限于氯、溴、碘、羟基或氨基。合适的取代基可选自-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NH-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-CN和-NO2，取代基数量为0至(2m'+1)，其中m'为该取代基中碳原子的总数。R'、R"和R″′各自独立地指氢、未取代的(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基、烷氧基或硫代烷氧基，或者芳基-(C1-C4)烷基。当R'和R"连接于同一个氮原子时，它们可与该氮原子一起形成5、6或7元环。例如，-NR'R"包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述有关取代基的讨论中，本领域技术人员应理解，术语“烷基”包括诸如卤代烷基(如-CF3和-CH2CF3)和酰基(如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)等基团。
本文所用术语“烷氧基”指具有氧原子的烷基基团，所述氧原子将烷氧基连接至连接点或连接至烷氧基的两个碳。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基还可被本文所述多种取代基取代。例如，这些烷氧基可被卤素取代以形成“卤代烷氧基”。
本文所用术语“烯基”指直链或支链的2-6个碳原子的烃基，其具有至少一个双键。烯基的示例包括但不限于：乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。
本文所用术语“亚烯基”指连接至少两个其他基团的上文定义的烯基，即二价烃基。与亚烯基相连的两个部分可以与亚烯基的相同或不同原子连接。亚烯基包括但不限于：亚乙烯基、亚丙烯基、亚异丙烯基、亚丁烯基、亚异丁烯基、亚仲丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。
本文所用术语“炔基”指直链或支链的2-6个碳原子的烃基，其具有至少一个三键。炔基的示例包括但不限于：乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。
本文所用术语“亚炔基”指连接至少两个其他基团的上文定义的炔基，即二价烃基。与亚炔基相连的两个部分可以与亚炔基的相同或不同原子连接。亚炔基包括但不限于：亚乙炔基、亚丙炔基、亚异丙炔基、亚丁炔基、亚仲丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。
本文所用术语“烷基胺”指具有一个或多个氨基的本文所定义烷基。这些氨基可以是伯氨基、仲氨基或叔氨基。烷基胺还可被羟基取代。烷基胺可包括但不限于：乙胺、丙胺、异丙胺、乙二胺和乙醇胺。氨基可将烷基胺连接至化合物剩余部分连接点，其位于烷基的ω位，或将烷基的至少两个碳原子连接在一起。
本文所用术语“卤素”或“卤化物”指的是氟(化物)、氯(化物)、溴(化物)和碘(化物)。本文所用术语“卤代烷基”指如上文所定义的烷基，其中一些或全部氢原子被卤素原子取代。卤素(卤代)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。本文所用术语“卤代烷氧基”指具有至少一个卤素的烷氧基。卤代烷氧基定义为一些或全部氢原子被卤素原子取代的烷氧基。烷氧基可被1、2、3或更多个卤素取代。当所有氢都被一种卤素取代时，例如被氟取代时，该化合物是全取代的，例如全氟化的。卤代烷氧基包括但不限于三氟甲氧基、2,2,2,-三氟乙氧基、全氟乙氧基等。
本文所用术语“环烷基”指饱和的或部分不饱和的单环、稠合二环或桥接多环组成物，其包含3-12个环原子，或指示数量的原子。单环包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。二环和多环包括，例如，降莰烷、十氢化萘和金刚烷。例如，C3-8环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降莰烷。
本文所用术语“亚环烷基”指连接至少两个其他基团的上文定义的环烷基，即二价烃基。与亚环烷基相连的两个部分可以与亚环烷基的相同或不同原子连接。亚环烷基包括但不限于：亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基和亚环辛基。
本文所用术语“杂环烷基”指具有3个环原子至约20个环原子且1至约5个杂原子(如N、O和S)的环系统。也可使用其他杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子还可以是氧化的，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。
本文所用术语“亚杂环烷基”指与至少两个其他基团相连的上文定义的杂环烷基。与亚杂环烷基相连的两个部分可以与亚杂环烷基的相同或不同原子连接。
本文所用术语“芳基”指单环或稠合二环、三环或更大的，芳族环组成物，其包含6-16个环碳原子。例如，芳基可以是苯基、苄基、薁基或萘基。“亚芳基”指源自芳基基团的二价基团。芳基可以是被一个、两个或三个选自下组的基团单取代、二取代或三取代的：烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基-烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基和氧基-C2-C3-亚烷基；其均任选地被进一步取代，例如如上文定义的那样；或1-或2-萘基；或1-或2-菲基。亚烷基二氧基是与苯基的两个邻近碳原子连接的二价取代基，例如亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。氧基-C2-C3-亚烷基也是与苯基的两个邻近碳原子连接的二价取代基，例如，氧乙烯或氧丙烯。氧基-C2-C3-亚烷基-苯基的示例是2,3-二氢苯并呋喃-5-基。
芳基可包括但不限于：萘基，苯基或被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单取代或双取代的苯基，苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单取代或双取代的苯基，且特别是苯基。
本文所用术语“亚芳基”指与至少两个其他基团相连的上文定义的芳基。与亚芳基相连的两个部分与该亚芳基的不同原子相连。亚芳基包括但不限于亚苯基。
本文所用术语“烷氧基-芳基”或“芳氧基”指其中与芳基相邻的一个部分通过氧原子连接的上文定义的芳基。烷氧基-芳基包括但不限于苯氧基(C6H5O-)。本发明还包括烷氧基-杂芳基或杂芳氧基。
本文所用术语“杂芳基”指含有5至16个环原子的单环或稠合二环或三环芳族环组成物，其中1至4个环原子是杂原子(其各自是N、O或S)。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪吡基、噻吩基，或被例如烷基、硝基或卤素取代(特别是单取代或双取代)的任意其他基团。本发明的合适基团还可包括亚杂芳基和亚杂芳基-氧基，类似于上文关于亚芳基和亚芳基-氧基的描述。
类似地，本文所述芳基和杂芳基可以是取代的或未取代的。芳基和杂芳基的取代基是不同的，例如烷基、芳基、CN、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸、羟基或卤化物。取代基可以是反应性基团，例如但不限于氯、溴、碘、羟基或氨基。取代基可以选自：-卤素、-OR'、-OC(O)R'、-NR'R"、-SR'、-R'、-CN、-NO2、-CO2R'、-CONR'R"、-C(O)R'、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR"C(O)2R'、-NR'-C(O)NR"R″′、-NH-C(NH2)＝NH、-NR'C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-N3、-CH(Ph)2、数量为0至芳环系统上开放价态的总数；其中R'、R"和R″′独立地选自：氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。
本文所用术语“烷基-芳基”指具有烷基组分和芳基组分的基团，其中烷基组分将芳基组分连接至连接点。烷基组分如上文所定义，不同之处在于烷基组分是至少二价的从而连接芳基组分和连接点。在一些情况下，烷基组分可缺失。芳基组分如上文所定义。烷基-芳基的示例包括但不限于苄基。本发明还包括烷基-杂芳基。
本文所用术语“烯基-芳基”指具有烯基组分和芳基组分的基团，其中烯基组分将芳基组分连接至连接点。烯基组分如上文所定义，不同之处在于烯基组分是至少二价的，从而连接芳基组分和连接点。芳基组分如上文所定义。烯基-芳基的示例包括乙烯基-苯基等。本发明还包括烯基-杂芳基。
本文所用术语“炔基-芳基”指具有炔基组分和芳基组分的基团，其中炔基组分将芳基组分连接至连接点。炔基组分如上文所定义，不同之处在于炔基组分是至少二价的，从而连接芳基组分和连接点。芳基组分如上文所定义。炔基-芳基的示例包括乙炔基-苯基等。本发明还包括炔基-杂芳基。
发色聚合物点
本发明提供了包含用于分析蛋白质和肽的发色聚合物点(Pdot)的方法、系统、组合物和试剂盒。Pdot具有使其特别适用于检测蛋白质或其他生物分子的优良光学性质。
聚合物点(Pdot)具有用作检测剂的多种优势。Pdot是荧光、基于聚合物的颗粒，其可采用多种构型，包括但不限于具有均一、同质性组合物的整体聚合物点或具有不同芯和帽结构的聚合物点。Pdot可由单一聚合物制成或可包含聚合物的掺混物。
本文中，术语“聚合物点”、“发色聚合物点”、“荧光聚合物点”、“发色纳米颗粒”和“Pdot”可互换使用以表示包含一种或多种聚合物(如半导体聚合物)的结构，所述聚合物已塌缩为稳定的亚微米尺寸颗粒。术语“发色聚合物”指其中至少一部分聚合物包含发色单元的聚合物，所述发色单元吸收某些波长的光(范围为UV至近红外光谱)。本发明所述的发色聚合物可以是或不是发光的。
本发明所述聚合物点可包含任何合适的聚合物次单元，其可促进蛋白质或肽(且特别是蛋白质)的检测。
本文所用术语“聚合物”指由至少两个重复结构单元组成的分子，通常通过共价化学键连接。重复结构单元可以是一种类型的单体，且所得聚合物是均聚物。在一些方面中，这些聚合物包含两种不同类型的单体，或三种不同类型的单体，或更多类型的单体。本领域普通技术人员应理解，不同类型的单体可以多种方式沿聚合物链分布。例如，三种不同类型的单体可沿聚合物随机分布。类似地，应理解，单体沿聚合物的分布可以不同方式呈现。
本发明提供了半导体、非半导体或其组合的Pdot。任何聚合物组合物均可用于本发明，前提是其适用于检测蛋白质和肽，例如在Western印迹分析过程中。
本发明提供了具有所需表面化学和光学性质的Pdot，使其特别适用于根据本发明的方法检测蛋白质。可在生产Pdot的过程中调节Pdot群体的光学性质和官能化程度。具体而言，可根据需要调节Pdot的属性以调控多种光物理性质(如吸光度、发射光亮度和/或发射光颜色)。在某些方面中，这些聚合物点提供预料之外的亮度和/或光稳定性，应注意，在一些情况下，由于颗粒形成，荧光淬灭不增加。此外，聚合物点表面上少量离散官能团可降低Pdot对生物相关分子和/或细胞的非特异性吸附。应理解，具有高亮度和特异性结合能力的聚合物点向用于研究化学和生物系统的成像和检测技术的其他领域提供重要的方面。
本发明使用的发色聚合物可通过塌缩聚合物领域的任何已知方法形成，包括但不限于，依赖沉淀的方法、依赖乳液(如细乳液(miniemulsion)或微乳液(microemulsion))形成的方法和依赖缩聚的方法。
在一些方面中，Pdot可通过沉淀形成。该技术包括将稀释发色聚合物溶液(例如溶解于有机溶剂中的发色聚合物)快速添加(例如通过超声或剧烈搅拌促进)至过量的非溶剂(但可与有机溶剂互溶，例如水或其他生理上相关的水溶液)中。例如，在一些本文所述方法中，该发色聚合物可首先溶解在溶解性良好的有机溶剂(良好的溶剂，如THF(四氢呋喃))中，之后将THF中溶解的聚合物添加至过量的水或缓冲溶液(其对于疏水性发色聚合物而言是较差的溶剂但可与良好的溶剂(THF)互溶)中。对所得混合物进行超声或剧烈搅拌以帮助形成发色聚合物点，随后除去有机溶剂以留下充分分散的发色纳米颗粒。在使用该方法的过程中，该发色聚合物应足够疏水以溶解在有机溶剂(如THF)中。在用于偶联至生物分子的侧链上导入高密度的亲水性官能团或导入高密度的亲水性侧链将使所得聚合物在有机溶剂(如THF)中不溶或溶解性差(其方式类似于或等同于聚电解质的行为)。在一些方面中，提供了使用通过其他方法形成的Pdot的方法、系统、组合物和试剂盒，包括但不限于基于乳液(如细乳液或微乳液)或沉淀或缩聚的多种方法。还可使用具有疏水性官能团的其他聚合物，其中疏水性官能团不影响发色聚合物点的塌缩和稳定性。随后可将纳米颗粒表面上的疏水性官能团转化为亲水性官能团(如通过后官能化)用于生物偶联或将疏水性官能团直接连接至生物分子。后一种方法可使用疏水性和可点击(即落入点击化学领域的化学反应)的官能团特别良好地进行，包括但不限于炔、链炔、叠氮化物、二烯、烯、环辛炔和膦基团。
在一些方面中，提供了使用官能化Pdot的方法、系统、组合物和试剂盒，所述官能化Pdot可经修饰以形成单分子聚合物点(其可以是单价、二价或多价的)。该修饰是为了从点中除去一些聚合物分子，但仅留下可仅具有一个官能团、两个或更多个官能团的一个分子。在一个实施方式中，经工程改造的表面可用于促进修饰。工程改造的表面可具有某些官能团，例如醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，其取代的衍生物及其组合。通常，可以使用适用于生物偶联的任何其他官能团。本领域普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物偶联技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团。该表面可以是任何颗粒的弯曲的表面或平坦的表面(如盖玻片)。这类表面可以是二氧化硅、金属、半导体、硅和其他聚合物表面。上文所述官能化多分子发色性聚合物点经由任何稳定的物理或化学结合仅通过一个发色聚合物分子连接至表面。该发色聚合物点中的所有游离分子(与表面结合的分子除外)均可移除，例如通过用有机溶剂清洗表面，从而仅保留与表面结合的分子。随后可通过任何物理或化学方法从表面上释放单分子发色点。所得单分子点可以是单价的、二价的或多价的，这取决于初始聚合物分子中官能团的数目。
多种半导体聚合物适用于本发明所述的应用。已使用范围为UV至红外(包括整个可见光谱)的发射波长来开发半导体聚合物。在多个方面中，提供了使用半导体聚合物的方法、系统、组合物和试剂盒，包括但不限于：聚芴聚合物，包括但不限于，聚(9,9-二己基芴基-2,7-二基)(PDHF)和聚(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)(PFO)；基于芴的共聚物，包括但不限于，聚[{9,9-二辛基-2,7-二亚乙烯基-亚芴基}-交替-共-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-l,4-亚苯基}](PFPV)、聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-共-(l,4-苯并-{2,l,3}-噻二唑)](PFBT)、聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-共-(4,7-二-2-噻吩基-2,1,3-苯并噻二唑)](PFTBT)，和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-共-(4,7-二-2-噻吩基-2,l,3-苯并噻二唑)](PF-0.1TBT)；亚苯基亚乙烯基聚合物，包括但不限于，聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基亚乙烯基](MEH-PPV)和聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)](CN-PPV)；亚苯基亚乙炔基聚合物，包括但不限于，聚(2,5-二(3’,7’-二甲基辛基)亚苯基-1,4-亚乙炔基(PPE)。在一些方面中，可以使用的Pdot含有基于聚苯乙烯的梳状聚合物。基于聚苯乙烯的梳状聚合物的非限制性示例包括：聚苯乙烯接枝丙烯酸、聚苯乙烯接枝环氧乙烷、聚苯乙烯接枝丁醇等。
在一些实施方式中，可以使用的Pdot含有基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物。基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物的非限制性示例包括聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝丙烯酸、聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝环氧乙烷等。
在一些方面中，可以使用的Pdot含有包含羧基、氨基、巯基、酯、琥珀酰酯、叠氮化物、炔、环辛炔或膦基团的梳状聚合物。
在一些方面中，可以使用的Pdot含有在末端单体单元上官能化的聚合物，例如使用羧基、氨基、巯基、酯、琥珀酰酯、叠氮化物、炔、环辛炔、膦或类似官能团。可以使用的聚合物的示例包括但不限于：聚(甲基)丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、聚异丁烯、聚二烯、聚亚苯基、聚乙烯、聚乙二醇、聚丙交酯、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚氨酯，其嵌段共聚物，其随机或交替共聚物，等。
在一些方面中，可以使用的Pdot含有具有一个或多个官能化单体单元的共聚物，例如两亲聚合物，包括但不限于：基于聚((甲基)丙烯酸)-的共聚物，如：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)；基于聚二烯的共聚物，如：聚(丁二烯(1,2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)；基于聚(环氧乙烷)的共聚物，如：聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)；基于聚异丁烯的共聚物，如聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)；基于聚苯乙烯的共聚物，如：聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)；基于聚硅氧烷的共聚物，如：聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)；基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的共聚物，如：聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)；基于聚(2-乙烯基萘)的共聚物，如：聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、基于聚(乙烯基吡啶和碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的共聚物，如：聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)PEO端功能性OH；以及基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的共聚物，如：聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)；等。
在本发明的一些方面中，用于检测的Pdot可包含聚合物CN-PPV，其是一种亮、紧密且发橙色光的半导体聚合物点，也称作聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)]。CN-PPV具有优良的荧光性质，例如大吸收截面、高量子产率和快发射速率。
在一些方面中，用于检测蛋白质和肽的Pdot可包含基本由CN-PPV组成的聚合物。在一些方面中，该纳米颗粒包含CN-PPV和至少一种其他材料。例如，CN-PPV可与提供其他功能的共聚物或其他材料混合。
在一些方面中，用于检测蛋白质和肽的聚合物点可包含具有至少两个不同发色单元的半导体共聚物。例如，偶联的共聚物可含有以给定比例存在的芴和苯并噻唑发色单元。用于合成半导体共聚物的典型发色单元包括但不限于：芴单元、亚苯基亚乙烯基单元、亚苯基单元、亚苯基亚乙炔基单元、苯并噻唑单元、噻吩单元、咔唑芴单元、硼-二吡咯亚甲基单元，及其衍生物。不同的发色单元可以是隔离的(如同在嵌段共聚物中那样)或掺杂的。本文中，通过书写主要发色物质的种类来表示发色共聚物。例如，PFBT是含有特定比例的芴和苯并噻唑单元的发色聚合物。在一些情况下，连接号用于表示次要发色物质的百分比，之后是次要发色物质的种类。例如，PF-0.1BT是含有90％PF和10％BT的发色共聚物。
在某些方面中，这些聚合物点可包含半导体聚合物的掺混物。这些掺混物可包含均聚物、共聚物和寡聚物的任意组合。可选择用于形成聚合物点的聚合物掺混物以调节所得聚合物点的性质，例如，实现聚合物点的所需激发或发射光谱。
对于一些试验，半导体Pdot提供改进的检测灵敏度，部分因为其显示高于其他荧光报道物的量子产率。在一些方面中，所用Pdot的量子产率是超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％或超过90％。
对于一些试验，半导体Pdot提供改进的检测灵敏度，部分因为其显示比其他荧光报道物更快的发射速率。在某些方面中，所用Pdot的发射速率为约0.1纳秒至约50纳秒。
在一些方面中，所用发色聚合物点包含携带以下单元的聚合物：小有机染料分子、金属复合物、光发色染料(photochotochromicdye)及其任意组合，例如，无光学活性聚合物，如与小有机染料、金属复合物、光发色染料及其任意组合共价连接或接枝的聚苯乙烯。这些染料或金属复合物可具有蛋白质传感能力。
在一些方面中，提供了使用Pdot的方法、系统、组合物和试剂盒，所述Pdot包括与作为发射单元的小有机染料分子、金属复合物、光致变色染料及其任意组合共价连接的半导体聚合物。这类发射单元可调节发射颜色、提高量子产率并改善发色聚合物点的光稳定性。
在一些方面中，这些小有机染料或金属复合物可具有传感功能，并因此向发色聚合物点赋予额外的功能，例如蛋白质传感能力。
在一些方面中，该Pdot可包含一种半导体聚合物，其与其他发色聚合物(如与小有机染料、金属复合物、光致变色染料及其任意组合共价连接或接枝的无光学活性聚合物)物理混合或化学交联，从而具有额外的功能(如蛋白质传感)。
在一些方面中，该Pdot可包含半导体聚合物，其与其他组分(如荧光染料、无机发光材料、磁性材料、金属材料等)物理混合或化学交联，从而调节发射颜色、改进量子产率和/或光稳定性，和/或提供额外的功能(如磁性功能、等离振子共振功能等)。
本发明提供的纳米颗粒的大小以“临界尺寸”定义，其表示纳米颗粒的最小尺寸。许多纳米颗粒的形状大致为球形，这导致临界尺寸是球形颗粒的半径或直径。虽然典型的纳米颗粒(如纳米球和纳米管)在尺寸上是完全纳米的，但并非纳米颗粒的所有尺寸都需要是纳米级。例如，纳米圆柱体可具有纳米级的直径但具有微米级的长度。
在一些方面中，所用Pdot的临界尺寸是30nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是25nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是20nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是15nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是10nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是5nm或更小。
在一些方面中，所用Pdot的临界尺寸为大于1nm且小于1000nm。
该纳米颗粒的可能形状是基本不受限制的。然而，在某些方面中，该形状选自球形、圆柱形、椭圆形、多面体、棱镜形、杆状和线状。本领域技术人员应理解，纳米颗粒的形状可影响检测性质(例如，纳米杆的光学性质不同于纳米球)。
纳米颗粒的纳米级尺寸是必要的，从而绕过大颗粒尺寸带来的问题。例如，在将纳米颗粒连接至目标分子(如蛋白质)以进行光致发光成像时，相对大的颗粒具有较大的表面积用于与目标以外的分子非特异性结合，或使目标以外的分子吸收至表面。
对提供的纳米颗粒进行优化以用作可连接至目标分子的光致发光报道物，作为分析方法、系统或试剂盒的一部分。这些纳米颗粒应能够使用光致发光容易地检测到并应对其目标分子具有特异性。
可通过改变给定Pdot的组成和几何形状来调节其光学性质(如吸收波长)。已使用范围为UV至红外(包括整个可见光谱)的吸收波长来开发半导体聚合物。在一些方面中，所用Pdot的峰值吸收波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约1000nm。
已使用范围为UV至红外(包括整个可见光谱)的发射波长来开发半导体聚合物。在一些方面中，所用Pdot的峰值发射波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm、约900nm至约1000nm、约950nm至约1050nm、约1000nm至约1100nm、约1150nm至约1250nm、或约1200nm至约1300nm。
在一些方面中，提供的方法、系统、组合物和试剂盒将利用具有窄带发射(narrow-bandemission)的Pdot。窄带发射对于某些应用是有利的，包括但不限于多重应用。聚合物点的发射波长可在紫外至近红外区域中变化。发射带的半宽度(FWHM)小于70nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约65nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约60nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约55nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约50nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约45nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约40nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约35nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约30nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约25nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约20nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约10nm。在一些实施方式中，本发明所述聚合物点的FWHM的范围可以是约5nm至约70nm、约10nm至约60nm、约20nm至约50nm，或约30nm至约45nm。
在一些实施方式中，用于制备Pdot的窄带发射聚合物包括硼-二吡咯亚甲基(4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-二环戊二烯并苯(indacene)，BODIPY)和或其衍生物，和/或其他含硼单体及其衍生物，作为窄带单体。BODIPY和其他含硼单体及其衍生物包括但不限于其烷基衍生物、芳基衍生物、炔衍生物、芳族衍生物、醇盐衍生物、氮杂衍生物、BODIPY扩展系统和其他BODIPY衍生物。窄带发射聚合物还可包括任何其他单体。基于BODIPY的单体可以是能量受体且其他单体可以是能量供体，从而使最终Pdot可表现出窄带发射。良好溶剂中的窄带发射发色聚合物可显示宽发射或窄发射。具有窄带发射的Pdot(包括BODIPY和其他含硼单体及其衍生物)的综合性描述参见WO2013/101902，其通过引用全文纳入本文。
本领域普通技术人员应理解，本文定义的多个化学术语可用于描述本发明的聚合物和单体的化学结构。例如，多种单体衍生物(如BODIPY衍生物)可包括本发明所述多种化学取代基和基团。例如，在一些实施方式中，多种单体的衍生物可被氢、氘、烷基、芳烷基、芳基、烷氧基-芳基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基、N-二烷氧基苯基-4-苯基、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸和/或羟基取代。
本发明可包括聚合物点，例如窄带发射发色聚合物点。如本文中进一步描述的那样，本发明包括多种表现出窄带发射性质的聚合物点(如FWHM小于70nm)。如本文中进一步描述的那样，本发明的多种聚合物点可包括具有窄带发射单元的聚合物(如窄带单体和/或窄带单元)。例如，本发明可包括均聚物或杂聚物，其包含窄带单体，如BODIPY和/或BODIPY衍生物单体、方酸菁和/或方酸菁衍生物、金属复合物和/或金属复合物衍生物单体、卟啉和/或卟啉衍生物单体、酞菁和/或酞菁衍生物单体、镧系复合物和/或镧系复合物衍生物单体、二萘嵌苯和/或二萘嵌苯衍生物单体、花青和/或花青衍生物单体、若丹明和/或若丹明衍生物单体、香豆素和/或香豆素衍生物单体，和/或呫吨和/或呫吨衍生物单体。窄带单元可以是，例如，窄带单体或荧光纳米颗粒，其包埋在聚合物点中或与聚合物点相连。该荧光纳米颗粒可以是，例如，量子点。窄带单元还可包括聚合物和荧光染料分子，其在本发明的聚合物点中生成窄发射。
多种其他BODIPY衍生物可用于本发明。BODIPY和BODIPY衍生物可进行聚合以形成聚合物(如均聚物或杂聚物)和/或可连接(如共价连接)至聚合物主链、侧链和/或末端。在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(I)的结构：
其中，R1、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A和R4B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。窄带单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R1、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B的至少一个连接，或其组合)。
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(II)的结构：
其中，R1、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A和R4B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。窄带单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R1、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B的至少一个连接，或其组合)。例如，该单体可通过连接至R3A和R3B基团来与聚合物的主链整合。
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(III)的结构：
其中，R1、R2A和R2B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。窄带单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R1、R2A、R2B的至少一个连接，或其组合)。括号表示单体与聚合物主链的连接点。
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(IV)的结构：
其中，R1、R2A、R2B、R3A和R3B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。窄带单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R1、R2A、R2B、R3A和R3B的至少一个连接，或其组合)。
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(V)的结构：
其中，R1、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A和R5B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。窄带单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中共聚化)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R1、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B的至少一个连接，或其组合)。在某些实施方式中，这些窄带单体可通过与R5A和R5B连接来整合至主链中。
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(VI)的结构：
其中，R1A、R1B、R2A、R2B、R3A和R3B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。窄带单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R1A、R1B、R2A、R2B、R3A、R3B的至少一个连接，或其组合)。
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(VII)的结构：
其中，R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A和R5B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。窄带单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B的至少一个连接，或其组合)。
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(VIII)的结构：
其中，R1A、R1B、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A和R4B各自独立地选自但不限于：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基，且R5A、R5B、R6A和R6B各自独立地选自但不限于：
氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。窄带单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中共聚化)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R1A、R1B、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R6A、R6B的至少一个连接，或其组合)。
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(IX)的结构：
其中，X具有式(X)、(XI)、(XII)或(XIII)中任一种或其衍生物的结构：
且其中，式(X)、(XI)、(XII)和(XIII)中的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10,R11,R12、R13、R14和R15各自独立地选自：氢(H)、氘(D)、卤素、直链或支链烷基、杂烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、烷氧基、芳基、羟基、氰基、硝基、醚及其衍生物、酯及其衍生物、烷基酮、烷基酯、芳基酯、炔基、烷基胺、氟代烷基、氟代芳基和聚亚烷基(例如，甲氧基乙氧基乙氧基、乙氧基乙氧基和–(OCH2CH2)nOH、n＝1-50)、苯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯基、吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡啶基、二吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的二吡啶基、三吡啶基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的三吡啶基、呋喃基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的呋喃基、噻吩基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻吩基、吡咯基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡咯基、吡唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡唑基、噁唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噁唑基、噻唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的噻唑基、咪吡基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的咪吡基、吡嗪基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的吡嗪基、苯并噁二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的苯并噻二唑基、芴基、烷基(烷氧基、芳基、氟代烷基、氟代芳基)取代的芴基、三苯基氨基取代的芴基、二苯基氨基取代的芴基、烷基取代的咔唑基、烷基取代的三苯基氨基和烷基取代的噻吩基。作为示例性实施方式，烷基取代的苯基可包括2-烷基苯基、3-烷基苯基、4-烷基苯基、2,4-二烷基苯基、3,5-二烷基苯基、3,4-二烷基苯基；烷基取代的芴基可包括9,9-二烷基取代的芴基、7-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、6-烷基-9,9-二烷基取代的芴基、7-三苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基和7-二苯基氨基-9,9-二烷基取代的芴基；烷基取代的咔唑基可包括N-烷基取代的咔唑基、6-烷基取代的咔唑基和7-烷基取代的咔唑基；烷基取代的三苯基氨基可包括4’-烷基取代的三苯基氨基、3’-烷基取代的三苯基氨基、3’,4’-二烷基取代的三苯基氨基和4’,4”-烷基取代的三苯基氨基；烷基取代的噻吩基可包括2-烷基噻吩基、3-烷基噻吩基和4-烷基噻吩基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4-苯基和N-二烷氧基苯基-4-苯基。当X代表萘及其衍生物时，窄带单体可整合至聚合物的主链中(例如在聚合物中聚合化)和/或连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R7、R8、R9、R10、R11、R12的至少一个连接，或其组合)。当X代表蒽及其衍生物时，窄带单体可整合至聚合物的主链中和/或共价连接至聚合物的主链、末端或侧链(通过与R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15的至少一个连接，或其组合)。
可以使用多种聚合物点，例如本文所述实施例以及公开于例如WO2011/057295和WO2013/101902中的其他聚合物点，上述文献各自通过引用全文纳入本文且具体涉及本文所述的特定Pdot组合物和相应的制备这些组合物的方法。例如在WO2011/057295中，聚合物点中的聚合物可经物理掺混或化学连接(或化学交联)。例如，物理掺混的聚合物点可包括掺混在聚合物点中并通过非共价相互作用固定在一起的聚合物。化学连接的聚合物点可包括聚合物点中彼此共价连接的聚合物。化学连接的聚合物可以在形成聚合物点前彼此共价连接。
例如，这些聚合物点可包括直接官能化和/或具有低密度官能化的那些。
官能化的聚合物点
在多个方面中，本发明提供了“官能化”聚合物点的应用，且具体而言作为修饰Pdot表面的方法。在Pdot的上下文中，本文所用术语“官能化”指与一种或多种官能团连接(如共价连接)的Pdot。本文所用术语“官能团”指满足下述条件的任何化学单元，其可与发色聚合物连接(如通过任何稳定的物理或化学连接)，从而改变Pdot的表面，例如形成可用于偶联(如生物偶联)的表面。该官能团可共价连接发色聚合物的主链、侧链或末端单元之一。该官能团可以是但不限于以下：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，其取代的衍生物或其组合。通常，可以使用适用于生物偶联的任何其他官能团。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物偶联技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
在一些方面中，本发明的官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，其取代的衍生物或其组合。
在一些方面中，提供了使用经官能化的Pdot的方法、系统、组合物和试剂盒。根据本发明，可以使Pdot适合于进一步修饰(如生物偶联)或随后在检测蛋白质或肽中应用的任意方式来对Pdot进行官能化。例如，官能团可与发色聚合物的主链、侧链或末端单元之一连接(如共价连接)。在一些方面中，单价聚合物点可包含单个聚合物分子，其仅包含一个官能团，例如在单个线性聚合物分子的两个末端单元之一处。二价聚合物点可包含单个聚合物分子，其包含两个官能团，例如在单个线性聚合物分子的两个末端单元的每一个处。三价聚合物点可包含单个聚合物分子，其包含三个官能团，例如官能团仅连接三臂分支聚合物的三个末端单元。类似地，分支的聚合物可用于制备其他多价聚合物点，例如，其在四臂、五臂、六臂和具有更多分支数目的分支聚合物的末端单元处连接官能团。
在一些方面中，优势可来自于使用包含单个聚合物分子的聚合物点，所述聚合物分子在末端单元处具有至少一个官能团。例如，可在聚合物合成中良好地控制仅一个官能团与发色聚合物末端单元的连接。例如，包含官能团的化学单元可用作聚合引发剂以及聚合物合成中的生长催化剂，且在该方法中各聚合物分子在末端处仅包含一个官能团。还可在聚合物合成中良好地控制官能团仅与线性发色聚合物的两个末端单元连接。例如，包含官能团的化学单元可用作封端剂以终止聚合物合成中的聚合物生长，从而导致各线性聚合物分子仅在两个末端单元中包含两个官能团。类似地，可在聚合物合成中良好地控制多价聚合物点的官能团的连接，例如，可仅将官能团添加至三臂分支聚合物的三个末端单元。
在多个方面中，该聚合物点包含与聚合物点相连的官能团。在某些方面中，该官能团选自疏水性官能团、亲水性官能团或其组合。在一些方面中，该官能团适用于生物偶联。
在某些方面中，该官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，或其组合。
在多个方面中，该生物分子是蛋白质。在其他方面中，该生物分子是抗体或亲和素。
聚电解质包被的聚合物点
本发明提供了使用Pdot检测和测量蛋白质(例如通过Western印迹分析)的方法、组合物、试剂盒和系统。在一些方面中，可以使用具有聚电解质包衣的聚合物点。有利地，聚电解质包衣可，例如，改进特定溶液中聚合物点的胶体稳定性，所述溶液具有高离子强度，含有二价金属离子，或兼具上述两种性质。例如，与一些不具有聚电解质包衣的聚合物点相比改进的胶体稳定性可允许在试验中使用聚合物点而不丧失其功能。在某些方面中，可调节该聚电解质包衣的组成成分以降低或消除溶液(如高离子强度溶液)中聚合物点的聚集。此外，在某些情况下，溶液中的离子(如二价离子)可螯合聚合物点表面上的基团，从而影响聚集性质。在一些方面中，聚电解质包衣用于减少或消除溶液中聚合物点的聚集。
在其他方面中，该聚合物点由聚电解质包衣包围。在其他方面中，该聚电解质包衣包含选自下组的聚电解质：聚(苯乙烯磺酸酯/盐)、聚磷酸酯/盐、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯-共-马来酸酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖、多糖、聚赖氨酸、聚组氨酸和聚肽。
在某些方面中，该聚电解质包衣包含聚电解质聚合物，该聚电解质聚合物的各重复单元包含选自下组的带电基团：羧基、磺酸酯/盐、磷酸酯/盐、氨基、羟基和巯基。
这些聚电解质包衣的层厚度范围可以是约2至4纳米，从而使包含聚合物点和聚电解质包衣的纳米颗粒的直径增加约4至8纳米。
包衣中的聚电解质可以多种方式在聚合物点的表面上形成。例如，如果使用一种类型的聚电解质，聚电解质聚合物分子可物理掺混在一起以形成包衣。如果使用两种或更多种类型的聚电解质，这些聚电解质聚合物分子可物理掺混在一起以形成包衣，或者，在某些方面中，不同的聚电解质可在纳米颗粒表面上形成区域(或筏(raft))。在一些方面中，这些聚电解质可以化学交联。例如，可使用本领域通常熟知的任何交联反应来使包衣中的一些或全部聚电解质化学交联。还可使用浓缩的形成聚合物点的聚合物使聚电解质化学交联。在一些方面中，该包衣可包含超过一层聚电解质。例如，该包衣可包含两层聚电解质、三层聚电解质，或更多层聚电解质。各层中的聚电解质可包含相同或不同类型的聚电解质。
本文中，“聚电解质”可包括，例如，其中重复单元携带具有电荷的电解质基团的聚合物。在一些方面中，这些聚电解质可包含聚合物，其中沿该聚合物的所有重复单元都携带电解质基团。在某些方面中，聚合物的一些重复单元携带电解质基团。例如，本发明的聚电解质可包含以下聚合物，其中至少99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的重复单元携带电解质基团。在一些方面中，本发明的聚电解质可包含以下聚合物，其中至少99％、95％、90％、85％或80％的重复单元携带电解质基团。
在一些方面中，这些聚电解质可包含至少一种类型的电解质基团。例如，这些聚电解质可仅包含一种类型的电解质基团，或两种或更多种类型的电解质基团。本文所述多种电解质基团可包含在多种不同类型的聚电解质中。本发明中的示例性聚电解质可包括但不限于：聚(苯乙烯磺酸酯/盐)、聚磷酸酯/盐、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯-共-马来酸酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖、多糖、聚赖氨酸、聚组氨酸和聚肽。本发明所述电解质基团可包含在聚合物主链中，包含在与聚合物主链连接的侧链中，和/或包含在与聚合物侧链连接的基团中。
本发明中可使用多种电解质基团。通常，在某些条件下生成电荷的任何基团都可用于聚电解质。例如，该电解质基团可包括阴离子或阳离子。在一些方面中，该电解质基团可包括一个阴离子或一个阳离子。或者，该电解质基团可包含超过一个阴离子和/或阳离子，使得该电解质基团包含总体的负电荷或正电荷。电解质基团上的电荷可以是永久电荷或根据溶液的特定pH生成的电荷(例如，氢可解离以形成带电电解质基团)。在一些方面中，在溶解于水溶液前，该电解质基团可以是盐(如使用抗衡离子中和)。在一些方面中，该电解质基团可包括但不限于：羧基基团、磺酸酯/盐基团、磷酸酯/盐基团、氨基、羟基基团和巯基基团。在一些方面中，可根据酸性或碱性溶液特征生成电解质基团的电荷。例如，羧基基团、磺酸酯/盐基团、磷酸酯/盐基团、氨基、羟基基团或巯基基团可以带负电荷，例如根据溶液的pH和各电解质基团的pKa。在水溶液中，聚合物上的电解质基团可解离以形成带电基团，从而使这些聚合物带电，形成聚电解质。在一些方面中，这些电解质基团可以被取代基取代以使电解质基团带永久电荷。例如，氨基基团可包括具有永久正电荷的季铵阳离子。电解质基团的取代基是不同的，例如烷基、芳基、CN、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸、羟基或卤化物。在某些方面中，这些电解质基团上的取代基可向电解质提供电荷。
本发明的一个方面包括通过提供聚电解质包衣来修饰聚合物点的ζ电势。该包衣可用于修饰，例如，纳米颗粒的表面电荷并防止溶液中的聚集。根据溶液，可调节ζ电势以防止聚集。在一些方面中，ζ电势是评估分散在溶液中的颗粒是否能够抗聚集的参数。例如，当颗粒(使用聚电解质包被的聚合物点)的ζ电势大于+30mV或小于-30mV时，这些颗粒将是稳定的(如抗聚集)。较高的ζ电势值可提供更多的针对聚集的稳定性。例如，具有+/-60mV的颗粒分散系可提供出色的稳定性。根据所选择的本文所述聚电解质，本发明包括ζ电势大于约+30mV、大于约+40mV、大于约+50mV或大于约+60mV的颗粒分散系(例如具有聚电解质包衣的聚合物点)。本发明包括ζ电势小于约-30mV、小于约-40mV、小于约-50mV或小于约-60mV的颗粒分散系(例如具有聚电解质包衣的聚合物点)。可使用针对多种聚电解质的本发明所述方法来制备包含具有聚电解质包衣的聚合物点的颗粒。随后可使用多种技术来确定颗粒分散系的ζ电势，例如通过使用设计为测量ζ电势的仪器，例如通过MalvernZetasizer。
在某些方面中，本发明包括含有聚合物点的纳米颗粒，所述聚合物点含有包衣，所述包衣包含超过一种聚电解质聚合物。例如，这些包衣可包含两种不同的聚电解质、三种不同的聚电解质、四种不同的聚电解质，或更多并以任何需要的比例。
聚合物点的生物偶联物
在多个方面中，本发明的聚合物点可被生物偶联以促进蛋白质或肽的检测。在一些方面中，提供了使用与生物分子偶联的Pdot得方法、系统、组合物和试剂盒，例如，Pdot的官能化，其中生物分子直接或间接通过官能团与Pdot连接。
术语“生物分子”用于描述合成的或天然产生的蛋白质、糖蛋白、肽、氨基酸、代谢物、药物、毒素、核酸、核苷酸、碳水化合物、糖、脂质、脂肪酸等。与生物分子偶联的Pdot在本文中有时称作“生物偶联物”。生物偶联物还可包括与生物颗粒(如病毒、细菌、细胞和天然产生的或合成的囊泡如脂质体)相连的官能化发色聚合物点。这些官能化发色聚合物点可包括一种或多种官能团，其形成自具有一个或两个末端官能团或低密度侧链官能团的发色聚合物。
在某些方面中，这些生物偶联物包含单价发色聚合物点和生物分子，该生物分子通过官能团直接或间接连接聚合物。这些生物偶联物还可包含与生物颗粒(如病毒、细菌、细胞和天然产生的或合成的囊泡如脂质体)相连的单价发色聚合物点。
在本发明的一些方面中，该生物分子通过共价键连接单价发色聚合物点的官能团。例如，如果聚合物点的官能团是羧基，蛋白质生物分子可通过使该羧基与蛋白质分子的氨基交联来直接连接聚合物点。
在本发明的多个方面中，交联剂可用于促进Pdot的生物偶联。本文所用术语“交联剂”用于描述以下化合物或部分，其能够在类似或不类似的分子上的分子基团之间形成化学键以将这些分子共价连接在一起。常见交联剂的示例是本领域已知的。参见，例如，BioconjugateTechniques(《生物偶联技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996或更新版本)。生物分子与单价发色聚合物点的间接连接可通过使用“接头”分子发生，例如，亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、生物素或类似分子。
在一些方面中，提供了使用与特异性结合靶标的生物分子偶联的聚合物点来分析目标分子(例如蛋白质)的方法、系统、组合物和试剂盒。
在一些方面中，荧光Pdot偶联于一种或多种提供某项功能或其他益处(包括但不限于对目标分子的结合亲和力)的分子。
在一些方面中，该目标分子是感兴趣的蛋白质，且与Pdot偶联的生物分子是特异性结合该目标蛋白质的一抗。
在其他方面中，该目标分子是感兴趣的蛋白质，其连接所述蛋白质的一抗，且与Pdot偶联的生物分子是特异性结合该一抗的二抗。
在其他方面中，该目标分子是生物素化的感兴趣的蛋白质，与Pdot偶联的生物分子是特异性结合该生物素化蛋白质的亲和素(如链霉亲和素)。
本文所用术语“生物素”指能够与亲和素有效结合的多种生物素衍生物和类似物中的任一种。合适的生物素部分包括能够通过亲和素和相关亲和素蛋白来分离生物素化肽片段的那些部分。代表性生物素部分包括生物素衍生物(如亚氨基生物素、生物胞素和己酰基氨基生物素)和生物素类似物(如脱硫生物素和生物素砜)。
本文所用术语“亲和素”指结合生物素的不同于免疫球蛋白的任何生物素结合蛋白，包括天然蛋白质以及重组和遗传工程改造的蛋白质。该术语包括两种常见的生物素结合蛋白，称为“蛋白”或“禽”亲和素和“链霉亲和素”。蛋白或禽亲和素，通常简称为亲和素，是一种蛋白质，其是蛋白的组分且与生物素形成非共价复合物。链霉亲和素是一种亲和素蛋白，其分离自放线菌链霉菌(Streptomycesavidinii)且也与生物素形成非共价复合物。生物素结合蛋白的其他细菌来源也是已知的。蛋白亲和素和链霉亲和素都是四聚体蛋白质，其中生物素结合位点成对排列在亲和素分子的相对面上。该术语还指亲和素衍生物，包括琥珀酰亲和素、铁蛋白亲和素、酶亲和素和交联亲和素。
在一些方面中，荧光Pdot可与一种或多种改变Pdot的其他性质(例如其尺寸、荧光、疏水性、非特异性结合或吸收性质等)的分子偶联。
在一些方面中，生物分子与Pdot的偶联可包括官能团的连接，包括但不限于羧基基团与Pdot的连接。在一些方面中，羧基基团可在碳二亚胺(如盐酸1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC))存在时与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应以生成羧酸根/羧酸酯基团的氨基反应性酯(amine-reactiveester)用于与某些生物分子上存在的伯胺基团交联。
在一些方面中，通过混合Pdot与生物分子使羧化Pdot与生物分子(如蛋白质)偶联，例如在含有0.1％PEG(MW3350)的HEPES缓冲液(20mM,pH＝7.4)中。Pdot上羧基与生物分子上氨基之间肽键的形成可由EDC催化。然而，由于Pdot的内在疏水本质，生物分子倾向于非特异性吸附在颗粒表面上。在一些方面中，可导入曲通X-100和/或牛血清白蛋白(BSA)以减少生物分子在Pdot表面上的非特异性吸附。
除了本文所述实施例外，在一些方面中还可使用其他策略和方法以偶联生物分子和Pdot，例如参见WO2011/057295和WO2013/101902。本领域的普通技术人员可在例如BioconjugateTechniques(《生物偶联技术》)(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1996年或之后的版本)中找到用于偶联生物分子和Pdot的其他策略和方法。
聚合物点的稳定性
本发明还提供了适用于生产和维持用于本发明所述方法的稳定Pdot群的组合物和方法。可制备本发明所述的Pdot以用于Western印迹分析所用组合物和试剂盒。在一些方面中，可制备稳定形式的Pdot群，使得其可在用于Western印迹试验前储存一段时间。
本文所用术语“稳定”指在适当水溶液中储存延长的一段时间时不聚集和/或显著改变尺寸的发色聚合物点(由电子显微镜、原子力显微镜或动态光散射测量)。聚合物点的聚集或尺寸上的显著变化的特征可以是，例如，包含超过一个聚合物点的聚集体的数目增加。可使用成像技术(例如电子显微镜或原子显微镜)通过肉眼观察和/或通过动态光散射显示的尺寸测量值增加来检测聚集体。在一些方面中，聚集体的特征可以是，与发色聚合物点的原始测量值相比，测量的颗粒直径存在至少约10％增加、至少约25％增加、至少约50％增加、至少约100％增加、至少约500％增加，或至少约1000％增加。例如，发色聚合物点可在第一天测得直径中位数为15nm并随后在四个月后测得直径中位数为30nm，从而显示所测量颗粒直径的100％增加(即表现出聚集)。
在某些方面中，这些发色聚合物点可以在储存于适当水溶液中时稳定至少约一个月，优选至少约2个月，更优选至少约4个月。在某些方面中，稳定的发色纳米颗粒将在至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36、42、48或更多个月期间不聚集或在尺寸上发生显著变化。在一些方面中，本发明提供的官能化发色纳米颗粒将在适当水溶液中稳定至少约4个月。在其他方面中，本发明提供的官能化发色纳米颗粒将在适当水溶液中稳定至少约6个月。在其他方面中，本发明提供的官能化发色纳米颗粒将在适当水溶液中稳定至少约一年。
在一些方面中，术语“稳定”可指发色聚合物点耐受聚合物点中掺杂物或聚合物分子的解离。例如，发色聚合物点可包含若干聚合物分子且这些聚合物分子可在浸出至溶液前在聚合物点中维持一段时间。聚合物分子从聚合物点中浸出的特征可以是例如聚合物点的光物理性质减低。在一些方面中，发色聚合物点的稳定性降低的特征可以是在对应于聚合物点发射的波长下发射强度随时间降低。在某些方面中，可通过在对应于聚合物点发射的特定波长下发射强度随时间升高来检测聚合物点的降解。除了测量聚合物发射外，这些聚合物点还可设计为在纳米颗粒形成期间整合溶液中的荧光染料。随着聚合物点的降解，染料可随时间浸出并被检测。
使用发色聚合物点进行分析的方法
本发明提供了发色Pdot用于检测蛋白质和肽的应用。在一些方面中，本发明涉及生物偶联的Pdot在Western印迹试验中的应用，包括分离和检测感兴趣的蛋白质或肽。
根据本发明的多个方面，可通过色谱、过滤、毛细电泳、沉淀、液相或其他提取方法、免疫沉淀或其组合来分离蛋白质或肽。
在某些方面中，可使用Pdot进行其他蛋白质检测试验，包括但不限于免疫染色、分光光度法、基于酶的试验(如ELISA)及其组合。
本发明可与包括使用Pdot检测蛋白质或肽分析物的任何试验联用。在多个方面中，可在检测前从混合物中分离蛋白质或肽。本发明的方法可与免疫方法(例如ELISA试验、RIA试验、ELI-Spot试验、流式细胞试验、免疫组化试验、免疫染色、Western印迹分析和蛋白质芯片试验)、物理方法(例如单向或双向凝胶电泳试验、毛细电泳试验、FRET试验、色谱试验，或染料检测试验、分光光度试验、沉淀方法)或其组合联用。
在多个方面中，在使用本发明的Pdot进行检测前，可通过色谱方法、过滤方法、毛细管电泳方法、凝胶电泳方法、液相提取方法、沉淀方法或免疫沉淀方法来分离蛋白质或肽。此外，色谱方法可以是反向色谱。
在多个方面中，可平行进行多个试验以改进分析通量。
在多个方面中，本发明提供了进行Western印迹分析的方法，该方法包括：使用凝胶分离蛋白质；将分离的蛋白质转移至膜上；使含有分离的蛋白质的膜接触包含聚合物点的溶液，该聚合物点与特异性针对至少一些分离的蛋白质的生物分子偶联；以及检测来自聚合物点的至少一种信号，该至少一种信号对应于分离的蛋白质。
在多个方面中，本发明提供了检测蛋白质或肽的方法，该方法包括：从混合物中分离蛋白质或肽；使分离的蛋白质或肽接触包含聚合物点的溶液，该聚合物点与特异性针对至少一些分离的蛋白质或肽的生物分子偶联；以及检测来自聚合物点的至少一种信号，该至少一种信号对应于分离的蛋白质或肽。
在一些方面中，本发明的方法定量蛋白质或肽。
在一些方面中，分离所述蛋白质或肽包括色谱法、过滤法、毛细管电泳法、凝胶电泳法、液相萃取法、沉淀法、免疫沉淀法或其组合。
在一些方面中，聚合物点中包含的聚合物选自半导体聚合物、非半导体聚合物或其组合。
在一些方面中，聚合物点中包含的聚合物选自：基于聚((甲基)丙烯酸)-的聚合物、基于聚二烯的聚合物、基于聚(环氧乙烷)的聚合物、基于聚异丁烯的聚合物、基于聚苯乙烯的聚合物、基于聚硅氧烷的聚合物、基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的聚合物、基于聚(2-乙烯基萘)的聚合物、基于聚(乙烯基吡啶)的聚合物、基于聚(碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的聚合物，或基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的聚合物。
在一些方面中，本发明提供了与Western印迹试验联用对蛋白质或肽的检测。Western印迹是一种蛋白质分析方法，其中蛋白质通过质量和/或长度分离，通常使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后转移至由例如硝酸纤维素或氟化聚合物(如聚偏二氟乙烯(PVDF))组成的膜上，并使用标记过程观察。在本发明中，Pdot显示使用Western印迹分析对含量低至50皮克的蛋白质提供检测(参见例如实施例5)。
在一些方面中，本发明可使用聚合物点对Western印迹上的蛋白质进行超灵敏荧光成像。在一些方面中，使用明亮、紧密和发射橙光的半导体聚合物点CN-PPV。
在某些方面中，使用凝胶电泳分离蛋白质或肽。在本发明的其他方面中，使用毛细管电泳分离蛋白质和肽，其中在毛细管内分离和标记蛋白质或肽。该方法类似于标准SDS-PAGE分离中进行的方法，但在毛细管空间内进行。
凝胶电泳期间，蛋白质根据大小在凝胶上分离。随后可将大小范围或“条带”从凝胶内转移至膜上。在一些方面中，在本领域中称作电印迹的技术中使用电流将蛋白质从凝胶拉到膜上，从而将蛋白质或肽转移至膜。在其他方面中，使用毛细管力将蛋白质从凝胶转移至膜上。在本发明的其他方面中，可以使用将蛋白质从凝胶转移至膜的其他方法。
在一些方面中，将蛋白质置于硝酸纤维素膜上。在其他方面中，将蛋白质置于由氟化聚合物(如PVDF)组成的膜上。根据本发明，可以使用任何合适的膜。
在其他方面中，提供了在点印迹试验中使用Pdot对分子进行超灵敏荧光成像的方法。在点印迹试验中，不首先分离待检测的蛋白质或肽。而是，将未分离的样品以点的形式直接施加于膜上并使用标记过程观察。在本发明中，Pdot显示使用点印迹分析为低于两皮克含量的蛋白质提供检测。
使用常规Western印迹观察到单皮克水平的检测限值。SDS-PAGE和转移至PVDF膜上后对转铁蛋白和胰蛋白酶抑制剂观察到50皮克水平的检测。在许多优势中，与使用传统荧光探针的常规方法相比，本发明的方法无需任何额外设备或时间。
在本发明的一些方面中，对一种或多种生物细胞、组织、流体中含有的样品或其他样品进行分析。在其他方面中，在将样品从一种或多种生物细胞、组织、流体或其他样品中收集后对样品进行分析。可任选地通过诸如SDS-PAGE的方法分离蛋白质或肽，之后使用特异性针对感兴趣的蛋白质或肽的生物偶联的Pdot检测该蛋白质或肽。
可通过以下方法从组织、细胞或流体样品中收集蛋白质或肽，包括但不限于，冻融、超声、高压匀化、过滤、透化和离心。在一些方面中，收集的蛋白质或肽还可在分析前经历一个或多个分离或纯化步骤。
在一些方面中，可对含有不同蛋白质的异质性混合物的样品进行分析。在其他方面中，可对纯化的蛋白质进行分析。
在一些方面中，在分析前分离样品，例如通过凝胶电泳或适用于分离样品的其他方法。在一些方面中，在分析前基于质量和/或电荷分离蛋白质或肽。
在一些方面中，将Pdot悬浮在液体中，且使该液体物理接触样品，该样品悬浮在第二液体中或置于表面上。在一些方面中，该样品置于包含膜的表面上。
在一些方面中，Pdot置于表面上，并使该表面与样品物理接触，该样品悬浮于液体中。在一些方面中，其上放置Pdot的表面包含膜。
在一些方面中，进行免疫沉淀试验，其中Pdot置于表面上并与悬浮于液体中的蛋白质样品物理接触。根据该方面，蛋白质样品与相应Pdot的接触导致蛋白质通过结合Pdot粘附于表面。
在多个方面中，本发明所述Pdot将在由激发源正确诱导时发射荧光。在某些方面中，可测得存在的Pdot量并随后与给定的感兴趣的分析物(如感兴趣的蛋白质)的量相关联。因此，本发明所述方法利用激发光源来诱导Pdot荧光，其可随后被测量并与样品浓度相关联。在多个方面中，电磁辐射(如红外辐射、可见光或紫外辐射)被用于触发来自Pdot的电磁辐射，且发射的信号可被用于评价样品中存在的目标分子的量。在一些方面中，电磁辐射源可包含激光、LED、灯、滤光片或多向色镜(multichroicmirror)。在一些实施方式中，光激发源可以是凝胶成像设备、显微镜或其他合适设备的组件。可调节给定Pdot的化学和物理性质以调节激发和发射波长以及其他光学性质。
在一些方面中，诱导Pdot激发的电磁辐射的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约1000nm。在一些情况下，样品可经历超过一种激发光谱，例如在多重分析中。
在一些方面中，所检测信号的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm、约900nm至约1000nm、约950nm至约1050nm、约1000nm至约1100nm、约1050nm至约1150nm、约1100nm至约1200nm、约1150nm至约1250nm，或约1200nm至约1300nm。
在一些方面中，该试验足够灵敏以检测低于500皮克、低于400皮克、低于300皮克、低于200皮克、低于100皮克、低于50皮克、低于40皮克、低于30皮克、低于20皮克、低于10皮克、低于5皮克、低于4皮克、低于3皮克、低于2皮克或低于1皮克的目标分子(如蛋白质)。
在许多优势中(如改进的检测灵敏度和光稳定性)，与使用传统荧光探针的常规方法相比，本发明的方法无需任何额外设备或时间。
使用本发明所述聚合物点的Western印迹分析与现有方法相比具有显著优势，部分来自于Pdot的优异的发射性质和特异性。使用偶联的Pdot提供了优异的发射性质，例如相对于现有方法，基于荧光的检测方法的高亮度。在一些方面中，使用偶联的Pdot提供了针对感兴趣的目标分子的优异的特异性，所述目标分子是例如通过SDS-PAGE分离的蛋白质或肽。
本文中，“特异性”指与偶联的Pdot物理接触其他组分时相比，该偶联的Pdot与其靶标的结合亲合力更高。偶联的Pdot特异性针对其靶标的前提是偶联的Pdot与其靶标的平衡常数大于偶联的Pdot与其物理接触的其他组分的平衡常数。较高的特异性表示相对于其他组分与靶标的结合亲合力较高，且这表明针对某一靶标，试验中的检测灵敏度提高。有利地，本发明的方法对本发明的目标分子(例如蛋白质或肽)表现出非常高的特异性。
在本发明的一些方面中，封闭剂被用于改变偶联的聚合物点的非特异性吸附和/或结合性质。在一些方面中，该封闭剂与聚合物点竞争吸附表面或膜，从而降低Pdot的非特异性吸附的发生率。在一些方面中，该封闭剂与聚合物点竞争结合一种或多种干扰蛋白。封闭剂与表面、膜和蛋白质的相互作用降低了偶联的聚合物点能够吸附或结合的表面、膜和蛋白质的量。该封闭剂改善Western印迹或其他蛋白质分析的信噪比，因为其降低来自不结合目标蛋白质的聚合物点的发射量(即噪音)，同时对来自结合目标蛋白质的聚合物点的发射量(即信号)的影响很小。
在一些方面中，该封闭剂可包含白蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)。在一些方面中，该封闭剂可包含基于牛奶的产品，例如脱脂奶粉。在一些方面中，该封闭剂可包含基于酪蛋白的产品，例如I-Block(生命技术公司(LifeTechnologies))。在一些方面中，该封闭剂还可包含去垢剂，例如曲通X。
在一些方面中，使用偶联的Pdot改进了检测灵敏度，因为那些Pdot对表面(例如对其上具有样品的膜)的非特异性吸附水平相对较低。在某些方面中，通过使用封闭剂最小化非特异性吸附，所述封闭剂是能够封闭非特异性吸附的任何试剂，所述非特异性吸附会干扰使用Pdot精确检测目标蛋白质或肽。例如，封闭剂有利地封闭Pdot和/或生物分子非特异性吸附至这些Pdot和/或生物分子物理接触的表面上。
在一些方面中，分离包括使用凝胶，该凝胶包含聚丙烯酰胺、琼脂糖、淀粉或其组合。在一些方面中，分离包括SDS-PAGE分离。在某些方面中，该方法使用膜且该膜包含硝酸纤维素或氟化聚合物膜。在其他方面中，该氟化聚合物是PVDF。
在一些方面中，检测包括检测皮克量的分离的蛋白质。在其他方面中，检测包括检测少于2皮克的分离的蛋白质。在某些方面中，该方法还包括使用电磁辐射源激发聚合物点。在一些方面中，该电磁辐射源包括激光、灯、LED或其组合。在其他方面中，该电磁辐射在激发聚合物点前通过滤光片、多向色镜或其组合。
在一些方面中，激发样品的电磁辐射的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约1000nm。在一些方面中，两种或更多种电磁辐射峰值波长激发样品。
使用发色聚合物点进行分析的组合物和试剂盒
在本发明的一些方面中，提供了使用聚合物点进行分析的试剂盒。在多个方面中，本发明提供的组合物各自都还可配置为用于试剂盒中。在一些方面中，该组合物或试剂盒包含用于进行试验的与生物分子偶联的Pdot。在一些方面中，该试剂盒向终端用户提供使用常规实验室设备和方法进行更灵敏试验的方法和试剂。
测试试剂盒可任选地包含用作标准品和/或对照的物质。
在多个方面中，本发明提供了用于测定目标蛋白质或肽的绝对浓度或相对浓度、或测定是否存在目标蛋白质或肽的试剂盒。在一些方面中，本发明的试剂盒可用于分析来自对象的样品。在一些方面中，该试剂盒可与分离方法联用，例如凝胶电泳、毛细管电泳、色谱、过滤、沉淀、液相或其他提取方法、免疫沉淀，或其组合。
在其他实施方式中，本发明的试剂盒可任选地包含说明书，用于根据本发明分离和/或检测蛋白质或肽。这些说明书还可包括说明如何使用试剂盒、如何制备样品、所用样品的类型、如何分析和解释结果。
在多个方面中，本发明提供了包含用于Western印迹分析的偶联的聚合物点的组合物和试剂盒。在其他方面中，这些组合物和试剂盒包含封闭剂。
在一些方面中，这些组合物或试剂盒包含改变试验性质的试剂。
在一些方面中，这些组合物或试剂盒包含封闭剂，其封闭Pdot和/或生物分子与样品中存在的除目标分子以外的组分的非特异性结合。
在某些方面中，本发明的组合物和试剂盒具有封闭剂，其能够改变偶联的聚合物点或未偶联的聚合物点的非特异性吸附性质。在其他方面中，该封闭剂与聚合物点竞争吸附表面或膜，或该封闭剂与聚合物点竞争结合一种或多种生物分子。
在一些方面中，这些组合物或试剂盒包含牛血清白蛋白(BSA)。
在某些方面中，本发明的组合物和试剂盒含有的聚合物点包含聚合物，该聚合物选自半导体聚合物、非半导体聚合物或其掺混物。
在一些方面中，这些组合物和试剂盒中的聚合物点的临界尺寸为小于30nm、小于25nm、小于20nm、小于15nm、小于10nm或小于5nm。
在一些方面中，这些组合物或试剂盒包含已经历中间官能化步骤(如羧化)的Pdot。
在某些方面中，本发明的试剂盒还提供用于偶联聚合物点与生物分子的试剂。
在一些方面中，这些组合物或试剂盒包含已与一种或多种生物分子偶联的Pdot，这些生物分子提供功能或其他益处，例如对目标分子的结合亲和力。
在一些方面中，本发明的组合物和试剂盒具有与聚合物点偶联的偶联生物分子。该偶联生物分子可以是蛋白质或其他合适的生物分子。在其他方面中，该生物分子可以是抗体或亲和素。
在一些方面中，这些组合物或试剂盒包含与特异性结合目标蛋白质的一抗偶联的Pdot。在一些方面中，该试剂盒包含与特异性结合目标一抗的二抗偶联的Pdot。在一些方面中，该试剂盒包含与特异性结合生物素和/或生物素化靶标的亲和素偶联的Pdot。在一些方面中，该试剂盒包含可与一种或多种改变Pdot的其他性质(例如其尺寸、荧光、疏水性、非特异性结合或吸收性质等)的分子偶联的Pdot。
在一些方面中，该组合物或试剂盒包含为终端用户配置以偶联Pdot与蛋白质或肽以用于进行试验的试剂。在一些方面中，该试剂盒包含Pdot(例如CN-PPV或BODIPY衍生物，如本发明和WO2013/101902所述)、生物分子(如链霉亲和素)、PEG和/或EDL。在其他方面中，该试剂盒包含其他Pdot、生物分子，以及为终端用户配置以偶联Pdot与蛋白质或肽以用于进行试验的试剂。
在多个方面中，本发明提供了包含用于Western印迹分析的偶联的聚合物点的组合物。在其他方面中，本发明提供了包含用于Western印迹分析的偶联的聚合物点和至少一种封闭剂的试剂盒。在其他方面中，本发明提供了进行Western印迹分析的试剂盒，该试剂盒包含聚合物点、偶联生物分子和封闭剂。
在其他方面中，本发明提供了进行蛋白质或肽分析的试剂盒，该试剂盒包含聚合物点、偶联生物分子和封闭剂。在一些方面中，聚合物点中包含的聚合物选自半导体聚合物、非半导体聚合物或其组合。在其他方面中，该聚合物点包含BODIPY衍生物。在其他方面中，该BODIPY衍生物具有式(I)的结构：
其中，R1、R2A、R2B、R3A、R4A和R4B各自独立地选自氢、烷基、芳烷基、芳基和烷氧基-芳基，且该BODIPY衍生物通过连接R1、R2A、R2B、R3A、R4A和R4B或其组合整合至发色聚合物中。在某些方面中，这些聚合物点包含由CN-PPV组成的聚合物。
在一些方面中，聚合物点中包含的聚合物选自：基于聚((甲基)丙烯酸)-的聚合物、基于聚二烯的聚合物、基于聚(环氧乙烷)的聚合物、基于聚异丁烯的聚合物、基于聚苯乙烯的聚合物、基于聚硅氧烷的聚合物、基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的聚合物、基于聚(2-乙烯基萘)的聚合物、基于聚(乙烯基吡啶)的聚合物、基于聚(碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的聚合物，或基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的聚合物。
在多个方面中，该聚合物点中包含的聚合物选自：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)、聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)、聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)、聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)、PDHF、PFO、PFPV、PFBT、PFTBT、MEH-PPV、CN-PPV、PPE，或其组合。
在一些方面中，该聚合物点由聚电解质包衣包围。在一些方面中，该聚电解质包衣包含选自下组的聚电解质：聚(苯乙烯磺酸酯/盐)、聚磷酸酯/盐、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯-共-马来酸酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖、多糖、聚赖氨酸、聚组氨酸和聚肽。在其他方面中，该聚电解质包衣包含聚电解质聚合物，该聚电解质聚合物的各重复单元包含选自下组的带电基团：羧基、磺酸酯/盐、磷酸酯/盐、氨基、羟基和巯基。
在一些方面中，这些聚合物点包含与聚合物点相连的官能团。在某些方面中，该官能团选自疏水性官能团、亲水性官能团或其组合。在多个方面中，该官能团适用于生物偶联。在一些方面中，该官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，或其组合。在一些方面中，偶联生物分子与聚合物点偶联。在其他方面中，该生物分子是蛋白质。在其他方面中，该生物分子是抗体或亲和素。
在一些方面中，该封闭剂改变偶联的聚合物点的非特异性吸附性质或该封闭剂改变聚合物点的非特异性吸附性质。在其他方面中，该封闭剂与聚合物点竞争吸附表面或膜。在其他方面中，该封闭剂与聚合物点竞争结合一种或多种生物分子。
在一些方面中，这些试剂盒还包含用于偶联聚合物点与生物分子的试剂。
在某些方面中，这些试剂盒包含膜，其选自硝酸纤维素或氟化聚合物膜。在其他方面中，该氟化聚合物是PVDF。
在一些方面中，这些试剂盒还包含PEG、EDL或其组合。
使用发色聚合物点进行分析的系统
在本发明的一些方面中，提供了使用聚合物点进行Western印迹分析的系统。在多个方面中，该系统可包含用于进行试验的与生物分子偶联的Pdot、凝胶、分离平台、电磁辐射源、检测器、包含储存装置以及储存可执行命令的计算机，这些命令在被处理器执行时导致处理器运行检测器以获取图像、储存图像并分析图像以检测和/或测定感兴趣的目标蛋白质或肽的浓度。在一些方面中，该分离平台包含凝胶电泳或毛细管电泳。在一些方面中，该系统还包含膜。在一些方面中，Pdot所发射信号的强度被用于检测蛋白质或肽和/或计算蛋白质或肽的浓度。
在一些方面中，该系统提供了凝胶和电泳平台，用于根据蛋白质质量或其他可被电泳分离的性质来分离蛋白质样品。该凝胶可包括由聚丙烯酰胺、硝酸纤维素、淀粉或其组合组成的凝胶。该凝胶还可包括由SDS、尿素、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、DMSO、乙二醛、羟基甲基汞或其组合组成的凝胶。该电泳平台容纳凝胶以及其中浸没凝胶的缓冲液。该电泳平台可由绝缘材料制得，例如非导电性塑料。该电泳平台可包括(或配置为连通)电流源以生成可用于驱动蛋白质通过凝胶基质的电动力，导致蛋白质根据蛋白质质量或其他可分离性质分离。
如本发明进一步描述的那样，由Pdot发射以检测蛋白质的信号可通过任何合适方式生成并分析。在一些方面中，该系统提供了膜，其上可设置与结合目标蛋白质的生物分子偶联的Pdot和蛋白质样品。该膜可包含由硝酸纤维素或氟化聚合物(如PVDF)组成的膜。
在一些方面中，该系统提供了一种电磁辐射源，其配置为结合目标蛋白质的Pdot的激发源。在一些方面中，该电磁辐射源包括激光。在一些方面中，激光发射的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约1000nm。在一些方面中，可以使用具有不同峰值波长的两种或更多种激光。
在一些方面中，该电磁辐射源包括发光二极管(LED)。LED是半导体光源。当LED的阴极电压比其阳极高至少LED的正向压降时，电流产生。电子能够与装置内的洞再结合，以光子的形式释放能量。光的颜色(对应于光子的能量)由半导体的能带隙决定。在一些方面中，LED发射的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约1000nm。在一些方面中，可以使用具有不同峰值波长的两种或更多种LED。
在一些方面中，电磁辐射源包括灯，例如汞灯、卤素灯、金属卤化物灯，或其他合适的灯。在一些方面中，通过滤光设备在光谱上过滤灯发射的光。在一些方面中，滤光设备包括滤光片，例如，仅允许落入特定范围内的光波长通过至含有Pdot的样品的带通滤光片。在一些方面中，该滤光设备包括多向色镜，其能够将光分离为不同的光谱组分，使得其仅允许落入特定范围内的光波长通过至含有Pdot的样品。
在一些方面中，通过滤光设备的最长波长小于300nm、小于400nm、小于500nm、小于600nm、小于700nm、小于800nm、小于900nm或小于1000nm。
在一些方面中，通过滤光设备的最短波长大于200nm、大于300nm、大于400nm、大于500nm、大于600nm、大于700nm、大于800nm或大于900nm。
本发明的系统还包括检测器和计算机，其配置为分析Pdot所发射的信号。该检测器可包括用于分析信号强度、信噪比和/或其他感兴趣的特性的检测器。本发明所述方法通常可与能够检测和分析光学信息(如图像)的任何已知系统相容。
在一些方面中，该系统提供了检测器，其检测与目标蛋白质连接的Pdot所发射的一种或多种信号。在一些方面中，该检测器是凝胶成像装置，如GETyphoonFLA9000凝胶成像扫描仪(GE医疗公司，新泽西州皮斯卡特维)。在一些方面中，该检测器包括显微镜，如落射荧光显微镜。在一些方面中，该检测器包括照相机，如电荷耦合装置(CCD)照相机，其可将信号整合至数字芯片上的图像中。
在一些方面中，该系统提供了包含储存有可执行命令的储存装置的计算机。在一些方面中，这些命令在被处理器执行时导致处理器运行检测器以获取图像、储存图像并分析图像以检测和/或测定感兴趣的目标蛋白质的浓度。
处理器的示例包括但不限于：储存检测器获得的信息的个人计算机装置，以及在处理信息的个人计算机装置上运行的软件。在其他方面中，信息处理器及其组件可包埋在检测器中，例如在包埋于相机中的芯片中，其永久或暂时储存相机获得的光学信息。在其他方面中，信息处理器和检测器可以是完全整合装置的组件，该装置获取和储存试验中Pdot所发射的信号(如光学信号)。
在一些方面中，该系统提供了计算机可读取储存介质，用于获取、储存和分析信号。该计算机可读取储存介质储存有命令，在被计算机的一个或多个处理器执行时，导致计算机：运行检测器以获取图像、储存图像并分析图像以检测和/或测定感兴趣的目标蛋白质的浓度。
在另一个方面中，提供了一种系统以分析Pdot发射的信号以检测蛋白质和/或计算蛋白质浓度。该系统包括一个或多个处理器，以及存储器设备，其包括可被一个或多个处理器执行的命令。当命令被一个或多个处理器执行时，该系统至少接收用户输入以分析信号。该系统可配置为携带本发明的方法的各方面，例如测量信号强度以测得蛋白质靶标的浓度。该系统还向用户提供数据。向用户提供的数据可包括一种或多种蛋白质的浓度。
在一些方面中，可使用计算机来进行本发明所述方法。在多个方面中，可使用计算机来实施上文所示和所述系统或方法中任一种。在一些方面中，计算机可包括处理器，其通过总线子系统与多个周边子系统通讯。这些周边子系统可包括储存子系统(包括存储器子系统和文件储存子系统)、用户界面输入装置、用户界面输出装置和网络界面子系统。
在一些方面中，总线子系统提供了以下机制，其旨在使计算机的多个组件和子系统彼此通讯。该总线子系统可包括单个总线或多个总线。
在一些方面中，网络界面子系统向其他计算机和网络提供界面。该网络界面子系统可用作从其他系统中接收数据并将数据从计算机传输至其他系统的界面。例如，网络界面子系统可使计算机连接因特网并促进使用因特网进行通讯。
在一些方面中，该计算机包含用户界面输入装置，如键盘、指向装置如鼠标、轨迹球、触摸屏，或绘图板、扫描器、条形码扫描器、与显示屏整合的触摸屏、音频输入装置如语音识别系统、麦克风，以及其他类型的输入装置。通常，术语“输入装置”旨在包括所有可能类型的用于向计算机输入信息的装置和机制。
在其他方面中，该计算机包含用户界面输出装置，如显示子系统、打印机、传真机或非视觉显示器如音频输出装置等。该显示子系统可以是阴极射线管(CRT)、平板装置如液晶显示器(LCD)，或投影装置。通常，术语“输出装置”旨在包括所有可能类型的用于从计算机输出信息的装置和机制。
在一些方面中，该计算机包括储存子系统，其提供计算机可读取储存介质以储存基础程序和数据构建。在一些方面中，该储存子系统储存软件(程序、代码模块、命令)，其在被处理器执行时提供本发明所述的方法和系统的功能。这些软件模块或命令可被一个或多个处理器执行。储存子系统还可提供储库以储存根据本发明使用的数据。该储存子系统可包括存储器子系统和文件/磁盘储存子系统。
在一些方面中，该计算机包括存储器子系统，其包括多个存储器，包括主要的随机存取存储器(RAM)用于储存程序执行期间的命令和数据，以及只读存储器(ROM)，其中储存固定的命令。文件储存子系统提供了程序和数据文件的非转移持续性(非易失性)储存，且可包括硬盘驱动器、软盘驱动器以及相关可移动介质、光盘只读存储器(CD-ROM)驱动器、光驱、可移动介质盒和其他类似储存介质。
该计算机可以是多种类型之一，包括个人计算机、便携式计算机、工作站、网络计算机、大型机、自助服务终端、服务器或任何其他数据处理系统。由于计算机和网络的常变本质，本发明所包含的计算机的描述仅旨在作为特定示例用于说明计算机的实施方式的目的。与本发明所述系统相比具有更多或更少组件的许多其他配置也是可用的。
在多个方面中，本发明提供了检测蛋白质或肽的系统，该系统包括：与生物分子偶联的聚合物点；蛋白质或肽分离平台；电磁辐射源；检测器；以及包含存储装置并储存可执行命令的计算机，这些命令在由处理器执行时导致处理器运行检测器以获取图像、储存图像并分析图像。
在一些方面中，蛋白质和肽分离平台包含凝胶分离平台或毛细管电泳分离平台。
在多个方面中，本发明提供了进行Western印迹分析的系统，该系统包括：与生物分子偶联的聚合物点；凝胶；电泳平台；电磁辐射源；检测器；以及包含存储装置并储存可执行命令的计算机，这些命令在由处理器执行时导致处理器运行检测器获取图像、储存图像并分析图像。
在某些方面中，该凝胶包含聚丙烯酰胺凝胶。在其他方面中，该膜包含硝酸纤维素或氟化聚合物。在其他方面中，该氟化聚合物是PVDF。
在一些方面中，该系统的电磁辐射源包括激光、灯、LED或其组合。在其他方面中，该系统还包括滤光片、多向色镜或其组合。在其他方面中，该检测器包含凝胶成像设备。在其他方面中，该检测器包含显微镜。在其他方面中，该检测器包含照相机。
本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请具体地和单独地通过引用纳入本文一样。
根据所需应用，本发明的设备、装置、系统及其组分中任一种的特定尺寸可容易地变化，这对于阅读本发明的本领域技术人员而言显而易见。此外，应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和范围以及所附权利要求书的范围内。本发明公开的实施方式的多种不同组合是可能的，且这类组合被考虑为本发明的一部分。此外，与本发明任意实施方式联合讨论的所有特征都可容易地适用于本发明的其他实施方式。不同实施方式中针对类似特征使用的不同术语或附图标记不必然暗示差异，除非另有说明。因此，本发明旨在经由所附权利要求描述，而不限于本发明公开的实施方式。
除非另有说明，本发明所述方法和过程可以任何顺序进行。例如，描述步骤(a)、(b)和(c)的方法可首先进行步骤(a)，随后步骤(b)，随后步骤(c)。或者，可以不同的顺序进行该方法，例如，首先进行步骤(b)，随后步骤(c)，随后步骤(a)。此外，那些步骤可以同时或分开进行，除非另有明确说明。
虽然已显示和描述了本发明的优选方面，但应理解，本发明不限于本发明所述特定方面，可对特定方面做出修改并仍落入所附权利要求的范围中。也应理解，此处使用的术语是为描述具体方面，而不是起限制作用。本发明的范围由所附权利要求限定。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。
应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、以下限单位的十分之一为间隔的各间插数值，以及所述范围的任何其它指出或间插数值均包括在本发明范围内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，除非明确地排除所述范围的上下限。所述范围包含一个或两个限值时，排除这一个或两个限值以外的范围也包括在本发明范围内。
示例性方面
实施例1
基于荧光聚合物点的报道物的性质
在该实施例中，使用新的发橙色光的聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)](CN-PPV)聚合物(Ye,F.等，Chem.Comm.,2012,48,1778)制备的Pdot-链霉亲和素偶联物被用于观察使用生物素偶联抗体标记的蛋白质。实现了低皮克(low-picogram)检测灵敏度。来自与蛋白质结合的Pdot的荧光信号在连续图像中维持相同，甚至在印迹过程后两周还是如此。
为制备CN-PPVPdot，将CN-PPV(来自ADS染料公司(ADSDyesInc.))和聚(苯乙烯-共-马来酸酐)(PSMA，来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))各自溶解在四氢呋喃(THF)中以形成1mg/mL储液(1000ppm)。通过将125μL的CN-PPV储液和25μL的PSMA储液置于5mL的THF等分试样中来稀释这些储液。在浴槽式超声器中将该混合物超声并快速注射至10mL水中，之后在加热状态下在缓慢的氮流下除去THF。该纳米沉淀过程导致形成Pdot。在加热状态下在氮流下进一步浓缩10mLPdot溶液以形成浓度为50ppm的5mL最终Pdot溶液。在进一步使用前，使该Pdot溶液通过0.2μm乙酸纤维素滤器以除去溶液中的任何大聚集物。
为偶联Pdot与链霉亲和素，向该5mL的Pdot溶液中添加100μL的PEG(5％w/v在水中，MW3350)、100μL的1MHEPES缓冲液(pH7.4)、300μL的链霉亲和素(1mg/mL在20mMHEPES缓冲液中)以及50μL的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，来自西格玛-奥德里奇公司)(10mg/mL在水中)。在涡旋振荡器上混合溶液并进一步在室温下搅拌四小时，随后添加水中1％w/v牛血清白蛋白(BSA，来自西格玛-奥德里奇公司)的100μL等分试样。再搅拌20分钟后，添加蔗糖(10％w/v)并通过离心过滤(滤器MWCO100,000)将溶液浓缩至0.5mL体积。最后，使浓缩的溶液通过丙烯葡聚糖HR-300凝胶柱来纯化Pdot-链霉亲和素偶联物，该柱使用pH7.4的0.1％PEG(w/v)和20mMHEPES平衡。最终的Pdot-链霉亲和素溶液的聚合物浓度为400ppm，其通过其UV-可见光吸收光谱测定。
图1A显示CN-PPV聚合物的结构以及CN-PPVPdot和CN-PPV-链霉亲和素Pdot生物偶联物的光学性质。CN-PPVPdot的量子产率高达60％且吸收横截面积为约2.3×10-13cm2(对于10nm直径Pdot而言)。其荧光寿命为1.5ns。发射峰位于595nm处，与其发蓝光类似物相比提供了较低的自发荧光背景。
图1C显示CN-PPVPdot和CN-PPV-链霉亲和素Pdot的代表性透射电子显微镜(TEM)图像。图1D显示通过动态光散射(DLS)测量的尺寸，显示与链霉亲和素生物偶联后直径的约2nm增加。基于PSMA与链霉亲和素的比例(摩尔浓度1:20)和Pdot的尺寸，估计每10nm直径Pdot约5-10个链霉亲和素分子。作为比较，使用Qdot605-链霉亲和素(直径为约15nm；量子产率＝30％)。其发射非常接近CN-PPVPdot且其吸收横截面积为约2.3×10-15cm2，其可以在473nm处被有效激发，该波长是荧光扫描仪使用的激发波长(图1B)。
实施例2
使用荧光聚合物点检测一抗
该实施例描述使用CN-PPVPdot偶联物检测山羊抗小鼠(GAM)IgG。将蛋白质以点印迹的形式直接沉积在聚偏二氟乙烯膜(PVDF，来自飞世尔科技公司(FisherScientific))允许方便的定量蛋白质检测测试，其绕过将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至膜上相关的不确定性。点印迹用于阐明探针化蛋白质的检测下限。
为进一步最小化抗体-蛋白质结合常数相关的不确定性，使用Qdot605-链霉亲和素或CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物观察生物素化山羊抗小鼠(GAM)IgG(来自白乐津公司(Biolegend))点印迹。为进行该比较，将TTBS缓冲液(20mMTris，500mMNaCl，pH7.4，0.05％吐温-20)中生物素化GAMIgG稀释至所需浓度并将该溶液的2-μL液滴沉积在干燥的PVDF膜上。使印迹空气干燥1.5小时，之后通过将膜浸没在甲醇中一分钟使其激活，冲洗并在水中以及随后在TTBS缓冲液中恒速振荡清洗，各两分钟。随后使用3％BSATTBS(w/v)封闭膜以防止非特异性结合，使用恒速振荡在室温下封闭一小时，并使用TTBS对PVDF膜清洗2分钟，最后使用3％BSATTBS中的1nMCN-PPVPdot-链霉亲和素溶液孵育。孵育后，在成像前将印迹在TTBS中清洗六次(每次5分钟)。在GETyphoonFLA9000凝胶成像扫描仪(GE医疗公司(GEHealthcare)，新泽西州皮斯卡特维)上TTBS中对点印迹进行成像，其中使用473nm波长的激光进行激发并使用575-nm长通滤片进行发射获取。用于该实验的Qdot和Pdot浓度都是1nM。
图2A显示与Qdot605-链霉亲和素孵育的不同浓度下GAMIgG-生物素的点印迹图像。图2C以GAMIgG量的函数形式显示其相应强度。图2C和2D中y轴显示的强度代表经标准化的背景扣除后强度。可以看到，使用Qdot605-链霉亲和素作为荧光探针时，检测到25皮克GAMIgG/2μL液滴的较低限值。图2B显示与CN-PPV-链霉亲和素偶联物孵育的不同浓度下GAMIgG-生物素的点印迹图像。其相应强度是GAMIgG量的函数，如图2D所示。可以看到，使用Pdot-链霉亲和素偶联物时，检测限值显著降低至1.6皮克/2μL液滴。因此，Pdot-链霉亲和素偶联物的检测限值比Qdot-链霉亲和素偶联物高一个数量级。应注意，进行了不添加GAMIgG的对照实验以确认Qdot/Pdot和PVDF膜之间不存在任何明显的非特异性结合。可使用多种表面修饰(例如使用聚合物点上PEG的表面修饰)和/或使用能够降低非特异性结合的特定尺寸的聚合物点来调节聚合物点的非特异性结合。
实施例3
使用荧光聚合物点检测目标蛋白质
该实施例描述使用荧光标记的CN-PPVPdot偶联物检测转铁蛋白和胰蛋白酶抑制剂。随后，使用Pdot-链霉亲和素偶联物来检测蛋白质(在其一抗存在的情况下)。本文中，选择转铁蛋白和胰蛋白酶抑制剂(都来自英杰公司)及其相应生物素化抗体。这些蛋白质在TTBS缓冲液中被稀释至所需浓度并将各溶液的2-μL液滴沉积在干燥的PVDF膜上。使印迹空气干燥1.5小时，其他步骤与实施例1和2中所述点印迹实验相同。具体而言，将膜激活、清洗、封闭并随后与生物素化的一抗(TTBS中1:1000稀释)在室温下孵育一小时，随后使用TTBS清洗五次(每次5分钟)。随后将蛋白质印迹与CN-PPV-链霉亲和素Pdot溶液(3％BSATTBS中1nM)孵育并将膜在TTBS清洗六次(每次5分钟)，随后进行成像。使用不同浓度的转铁蛋白和胰蛋白酶抑制剂。对两种蛋白质进行不具有一抗的对照实验以确定蛋白质和Pdot-链霉亲和素之间是否存在非特异性结合(图3A和3B)。结果显示，使用高达400皮克/2-μL液滴的蛋白质浓度也未从点印迹中检测到任何荧光。
图3C显示使用生物素化的一抗和Pdot链霉亲和素的转铁蛋白点印迹的图像。图3E显示作为转铁蛋白量函数的相应经标准化背景扣除后强度。发现了强度和转铁蛋白量之间的线性依赖性(R2＝0.9915)。在相应一抗存在的情况下，针对转铁蛋白获得了6.3皮克/2-μL液滴的检测限值。
图3D显示使用生物素化的一抗和Pdot链霉亲和素的胰蛋白酶抑制剂点印迹的图像。图3F显示作为胰蛋白酶抑制剂的函数的相应经标准化背景扣除后强度。同样发现了强度和胰蛋白酶抑制剂量之间的线性依赖性(R2＝0.9889)。在相应抗体存在的情况下，针对胰蛋白酶抑制剂获得了25皮克/2-μL液滴的检测限值。不受任何具体理论的限制，认为检测限值可在这两种蛋白质之间具有差异，原因在于蛋白质及其相应抗体之间或相应抗体与Pdot偶联物之间的不同结合效力。每个抗体单元的生物素分子数目的变化也会导致检测限值的差异。
实施例4
基于荧光聚合物点的蛋白质检测的长期光稳定性
该实施例描述了对CN-PPVPdot偶联物随时间变化的光稳定性的评估。为显示使用CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物时对印迹重复成像而不丧失灵敏度的能力，在标记步骤后将生物素化的GAMIgG和转铁蛋白点印迹在TTBS缓冲液中6℃下储存多达14天。GAMIgG的检测限值(1.6皮克)和GAMIgG量与强度之间的线性度(R2＝0.9819)维持与刚刚标记后相同，只是信号变化轻微增加(图4A)。同样地，发现转铁蛋白印迹的检测限值(6.3皮克)和蛋白质量与强度之间的线性度(R2＝0.9946)在6℃下储存14天后与刚刚标记后相同(图4B)。
实施例5
使用荧光聚合物点的Western印迹分析
该实施例描述了在Western印迹应用中使用Pdot-偶联物用于蛋白质观察。进行完整的Western印迹过程并使用CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物观察印迹。本发明中，在拉姆力(Laemmli)缓冲液(20％甘油、2.1％SDS、0.125MTrispH6.8、0.73M2-巯基乙醇、溴酚蓝)中将蛋白质稀释至适当所需浓度，随后将溶液在95-100℃水浴中加热5分钟，冷却至室温并加载至SDS-PAGE凝胶上(10％丙烯酰胺用于转铁蛋白，15％丙烯酰胺用于胰蛋白酶抑制剂，外加使用溴酚蓝堆叠8％丙烯酰胺)。添加FermentasPageRuler前染蛋白梯度(10–170kDa)作为参考。在200V下进行约一小时电泳(直至染料前沿跑出凝胶)，并在6℃下100V反应1小时以将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜。使用TTBS对PVDF膜清洗两次(每次5分钟)，随后以与上述部分中所述相同的方式对膜进行封闭和孵育。Pdot-链霉亲和素偶联物的浓度是1nM。
图5A和5B显示SDS-PAGE分离、转移至PVDF膜、封闭和与相应生物素化抗体和CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物孵育的完整Western印迹过程后转铁蛋白和胰蛋白酶抑制剂的图像。图5C和5D分别显示作为转铁蛋白和胰蛋白酶抑制剂量的函数形式的经标准化背景扣除后强度。对于转铁蛋白和胰蛋白酶抑制剂，最低检测限值都是50皮克。相对于点印迹(图3)检测限值的提高反映了从SDS-PAGE凝胶转移至PVDF膜过程中一些蛋白质的损失。然而，其表明Pdot可与整个Western印迹过程相容并可用于使用高检测灵敏度分析样品。
低皮克含量的蛋白质使用直接过程检测，其与使用传统荧光探针的过程相比无需任何额外设备或时间。由于可以例如精细调节Pdot发射性质，该方法可容易地扩展用于多重检测并广泛应用于蛋白质分析。
虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和取代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。下列权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。

Claims (67)

1.一种进行Western印迹分析的方法，所述方法包括：
使用凝胶分离蛋白质；
将分离的蛋白质转移至膜；
使具有所述分离的蛋白质的所述膜与包含聚合物点的溶液接触，所述聚合物点与特异性针对至少一些所述分离的蛋白质的生物分子偶联；以及
检测来自所述聚合物点的至少一种信号，所述至少一种信号对应于所述分离的蛋白质。
2.一种检测蛋白质或肽的方法，所述方法包括：
从混合物中分离所述蛋白质或肽；
使分离的蛋白质或肽与包含聚合物点的溶液接触，所述聚合物点与特异性针对至少一些所述分离的蛋白质或肽的生物分子偶联；以及
检测来自所述聚合物点的至少一种信号，所述至少一种信号对应于所述分离的蛋白质或肽。
3.如权利要求2所述的方法，还包括定量所述蛋白质或肽。
4.如权利要求2或3所述的方法，分离所述蛋白质或肽包括色谱法、过滤法、毛细管电泳法、凝胶电泳法、液相萃取法、沉淀法、免疫沉淀法或其组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，所述聚合物点包含选自下组的聚合物：半导体聚合物、非半导体聚合物或其组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，所述聚合物点包含BODIPY衍生物。
7.如权利要求6所述的方法，所述BODIPY衍生物具有式(I)的结构：
其中，R1、R2A、R2B、R3A、R4A和R4B各自独立地选自氢、烷基、芳烷基、芳基和烷氧基-芳基，且所述BODIPY衍生物通过连接R1、R2A、R2B、R3A、R4A和R4B或其组合整合至发色聚合物中。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，所述聚合物点中包含的聚合物选自：基于聚((甲基)丙烯酸)-的聚合物、基于聚二烯的聚合物、基于聚(环氧乙烷)的聚合物、基于聚异丁烯的聚合物、基于聚苯乙烯的聚合物、基于聚硅氧烷的聚合物、基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的聚合物、基于聚(2-乙烯基萘)的聚合物、基于聚(乙烯基吡啶)的聚合物、基于聚(碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的聚合物，或基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的聚合物。
9.如权利要求1-5中任一项所述的方法，所述聚合物点中的所述聚合物选自：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)、聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)、聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)、聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)、PDHF、PFO、PFPV、PFBT、PFTBT、MEH-PPV、CN-PPV、PPE，或其组合。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，所述聚合物点由聚电解质包衣包围。
11.如权利要求10所述的方法，所述聚电解质包衣包含选自下组的聚电解质：聚(苯乙烯磺酸酯/盐)、聚磷酸酯/盐、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯-共-马来酸酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖、多糖、聚赖氨酸、聚组氨酸和聚肽。
12.如权利要求10所述的方法，所述聚电解质包衣包含聚电解质聚合物，所述聚电解质聚合物的各重复单元包含选自下组的带电基团：羧基、磺酸酯/盐、磷酸酯/盐、氨基、羟基和巯基。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，所述聚合物点包含连接所述聚合物点的官能团。
14.如权利要求13所述的方法，所述官能团选自疏水性官能团、亲水性官能团或其组合。
15.如权利要求13-14中任一项所述的方法，所述官能团适用于生物偶联。
16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，所述官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，或其组合。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，所述生物分子是蛋白质。
18.如权利要求17所述的方法，所述生物分子是抗体或亲和素。
19.如权利要求1和3-18中任一项所述的方法，所述凝胶包含聚丙烯酰胺、琼脂糖、淀粉或其组合。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，所述分离包含SDS-PAGE分离。
21.如权利要求1所述的方法，所述膜包含硝酸纤维素或氟化聚合物膜。
22.如权利要求21所述的方法，所述氟化聚合物是PVDF。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，所述检测包括检测皮克量的分离的蛋白质。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，所述检测包括检测小于2皮克的分离的蛋白质。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，还包括使用电磁辐射源激发所述聚合物点。
26.如权利要求25所述的方法，所述电磁辐射源包括激光、灯、LED或其组合。
27.如权利要求25-26中任一项所述的方法，所述电磁辐射在激发聚合物点前通过滤光片、多向色镜或其组合。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中，激发所述样品的电磁辐射的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约1000nm。
29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中，电磁辐射的两个或多个峰值波长激发所述样品。
30.用于Western印迹分析的包含偶联的聚合物点的组合物。
31.一种包含权利要求30所述的组合物的试剂盒。
32.一种试剂盒，其包含用于Western印迹分析的偶联的聚合物点和至少一种封闭剂。
33.一种用于进行Western印迹分析的试剂盒，所述试剂盒包含聚合物点、偶联生物分子和封闭剂。
34.如权利要求31-33中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点包含选自下组的聚合物：半导体聚合物、非半导体聚合物或其组合。
35.如权利要求31-34中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点包含BODIPY衍生物。
36.如权利要求35所述的试剂盒，所述BODIPY衍生物具有式(I)的结构：
其中，R1、R2A、R2B、R3A、R4A和R4B各自独立地选自氢、烷基、芳烷基、芳基和烷氧基-芳基，且所述BODIPY衍生物通过连接R1、R2A、R2B、R3A、R4A和R4B或其组合整合至发色聚合物中。
37.如权利要求31-34中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点包含由CN-PPV组成的聚合物。
38.如权利要求31-34中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点中包含的聚合物选自：基于聚((甲基)丙烯酸)-的聚合物、基于聚二烯的聚合物、基于聚(环氧乙烷)的聚合物、基于聚异丁烯的聚合物、基于聚苯乙烯的聚合物、基于聚硅氧烷的聚合物、基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的聚合物、基于聚(2-乙烯基萘)的聚合物、基于聚(乙烯基吡啶)的聚合物、基于聚(碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的聚合物，或基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的聚合物。
39.如权利要求31-38中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点中的聚合物选自：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)、聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)、聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)、聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)、PDHF、PFO、PFPV、PFBT、PFTBT、MEH-PPV、CN-PPV、PPE，或其组合。
40.如权利要求31-39中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点由聚电解质包衣包围。
41.如权利要求40所述的试剂盒，所述聚电解质包衣包含选自下组的聚电解质：聚(苯乙烯磺酸酯/盐)、聚磷酸酯/盐、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯-共-马来酸酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖、多糖、聚赖氨酸、聚组氨酸和聚肽。
42.如权利要求40所述的试剂盒，所述聚电解质包衣包含聚电解质聚合物，所述聚电解质聚合物的各重复单元包含选自下组的带电基团：羧基、磺酸酯/盐、磷酸酯/盐、氨基、羟基和巯基。
43.如权利要求31-42中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点包含连接所述聚合物点的官能团。
44.如权利要求43所述的试剂盒，所述官能团选自疏水性官能团、亲水性官能团或其组合。
45.如权利要求43-44中任一项所述的试剂盒，所述官能团适用于生物偶联。
46.如权利要求43-45中任一项所述的试剂盒，所述官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，或其组合。
47.如权利要求33-46中任一项所述的试剂盒，所述偶联生物分子偶联所述聚合物点。
48.如权利要求31-47中任一项所述的试剂盒，所述生物分子是蛋白质。
49.如权利要求48所述的试剂盒，所述生物分子是抗体或亲和素。
50.如权利要求31-49中任一项所述的试剂盒，所述封闭剂改变所述偶联的聚合物点的非特异性吸附性质或所述封闭剂改变所述聚合物点的非特异性吸附性质。
51.如权利要求31-50中任一项所述的试剂盒，所述封闭剂与所述聚合物点竞争吸附表面或膜。
52.如权利要求31-51中任一项所述的试剂盒，所述封闭剂与所述聚合物点竞争结合一种或多种生物分子。
53.如权利要求33-52中任一项所述的试剂盒，还包含用于偶联所述聚合物点与所述生物分子的试剂。
54.如权利要求31-53中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含的膜选自硝酸纤维素或氟化聚合物膜。
55.如权利要求54所述的试剂盒，所述氟化聚合物是PVDF。
56.如权利要求31-55中任一项所述的试剂盒，还包含PEG、EDL或其组合。
57.一种测定蛋白质或肽的系统，所述系统包含：
与生物分子偶联的聚合物点；
蛋白质或肽分离平台；
电磁辐射源；
检测器；以及
计算机，所述计算机包含储存有可执行命令的储存装置，所述命令在由处理器执行时导致所述处理器：
运行所述检测器以获取图像，
储存所述图像，以及
分析所述图像。
58.如权利要求57所述的系统，所述蛋白质或肽分离平台包含凝胶分离平台或毛细管电泳分离平台。
59.一种进行Western印迹分析的系统，所述系统包括：
与生物分子偶联的聚合物点；
凝胶；
电泳平台；
电磁辐射源；
检测器；以及
计算机，所述计算机包含储存有可执行命令的储存装置，所述命令在由处理器执行时导致所述处理器：
运行所述检测器以获取图像，
储存所述图像，以及
分析所述图像。
60.如权利要求59所述的系统，所述凝胶包含聚丙烯酰胺凝胶。
61.如权利要求57-58中任一项所述的系统，所述膜包含硝酸纤维素或氟化聚合物。
62.如权利要求61所述的系统，所述氟化聚合物是PVDF。
63.如权利要求57-62中任一项所述的系统，所述电磁辐射源包括激光、灯、LED或其组合。
64.如权利要求57-63中任一项所述的系统，还包含滤光片、多向色镜或其组合。
65.如权利要求57-64中任一项所述的系统，所述检测器包含凝胶成像设备。
66.如权利要求65-65中任一项所述的系统，所述检测器包含显微镜。
67.如权利要求57-66中任一项所述的系统，所述检测器包含照相机。
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