CN105259001A - 一种用于组织活检的石蜡切片前处理方法 - Google Patents
一种用于组织活检的石蜡切片前处理方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于组织活检的石蜡切片前处理方法，属于生物病理组织检测领域，包含以下步骤：在相应的温度、压力、时间以及转速条件下，对固定好的组织依次进行10%的中性缓冲福尔马林固定、90%的甲醛乙醇固定、乙醇梯度脱水、二甲苯透明及石蜡浸蜡。本发明的有益效果在于，通过上述最佳试剂组合，优化脱水、透明及浸蜡的各项条件，提高石蜡切片前处理部分的效率，将组织活检脱水、透明及浸蜡的时间从传统方法所需的近十个小时缩短至两个多小时，缩短了活检周期，并且大大提升了设备的使用率。
Description
技术领域
本发明属于生物病理组织检测领域，具体涉及一种用于组织活检的石蜡切片前处理方法。
背景技术
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法。石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤，其中脱水和透明两步骤最为耗时，一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，使组织活检流程周期长、效率不高。
中国专利申请CN201010282261.9公开了一种生物组织脱水机及其应用，该脱水机的脱水方式是采用将生物病理组织固定在样品槽中，连续通入浓度从低到高持续变化的脱水剂进行脱水，通过连续通入脱水剂加快了组织的脱水速度，但脱水过程中脱水剂消耗过大，造成浪费，不利于控制成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于组织活检的石蜡切片前处理方法，通过控制脱水时的环境温度、加压、搅拌及时间等条件，优化脱水、透明及浸蜡的各项条件，将组织活检脱水、透明及浸蜡的时间控制在两个多小时。
为了达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种用于组织活检的石蜡切片前处理方法，进行脱水前将组织用10%中性缓冲福尔马林固定，固定时间不少于4小时，后续的操作包含以下步骤：
1）温度60℃、加压35KPa下，将固定好的组织用10%的中性缓冲福尔马林浸渍11分钟，脱水温度为60同时使用搅拌器对所述福尔马林溶液进行800转每分钟的搅拌；
2）温度65度、加压35KPa下，经10%的中性缓冲福尔马林浸渍11分钟后的组织用90%的甲醛乙醇浸渍16分钟，同时使用搅拌器对所述甲醛乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
3）温度65度、加压35KPa下，经90%的甲醛乙醇浸渍后的组织用95%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
4）温度65度、加压35KPa下，经95%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
5）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍7分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
6）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍7分钟后的组织用100%的乙醇浸渍16分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
7）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍16分钟后的组织用100%的乙醇浸渍17分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
8）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍17分钟后的组织用二甲苯浸渍4分钟，同时使用搅拌器对所述二甲苯溶液进行800转每分钟的搅拌；
9）温度65度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍4分钟后的组织用二甲苯浸渍5分钟，同时使用搅拌器对所述二甲苯溶液进行800转每分钟的搅拌；
10）温度65度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍5分钟后的组织用二甲苯浸渍11分钟，同时使用搅拌器对所述二甲苯溶液进行800转每分钟的搅拌；
11）温度77度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍11分钟后的组织用石蜡浸渍4分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
12）温度77度、加压35KPa下，经石蜡浸渍4分钟后的组织用石蜡浸渍5分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
13）温度77度、加压35KPa下，经石蜡浸渍5分钟后的组织用石蜡浸渍10分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌。
优选地，进行脱水前将组织用10%中性缓冲福尔马林固定4~10小时。
优选地，直径大于10mm的组织需每隔10mm切开固定，并在每个切口放置分隔海棉。
优选地，组织的厚度不大于3mm，组织的面积小于15mm×15mm。
本发明的有益效果在于，在用乙醇进行脱水之前，用90%的甲醛乙醇浸渍组织，进一步加强对组织的固定，保护组织在后续的脱水中不轻易损坏；通过优化脱水、透明及浸蜡的各项条件，提高组织脱水、透明的效率，将组织活检脱水、透明及浸蜡的时间从传统方法所需的近十个小时缩短至两个多小时，并不会影响最终的切片质量；各个步骤进行的时间长度精确，便于掌控流程、调配生产；本发明提供的脱水、透明及浸蜡方法不会增加生产成本，优化了组织活检流程，缩短了活检周期，并且大大提升了设备的使用率。
附图说明
图1是常温常压条件下制得的石蜡切片图；
图2是常规方法固定后加温加压条件下制得的石蜡切片图；
图3是本发明一种用于组织活检的石蜡切片前处理方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将厚度小于3mm，面积小于15mm×15mm的组织用10%中性缓冲福尔马林固定固定6小时后，在常温常压条件下对组织进行脱水、透明和浸蜡，其步骤为：
1）将固定好的组织用95%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
2）经95%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
3）经100%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍7分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
4）经100%的乙醇浸渍7分钟后的组织用100%的乙醇浸渍16分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
5）经100%的乙醇浸渍16分钟后的组织用100%的乙醇浸渍17分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
6）经100%的乙醇浸渍17分钟后的组织用二甲苯浸渍4分钟，同时使用搅拌器对透明溶液进行800转每分钟的搅拌；
7）经二甲苯浸渍4分钟后的组织用二甲苯浸渍5分钟，同时使用搅拌器对透明溶液进行800转每分钟的搅拌；
8）经二甲苯浸渍5分钟后的组织用二甲苯浸渍11分钟，同时使用搅拌器对透明溶液进行800转每分钟的搅拌；
9）经二甲苯浸渍11分钟后的组织用石蜡浸渍4分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
10）经石蜡浸渍4分钟后的组织用石蜡浸渍5分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
11）经石蜡浸渍5分钟后的组织用石蜡浸渍10分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌。
如图1所示，经过上述步骤脱水、透明和浸蜡的组织最终制得的石蜡切片染色情况较差、不清晰。可见在常温常压条件下，组织的脱水、透明及浸蜡速度较慢，若无精确合适的辅助条件，需要较长的浸渍时间来保证组织的脱水、透明及浸蜡质量，不利于效率的提高。
实施例2
将厚度小于3mm，面积小于15mm×15mm的组织用10%中性缓冲福尔马林固定固定6小时后，在加温加压条件下对组织进行脱水、透明和浸蜡，其步骤为：
1）温度65度、加压35KPa下，将固定好的组织用95%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
2）温度65度、加压35KPa下，经95%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
3）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍7分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
4）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍7分钟后的组织用100%的乙醇浸渍16分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
5）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍16分钟后的组织用100%的乙醇浸渍17分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
6）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍17分钟后的组织用二甲苯浸渍4分钟，同时使用搅拌器对透明溶液进行800转每分钟的搅拌；
7）温度65度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍4分钟后的组织用二甲苯浸渍5分钟，同时使用搅拌器对透明溶液进行800转每分钟的搅拌；
8）温度65度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍5分钟后的组织用二甲苯浸渍11分钟，同时使用搅拌器对透明溶液进行800转每分钟的搅拌；
9）温度77度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍11分钟后的组织用石蜡浸渍4分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
10）温度77度、加压35KPa下，经石蜡浸渍4分钟后的组织用石蜡浸渍5分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
11）温度77度、加压35KPa下，经石蜡浸渍5分钟后的组织用石蜡浸渍10分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌。
如图2所示，经过上述步骤脱水、透明和浸蜡的组织最终制得的石蜡切片组织收缩较多，血管和致密组织的结构不甚清晰。可见，若无在脱水前采取措施进一步固定和保护组织，组织容易在加温加压条件下受到损害。
实施例3
将厚度小于3mm，面积小于15mm×15mm的组织用10%中性缓冲福尔马林固定固定6小时后，在加温加压条件下对组织进行脱水、透明和浸蜡，如图3所示，其步骤为：
1）温度60℃、加压35KPa下，将固定好的组织用10%的中性缓冲福尔马林浸渍11分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
2）温度65度、加压35KPa下，经10%的中性缓冲福尔马林浸渍11分钟后的组织用90%的甲醛乙醇浸渍16分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
3）温度65度、加压35KPa下，经90%的甲醛乙醇浸渍后的组织用95%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
4）温度65度、加压35KPa下，经95%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
5）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍7分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
6）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍7分钟后的组织用100%的乙醇浸渍16分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
7）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍16分钟后的组织用100%的乙醇浸渍17分钟，同时使用搅拌器对脱水溶液进行800转每分钟的搅拌；
8）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍17分钟后的组织用二甲苯浸渍4分钟，同时使用搅拌器对透明溶液进行800转每分钟的搅拌；
9）温度65度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍4分钟后的组织用二甲苯浸渍5分钟，同时使用搅拌器对透明溶液进行800转每分钟的搅拌；
10）温度65度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍5分钟后的组织用二甲苯浸渍11分钟，同时使用搅拌器对透明溶液进行800转每分钟的搅拌；
11）温度77度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍11分钟后的组织用石蜡浸渍4分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
12）温度77度、加压35KPa下，经石蜡浸渍4分钟后的组织用石蜡浸渍5分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
13）温度77度、加压35KPa下，经石蜡浸渍5分钟后的组织用石蜡浸渍10分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌。
本发明提供的用于组织活检的石蜡切片前处理方法包含了13个步骤，共耗时116分钟，步骤之间转换试剂抽液、排液共26次，每次约1分钟，则完成依次组织脱水、透明及浸蜡总工需耗时约142分钟。其中，脱水前10%的中性缓冲福尔马林溶液和甲醛乙醇溶液进一步加强对组织的固定，保护组织在后续的脱水中不轻易损坏，发明人经过多次实验证明，采用本发明提供的方法进行组织脱水、透明及浸蜡，最终制得石蜡切片的质量与使用传统方法制得的石蜡切片质量无甚差异，对常规病理诊断无影响，对免疫组化等后续检查无影响。
发明人经过反复实验及分析数据和总结经验，优化了组织脱水、透明、浸蜡的程序，大大提高了组织脱水、透明、浸蜡的效率，将脱水、透明及浸蜡过程的总时长从原本的近十个小时缩短至两个多小时，对加快制成石蜡切片并进行快速诊断具有积极意义；本发明提供的组织脱水、透明及浸蜡方法中，周期变短，各个步骤需要进行的时间长度设置精确，便于操作员掌控流程、调配生产；提高了相关设备的使用率，脱水机、包埋机、染色封片机以及切片机等都得到合理的有效使用；不需要增加经费来实现本发明提供的组织活检脱水、透明及浸蜡方法，具备广泛推广的前景。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于组织活检的石蜡切片前处理方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）温度60℃、加压35KPa下，将固定好的组织用10%的中性缓冲福尔马林浸渍11分钟，脱水温度为60同时使用搅拌器对所述福尔马林溶液进行800转每分钟的搅拌；
2）温度65度、加压35KPa下，经10%的中性缓冲福尔马林浸渍11分钟后的组织用90%的甲醛乙醇浸渍16分钟，同时使用搅拌器对所述甲醛乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
3）温度65度、加压35KPa下，经90%的甲醛乙醇浸渍后的组织用95%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
4）温度65度、加压35KPa下，经95%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍5分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
5）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍5分钟后的组织用100%的乙醇浸渍7分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
6）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍7分钟后的组织用100%的乙醇浸渍16分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
7）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍16分钟后的组织用100%的乙醇浸渍17分钟，同时使用搅拌器对所述乙醇溶液进行800转每分钟的搅拌；
8）温度65度、加压35KPa下，经100%的乙醇浸渍17分钟后的组织用二甲苯浸渍4分钟，同时使用搅拌器对所述二甲苯溶液进行800转每分钟的搅拌；
9）温度65度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍4分钟后的组织用二甲苯浸渍5分钟，同时使用搅拌器对所述二甲苯溶液进行800转每分钟的搅拌；
10）温度65度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍5分钟后的组织用二甲苯浸渍11分钟，同时使用搅拌器对所述二甲苯溶液进行800转每分钟的搅拌；
11）温度77度、加压35KPa下，经二甲苯浸渍11分钟后的组织用石蜡浸渍4分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
12）温度77度、加压35KPa下，经石蜡浸渍4分钟后的组织用石蜡浸渍5分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌；
13）温度77度、加压35KPa下，经石蜡浸渍5分钟后的组织用石蜡浸渍10分钟，同时使用搅拌器对浸蜡溶液进行800转每分钟的搅拌。
2.如权利要求1所述的用于组织活检的石蜡切片前处理方法，其特征在于，进行脱水前将组织用10%中性缓冲福尔马林固定，固定时间为4~10小时。
3.如权利要求2所述的用于组织活检的石蜡切片前处理方法，其特征在于，直径大于10mm的组织每隔10mm切开固定，并在每个切口放置分隔海棉。
4.如权利要求1所述的用于组织活检的石蜡切片前处理方法，其特征在于，所述组织的厚度不大于3mm。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 510000 Guangdong City, Guangzhou International Biological Island spiral No. four, No. 1 standard industrial unit, a production area of the first layer of 304 units third units Applicant after: GUANGZHOU KINGMED DIAGNOSTICS GROUP Co.,Ltd. Address before: 510000 Guangdong City, Guangzhou International Biological Island spiral No. four, No. 1 standard industrial unit, a production area of the first layer of 304 units third units Applicant before: GUANGZHOU KINGMED DIAGNOSTICS TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170306 Address after: 510300 Guangdong, Guangzhou International Biological Island spiral No. four, No. fourth, B401 cell layer, B501 cell layer, the sixth layer B601 unit 9 Applicant after: GUANGZHOU JINQIRUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 510000 Guangdong City, Guangzhou International Biological Island spiral No. four, No. 1 standard industrial unit, a production area of the first layer of 304 units third units Applicant before: GUANGZHOU KINGMED DIAGNOSTICS GROUP Co.,Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Liu Zhuxin Inventor after: Zhong Xuejun Inventor after: Chen Jiachang Inventor after: Liu Jun Inventor after: Zhang Yao Inventor after: Chen Xiaoyan Inventor before: Liu Zhuxin |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |