CN105259343A - 一种从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法 - Google Patents
一种从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其将磁珠和小分子半抗原按一定比例在反应体系下充分混合，并加入一定量的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，在适宜的温度下搅拌，进行偶联反应，制备偶联小分子半抗原的磁珠，然后以此偶联有小分子半抗原的磁珠从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体。本发明以磁珠为载体和小分子半抗原偶联，在单链抗体库中筛选抗小分子半抗原的单链抗体。通过上述方法筛选单链抗体，所需时间约14天，得到的单链抗体与小分子半抗原的亲和力高。
Description
技术领域
本发明属于抗体的制备技术领域，涉及从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法。
背景技术
近年来，食品安全已经成为严重影响人类健康，并引起全社会关注的问题。纵观近十年来的食品安全事件，生物性和化学性食源性疾病危害仍是影响食品安全的主要因素。其中，如农兽药残留、非法添加剂、抗生素、真菌毒素等小分子物质带来的危害已成为国内乃至国际社会优先关注和亟待解决的问题。免疫检测法因其操作简便、快速、特异、灵敏，而且样品前处理过程大为简化，可以满足对食品现场检测快速、简便的要求，已经成为研究的热点。免疫学方法中利用噬菌体抗体库技术制备危害食品安全的小分子半抗原的基因工程抗体的技术，因其具备简单快速、特异性强、预处理简单等优点，越来越广泛地被应用到食品安全的检测中。
传统的抗小分子半抗原单链抗体筛选是将小分子半抗原与某载体蛋白偶联形成一个新的完全抗原，再包埋于96孔板，然后加入待筛选抗体库进行筛选。其缺点首先在于筛选速度较慢，效率低；其次是筛选所得单链抗体与完全抗原的亲和力高而与小分子半抗原的亲和力低。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种工艺简易、操作方便且能快速、有效从噬菌体单链抗体库中筛选抗小分子半抗原的单链抗体(scFv)方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其特征在于：将磁珠和小分子半抗原按一定比例在反应体系下充分混合，并加入一定量的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，在适宜的温度下搅拌，进行偶联反应，制备偶联小分子半抗原的磁珠，然后以此偶联有小分子半抗原的磁珠从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体。
作为本发明所述的从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法的一种优选方案，其中：所述磁珠和小分子半抗原按一定比例在反应体系下充分混合，其中，磁珠和小分子半抗原的质量比为1∶20～1∶30。
作为本发明所述的从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法的一种优选方案，其中：所述磁珠是表面带有氨基或羧基的磁珠。
作为本发明所述的从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法的一种优选方案，其中：所述小分子半抗原是游离羧基或氨基的小分子半抗原。
作为本发明所述的从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法的一种优选方案，其中：所述加入一定量的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，其中，磁珠和乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的质量比为1∶30。
作为本发明所述的从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法的一种优选方案，其中：所述适宜的温度为25℃。
作为本发明所述的从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法的一种优选方案，其中：所述反应体系为水，反应体系pH为4.0。
作为本发明所述的从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法的一种优选方案，其中：所述进行偶联反应，其是在轻微振动下反应2h。
本发明的有益效果：本发明利用磁珠(magneticbeads)直接偶联小分子半抗原，从噬菌体单链抗体库中筛选抗小分子半抗原的单链抗体(scFv)，克服了传统筛选中小分子半抗原偶联载体蛋白形成完全抗原筛选scFv，导致scFv与小分子半抗原结合活性低的缺点。
附图说明
图1为本发明实施例1中MC-LR与beads偶联结果示意图；
图2为本发明实施例1中菌液PCR图；
图3为本发明实施例1中竞争ELISA结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
取0.033mgNH2-beads置于1.5ml离心管中，以1MNaCl洗2次，加入500ul含0.6mg藻毒素MC-LR(微囊藻毒素Microcystins-LR，MC-LR)的水溶液，调pH至4.0。10mgEDC溶于100ul水中，立刻加入上述离心管中，并调整反应液至1ml，pH至4.0。25℃，轻微振动下反应2h。移出beads，以1MNaCl洗2次。
将1010的噬菌体和偶联有40ugMC-LR的beads悬浮于1mlMPBS(pH7.4，含1％脱脂乳)中，室温下，150rpm，反应2h。移出beads，以PBST(pH7.4，含0.1％tween-20)洗6次，再以PBS(pH7.4)洗6次(在每一次beads的清洗中，均先清洗beads1min，再用磁力架磁力吸附沉降beads1min，然后进行下一次清洗，以下同)。
Beads悬浮于400ulPBS，加入400ul胰蛋白酶溶液(使终浓度为1mg/m1)，室温下反应30min，磁力吸附沉降beads1min，移出上清，保存于4℃。将400ul上清加入1.6mlE.coliTG1(OD600＝0.4)，37℃水浴静置30min。取100ulE.coliTG1菌液，10倍梯度稀释4次，分别涂布于TYE培养基平板(含100ug/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃培养过夜，计数。剩余E.coliTG1菌液11600rpm，离心5min，弃上清，沉淀以100ul2×TY培养基重悬，涂布于TYE培养基平板(含100ug/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃培养过夜，计数。
在过夜培养的培养平板上挑单菌落保存于-70℃，剩余菌落以2ml含15％甘油的2×TY培养基刮下，混匀，保存于-70℃。将500ul刮下菌液加入50ml2×TY培养基(含100ug/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.4，取10ml菌液加入1011辅助噬菌体KM13，剩余菌液继续振荡培养2h，10800g离心10min，重悬于5ml含15％甘油的2×TY培养基中，保存于-70℃。
上述加有KM13的菌液，37℃水浴静置30min，3000g离心10min，沉淀用50ml2×TY培养基(含100ug/ml氨苄青霉素，50ug/ml卡那霉素和1％葡萄糖)重悬，30℃，200rpm振荡培养过夜。过夜培养菌液3300g离心15min，上清加入15mlPEG/NaCl(20％聚乙二醇6000，2.5MNaCl)，混匀，冰浴1h。3300g离心30min，倒掉PEG/NaCl，快速离心，吸除残余的PEG/NaCl。沉淀以2mlPBS重悬，11600g离心10min，去除细胞残片，沉淀以含15％甘油的PBS重悬，保存于-70℃。
以上步骤重复2轮。
挑最后一轮筛选所得菌落，加入5ml2×TY-A(含100ug/ml氨苄青霉素)培养基中，200rpm，37℃，培养过夜。取过夜菌液2ul，稀释于20ulddH2O中，混合均匀，取2ul为模板，引物为LMB：CAGGAAACAGCTATGAC和pHEN：CTATGCGGCCCCATTCA作菌液PCR。PCR条件：94℃变性5min，进入30个PCR循环，94℃变性1min，55℃回火1min，72℃延伸1min，然后72℃再延伸10min。
将beads的氨基和MC-LR的羧基偶联，然后从TomlinsonI+J噬菌体单链抗体库中筛选抗MC-LR的单链抗体。经过3轮筛选，各轮拯救率逐轮提高，结果如表1所示。
表13轮筛选拯救率
(拯救率为每轮筛选后噬菌体滴度与筛选初始加入噬菌体滴度之比)
在多克隆ELISA中，用MC-LR-beads进行筛选的抗体的信号随着筛选逐渐上升，可以认为那些能识别MC-LR的克隆在筛选过程中富集，所占的比例逐轮上升；而空白的信号值一直较低。
从每轮的滴度计数平板中，随机挑取40个克隆做单克隆ELISA，以检查筛选过程中阳性克隆的富集情况。当实验组的信号是空白信号的3倍时，认为其中有足够量的抗体能识别MC-LR，记为阳性。各轮筛选后噬菌体的阳性率如表2所示。
表2各轮筛选后噬菌体的阳性率
如图1和图2所示，在这一实施例中，要确保beads的氨基被MC-LR的羧基饱和，有必要试验确定MC-LR与beads偶联的最佳比例。以反应前加入的MC-LR的量为横坐标，beads分离后溶液中残留的MC-LR的量为纵坐标。由图1可见，在MC-LR加入量小于0.6mg时，随着MC-LR加入量的提高，其与beads偶联后溶液中MC-LR的残留量变化很小，当MC-LR加入量大于0.6mg时，随着MC-LR加入量的提高，其与beads偶联后溶液中MC-LR的残留量变化也随之显著提高。由此可知，MC-LR加入量在0.6mg左右时，体系中的beads基本被MC-LR所饱和。
经菌液PCR验证为阳性克隆的菌株，加入辅助噬菌体KM13挽救(方法同上述筛选步骤所述)。用PEG沉淀下来的噬菌体作单克隆噬菌体elisa。单克隆ELISA试验中，ELISA信号大小不一，挑取ELISA信号大于2.5的10株克隆做菌液PCR，结果如图2所示。10株克隆中有7株(A1、A5、B1、B5、C5、D5、E1)处于目标区间。
以竞争ELISA分析克隆对MC-LR的亲和力，如图3所示与MC-LR的结合活性最好的克隆IC50为0.6ng/ml。
实施例2
取0.033mgNH2-beads置于1.5ml离心管中，以1MNaCl洗2次，加入500ul含1.0mg环丙沙星的水溶液，调pH至4.0。10mgEDC溶于100ul水中，立刻加入上述离心管中，并调整反应液至1ml，pH至4.0。25℃，轻微振动下反应2h。移出beads，以1MNaCl洗2次。
将1010的噬菌体和偶联有40ug环丙沙星的beads悬浮于1mlMPBS(pH7.4，含1％脱脂乳)中，室温下，150rpm，反应2h。移出beads，以PBST(pH7.4，含0.1％tween-20)洗6次，再以PBS(pH7.4)洗6次(在每一次beads的清洗中，均先清洗beads1min，再用磁力架磁力吸附沉降beads1min，然后进行下一次清洗，以下同)。
Beads悬浮于400ulPBS，加入400ul胰蛋白酶溶液(使终浓度为1mg/ml)，室温下反应30min，磁力吸附沉降beads1min，移出上清，保存于4℃。将400ul上清加入1.6mlE.coliTG1(OD600＝0.4)，37℃水浴静置30min。取100ulE.cohTG1菌液，10倍梯度稀释4次，分别涂布于TYE培养基平板(含100ug/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃培养过夜，计数。剩余E.coliTG1菌液11600rpm，离心5min，弃上清，沉淀以100ul2×TY培养基重悬，涂布于TYE培养基平板(含100ug/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃培养过夜，计数。
在过夜培养的培养平板上挑单菌落保存于-70℃，剩余菌落以2ml含15％甘油的2×TY培养基刮下，混匀，保存于-70℃。将500ul刮下菌液加入50ml2×TY培养基(含100ug/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.4，取10ml菌液加入1011辅助噬菌体KM13，剩余菌液继续振荡培养2h，10800g离心10min，重悬于5ml含15％甘油的2×TY培养基中，保存于-70℃。
上述加有KM13的菌液，37℃水浴静置30min，3000g离心10min，沉淀用50ml2×TY培养基(含100ug/ml氨苄青霉素，50ug/ml卡那霉素和1％葡萄糖)重悬，30℃，200rpm振荡培养过夜。过夜培养菌液3300g离心15min，上清加入15mlPEG/NaCl(20％聚乙二醇6000，2.5MNaCl)，混匀，冰浴1h。3300g离心30min，倒掉PEG/NaCl，快速离心，吸除残余的PEG/NaCl。沉淀以2mlPBS重悬，11600g离心10min，去除细胞残片，沉淀以含15％甘油的PBS重悬，保存于-70℃。
以上步骤重复2轮。
挑最后一轮筛选所得菌落，加入5ml2×TY-A(含100ug/ml氨苄青霉素)培养基中，200rpm，37℃，培养过夜。取过夜菌液2ul，稀释于20ulddH2O中，混合均匀，取2ul为模板，引物为LMB：CAGGAAACAGCTATGAC和pHEN：CTATGCGGCCCCATTCA作菌液PCR。PCR条件：94℃变性5min，进入30个PCR循环，94℃变性1min，55℃回火1min，72℃延伸1min，然后72℃再延伸10min。
经菌液PCR验证为阳性克隆的菌株，加入辅助噬菌体KM13挽救(方法同上述筛选步骤所述)。用PEG沉淀下来的噬菌体作单克隆噬菌体elisa。
以竞争ELISA分析克隆对环丙沙星的亲和力，结果亲和力最高的克隆IC50为1.7ng/ml。
实施例3
取0.033mgNH2-beads置于1.5ml离心管中，以1MNaCl洗2次，加入500ul含1.0mg盐酸克伦特罗的水溶液，调pH至4.0。10mgEDC溶于100ul水中，立刻加入上述离心管中，并调整反应液至1ml，pH至4.0。25℃，轻微振动下反应2h。移出beads，以1MNaCl洗2次。
将1010的噬菌体和偶联有40ug盐酸克伦特罗的beads悬浮于1mlMPBS(pH7.4，含1％脱脂乳)中，室温下，150rpm，反应2h。移出beads，以PBST(pH7.4，含0.1％tween-20)洗6次，再以PBS(pH7.4)洗6次(在每一次beads的清洗中，均先清洗beads1min，再用磁力架磁力吸附沉降beads1min，然后进行下一次清洗，以下同)。
Beads悬浮于400ulPBS，加入400ul胰蛋白酶溶液(使终浓度为1mg/ml)，室温下反应30min，磁力吸附沉降beads1min，移出上清，保存于4℃。将400ul上清加入1.6mlE.coliTG1(OD600＝0.4)，37℃水浴静置30min。取100ulE.coliTG1菌液，10倍梯度稀释4次，分别涂布于TYE培养基平板(含100ug/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃培养过夜，计数。剩余E.coliTG1菌液11600rpm，离心5min，弃上清，沉淀以100ul2×TY培养基重悬，涂布于TYE培养基平板(含100ug/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃培养过夜，计数。
在过夜培养的培养平板上挑单菌落保存于-70℃，剩余菌落以2ml含15％甘油的2×TY培养基刮下，混匀，保存于-70℃。将500ul刮下菌液加入50ml2×TY培养基(含100ug/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.4，取10ml菌液加入1011辅助噬菌体KM13，剩余菌液继续振荡培养2h，10800g离心10min，重悬于5ml含15％甘油的2×TY培养基中，保存于-70℃。
上述加有KM13的菌液，37℃水浴静置30min，3000g离心10min，沉淀用50ml2×TY培养基(含100ug/ml氨苄青霉素，50ug/ml卡那霉素和1％葡萄糖)重悬，30℃，200rpm振荡培养过夜。过夜培养菌液3300g离心15min，上清加入15mlPEG/NaCl(20％聚乙二醇6000，2.5MNaCl)，混匀，冰浴1h。3300g离心30min，倒掉PEG/NaCl，快速离心，吸除残余的PEG/NaCl。沉淀以2mlPBS重悬，11600g离心10min，去除细胞残片，沉淀以含15％甘油的PBS重悬，保存于-70℃。
以上步骤重复2轮。
挑最后一轮筛选所得菌落，加入5ml2×TY-A(含100ug/ml氨苄青霉素)培养基中，200rpm，37℃，培养过夜。取过夜菌液2ul，稀释于20ulddH2O中，混合均匀，取2ul为模板，引物为LMB：CAGGAAACAGCTATGAC和pHEN：CTATGCGGCCCCATTCA作菌液PCR。PCR条件：94℃变性5min，进入30个PCR循环，94℃变性1min，55℃回火1min，72℃延伸1min，然后72℃再延伸10min。
经菌液PCR验证为阳性克隆的菌株，加入辅助噬菌体KM13挽救(方法同上述筛选步骤所述)。用PEG沉淀下来的噬菌体作单克隆噬菌体elisa。
以竞争ELISA分析克隆对盐酸克伦特罗的亲和力，结果亲和力最高的克隆ICS0为4.3ng/ml。
由此可见，本发明以磁珠为载体和小分子半抗原偶联，在单链抗体库中筛选抗小分子半抗原的单链抗体。通过上述方法筛选单链抗体，所需时间约14天，得到的单链抗体与小分子半抗原的亲和力高。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其特征在于：将磁珠和小分子半抗原按一定比例在反应体系下充分混合，并加入一定量的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，在适宜的温度下搅拌，进行偶联反应，制备偶联小分子半抗原的磁珠，然后以此偶联有小分子半抗原的磁珠从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体。
2.如权利要求1所述从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其特征在于：所述磁珠和小分子半抗原按一定比例在反应体系下充分混合，其中，磁珠和小分子半抗原的质量比为1∶20～1∶30。
3.如权利要求1所述从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其特征在于：所述磁珠是表面带有氨基或羧基的磁珠。
4.如权利要求1所述从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其特征在于：所述小分子半抗原是游离羧基或氨基的小分子半抗原。
5.如权利要求1所述从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其特征在于：所述加入一定量的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，其中，磁珠和乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的质量比为1∶30。
6.如权利要1所述从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其特征在于：所述适宜的温度为25℃。
7.如权利要求1所述从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其特征在于：所述反应体系为水，反应体系pH为4.0。
8.如权利要求1所述从单链抗体库中筛选抗小分子半抗原单链抗体的方法，其特征在于：所述进行偶联反应，其是在轻微振动下反应2h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Zhang Luyi Document name: Notification of Passing Examination on Formalities Addressee: Wang Xiaodong Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160120 |