CN105254492A - 一种用于肝脏保护的新的三萜化合物及其制备方法 - Google Patents

一种用于肝脏保护的新的三萜化合物及其制备方法 Download PDF

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CN105254492A CN201510829983.4A CN201510829983A CN105254492A CN 105254492 A CN105254492 A CN 105254492A CN 201510829983 A CN201510829983 A CN 201510829983A CN 105254492 A CN105254492 A CN 105254492A
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Abstract

本发明公开了一种用于肝脏保护的新的三萜化合物及其制备方法。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的三萜类化合物，可以从杭白菊的干燥头状花序中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物使肝细胞对之后经历的缺血再灌注损伤的耐受力增强，表现为肝细胞活力增强，细胞死亡率降低。化合物(Ⅰ)预处理能够减轻人肝细胞缺血再灌注损伤，起到肝细胞保护作用，可以用来开发成肝脏保护的药物。

Description

一种用于肝脏保护的新的三萜化合物及其制备方法
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及从杭白菊的干燥头状花序中分离得到的一种具有肝脏保护作用的三萜类化合物及其制备方法。
背景技术
杭白菊为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，亦名小汤黄、小白菊，与毫菊、滁菊、贡菊并称为中国驰名的四大名菊。第一次在其花朵尚未完全张开时收摘所得为胎菊，亦名甘菊；在其花朵盛开后采摘所得为市售杭白菊。杭白菊性微寒，味苦、甘，归肺、肝经，具有散风清热、平肝明目、清热解毒之功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒。《神农本草经》中记载，杭白菊茶能“主诸风头眩、肿痛、目欲脱、皮肤死肌、恶风湿痹，久服利气，轻身耐劳延年”。杭白菊主产于浙江桐乡，是卫生部首批批准的药食同源的道地药材之一，也是浙江省传统中药材“浙八味”之一，对其化学成分及药理活性的研究具有重要的价值。
研究发现杭白菊的化学成分主要包括黄酮类、挥发油、三萜类、甾体类、酚类、多糖及微量元素等，药效物质基础主要为黄酮类、挥发油类成分。杭白菊中富含黄酮类化合物，其干品含总黄酮高达4.50％，其提取物中含总黄酮高达78.46％。杭白菊中黄酮类化合物的结构母核主要包括黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类。黄酮类化合物是杭白菊主要活性成分之一，在预防和治疗冠心病、糖尿病及抗癌方面具有重要地位，因此，有望从该类植物中找到抑制癌症的黄酮类先导化合物，这对于研发抗癌新药意义重大。
按杭州本地的传统习惯，杭白菊有“黄菊入药，白菊入茶”之说，其具有疏散风热、平肝明目、清热解毒之功效。关于杭白菊的现代药理学实验主要集中于心血管保护、降血脂、抗氧化等方面的研究，其肝保护、神经保护作用是近年来的新发现。
发明内容
本发明的目的是提供一种从杭白菊的干燥头状花序中分离得到的一种具有肝脏保护作用的三萜类化合物及其制备方法。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将杭白菊的干燥头状花序粉碎，用80～90％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱6个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、55:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为85％。
一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
所述的化合物(Ⅰ)在制备肝脏保护的药物中的应用。
所述的药物组合物在制备肝脏保护的药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
附图说明
图1为化合物(Ⅰ)结构式；
图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证
试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
制备方法：(a)将杭白菊的干燥头状花序(8kg)粉碎，用85％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(355g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱6个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(136g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积)、55:1(8个柱体积)、30:1(6个柱体积)、15:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(31g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和10:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(11g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(28mg)。
结构确证：白色无定形粉末；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z493.2602，结合核磁特征可得分子式为C28H38O6，不饱和度为10。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，600MHz)：H-1(2.24，m)，H-1(1.96，m)，H-3(2.31，m)，H-3(2.05，m)，H-5(1.71，m)，H-6(2.48，m)，H-6(2.19，m)，H-8(3.01，s)，H-11(5.93，s)，H-15(1.92，m)，H-15(1.53，m)，H-16(2.18，m)，H-16(1.99，m)，H-19(1.01，s)，H-20(2.44，m)，H-21(0.91，d，J＝6.9)，H-22(1.54，m)，H-22(1.23，m)，H-23(2.22，m)，H-23(2.25，m)，H-24(5.76，t，J＝7.4)，H-27(1.71，s)，H-28(1.00，s)，H-29(0.93，s)，H-30(0.95，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，125MHz)：51.1(CH2，1-C)，209.4(C，2-C)，54.7(CH2，3-C)，37.9(C，4-C)，50.5(CH，5-C)，37.1(CH2，6-C)，208.2(C，7-C)，53.7(CH，8-C)，189.1(C，9-C)，39.3(C，10-C)，121.2(CH，11-C)，213.6(C，12-C)，48.5(C，14-C)，33.6(CH2，15-C)，36.4(CH2，16-C)，213.5(C，17-C)，18.7(CH3，19-C)，46.0(CH，20-C)，16.6(CH3，21-C)，32.8(CH2，22-C)，27.9(CH2，23-C)，141.2(CH，24-C)，129.7(C，25-C)，170.6(C，26-C)，21.7(CH3，27-C)，18.7(CH3，28-C)，22.1(CH3，29-C)，25.8(CH3，30-C)；碳原子标记参见图1。红外光谱表明该化合物含有羟基(3440cm-1)，羰基(1706cm-1)和烯烃(1664cm-1)结构。1HNMR数据显示了六个甲基和两个烯属次甲基。13CNMR和DEPT谱显示有28个碳共振：六个甲基，七个亚甲基，五个次甲基(两个烯属次甲基)，以及十个季碳(五个酮羰基碳，一个烯烃季碳)。五个羰基和两个三取代双键共7个不饱和度，说明该化合物为三环结构。通过HMBC谱中H-11(δH5.93)与C-9(δC189.1)，C-12(δC213.6)和C-14(δC48.5)以及H3-28(δ1.00)与C-8(δC53.7)，C-12和C-14的相关性，可知它们组成了环C。此外，HMBC谱中H3-28与C-15的相关性表明环C和侧链通过C-14和C-15键相连。ROESY谱中，H-19与H-8的相关性表明两者为β构型。与此相反，H3-29与H3-19，H-5与H3-30的相关性表明H-5和H3-30为α取向。另外，C-24和C-25之间的双键为E构型，ROESY谱中H-24与H3-27的相关性验证了上述推论。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验
一、材料和仪器
HL7702肝细胞株由中国科学院上海生命科学研究所提供。化合物(Ⅰ)自制，方法见实施例1，HPLC归一化纯度大于98％。高糖DMEM培养基、高糖DMEM/F12＝1:1培养基、胎牛血清均购于HycLone。EDTA购于上海试剂一厂。台盼蓝购于北京化工厂。无糖DMEM培养基购于Gibco。胰酶、MTT、DMSO均购于Amresco。LDH释放法检测试剂盒购于GENMDE。ALT生化检测试剂盒、AST生化检测试剂盒、LDH生化检测试剂盒均购于美国贝克曼试剂有限公司。Western及IP细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、MDA检测试剂盒均购于碧云天生物技术研究所。
CO2培养箱(SheL-Lab2300)，电热恒温孵育箱(上海跃进医疗器械厂)，缺氧培养盒(长沙长锦科技有限公司)，GasALertExtreme氧气检测仪(加拿大BWTechnoLogies)，酶标仪(美国BioTekEpoch)，全自动生化仪(BeckmanLX20)，离心机(德国Eppendorfcentrifμge5415D)，孔板离心机(德国Eppendorfcentrifμge5430R)，电子微量天平(METTLERTOLEDOAL104)，PH仪(ThermoORION3STAR)。
二、试验方法
1、细胞分组
将细胞分为6组，每组6个复孔：
(1)正常培养组(N组)：完全培养基，正常条件下培养；
(2)缺血再灌注组(IR组)：完全培养基正常条件培养1h后，模拟缺氧8h，再灌注4h；
(3)化合物(Ⅰ)组：
RE1组：化合物(Ⅰ)0.5ng/mL预处理1h；
RE2组：化合物(Ⅰ)5ng/mL预处理1h；
RE3组：化合物(Ⅰ)50ng/mL预处理1h；模拟缺氧8h，再灌注4h；
(4)生理盐水组(NS组)：以与化合物(Ⅰ)同等体积的生理盐水预处理1h，模拟缺氧8h，再灌注4h。
2、化合物(Ⅰ)的预处理
(1)化合物(Ⅰ)的配制：将1mg化合物(Ⅰ)溶解于500mL生理盐水中。移液枪吸取2.5mL于第一支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为500ng/mL的化合物(Ⅰ)溶液。从第一支离心管中吸取1mL至第二支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为50ng/mL的化合物(Ⅰ)溶液。从第二支离心管中吸取1mL至第三支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为5ng/mL的化合物(Ⅰ)溶液。作好标记。
(2)化合物(Ⅰ)预处理：正常培养组和缺血再灌注组以每孔100μL新鲜的完全培养基更换。RE1组每孔加入5ng/mL的化合物(Ⅰ)溶液10μL和新鲜的完全培养基90μL，RE2组每孔加入50ng/mL的化合物(Ⅰ)溶液10μL和新鲜的完全培养基90μL，RE3组每孔加入500ng/mL的化合物(Ⅰ)溶液10μL和新鲜的完全培养基90μL。生理盐水组每孔加入生理盐水10μL和新鲜的完全培养基90μL。轻轻摇动96孔板，使药液充分混混匀，放入CO2培养箱中孵育1h。
3、肝细胞体外模拟缺血再灌注损伤模型的建立：
(1)体外模拟缺血过程：预处理时间结束后，从细胞培养箱中取出第一块96孔板，正常培养组每孔用100μL完全培养基更换，放入CO2培养箱中继续培养8h。从CO2培养箱中取出第二块96孔板，缺血再灌注组、化合物(Ⅰ)预处理组和生理盐水组每孔用100μL无糖DMEM培养基置换完全培养基，放入缺氧培养盒中，培养盒中放入盛有50mL灭菌水的无菌小瓶保持饱和湿度。将缺氧培养盒放入37℃恒温孵育箱中，进气口连接94％N2-5％CO2-1％O2混合气体，出气口连接氧气检测仪。以2L/min的气体流量通入混合气体，当氧气检测仪显示出气口氧气浓度<1％时，调节混合气体流量300mL/min维持出气口氧气浓度<1％。以此模拟缺血过程8h。
(2)体外模拟再灌注过程：从CO2培养箱中取出第一块96孔板，正常培养组每孔更换100μL新鲜的完全培养基，放入CO2培养箱中继续培养4h。从缺氧培养盒中取出第二块96孔板，缺血再灌注组、化合物(Ⅰ)预处理组和生理盐水组每孔用100μL新鲜的完全培养基置换无糖DMEM培养基，放入CO2培养箱中正常条件下(37℃、5％CO2、95％空气、饱和湿度)培养4h，模拟再灌注过程。
3、指标检测
3.1MTT法检测肝细胞活力
(1)MTT溶液配制：用电子微量天平称取250mgMTT，放入小烧杯中，加入50mLPBS搅拌30min，使之充分溶解，即为浓度为5mg/mL的MTT溶液。在超净工作台中用0.22μm的微孔滤器除菌，分装为每支1mL，4℃避光保存备用。
(2)细胞准备：按上述方法进行细胞分组，并另设调零孔。并按上述方法进行化合物(Ⅰ)预处理和体外模拟缺血再灌注过程。
(3)呈色：终末时间点每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，放入37℃、5％CO2、95％空气、饱和湿度的CO2培养箱中继续培养4h。终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入100μLDMSO溶液，微量振荡器上振荡10min，使结晶物充分溶解。
(4)比色：选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收度(A)，记录结果。实验重复2次。
3.2乳酸脱氢酶释放法细胞繁殖与毒性检测
按GENMED乳酸脱氢酶释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒说明书操作，重复2次。
(1)按上述方法准备待测细胞，并另设无细胞的培养液(背景空对照孔)和未处理的后续裂解的细胞(样品最大酶活性对照孔)，作好标记。
(2)到规定的检测时间点前1小时，从CO2培养箱中取出待测的96孔细胞培养板，加入10μLGENMED裂解液到未处理的后续裂解的细胞孔里，同时加入10μLGENMED补充液到其余所有检测孔里。放回CO2培养箱中继续培养1小时即规定检测时间。
(3)从CO2培养箱取出待测96孔细胞培养板，放入孔板离心机离心10min，速度为250g。
(4)分别小心移取50μL上清液到新的96孔板的相应孔里，同时作好标记。
(5)混匀GENMED反应液，每孔分别加入50μLGENMED反应液，再分别每孔加入10μLGENMED显色液，摇动96孔板混匀。
(6)在室温下孵育30min，避免光照。
(7)每孔分别加入10μLGENMED终止液。
(8)即刻放进酶标仪里测定光吸收度(A)，选择波长570nm。
(9)根据以下公式计算细胞死亡率：
处理样品实际吸光读数＝处理样品孔吸光读数－样品对照孔吸光读数－背景空对照孔吸光读数
样品细胞最大酶活性的实际吸光读数＝样品最大酶活性对照孔吸光读数－样品对照孔吸光读数－背景空对照孔吸光读数
细胞死亡率＝(处理样品实际吸光读数÷样品细胞最大酶活性的实际吸光读数)×100％
3.3肝细胞功能指标的测定：
按上述方法进行细胞分组、预处理和模拟缺血再灌注损伤。到终末时间点分别将各孔细胞培养上清液100μL收集于Ep管中，每管分别加入100μL完全培养基稀释至200μL，室温下离心5min，速度为1200r/min。取上清液在全自动生化仪下检测ASL、ALT和LDH水平。实验重复2次。
4、统计学处理
使用SPSS13.0软件包进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差(χ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。
三、结果及结论
1、化合物(Ⅰ)预处理对缺血再灌注损伤肝细胞活力的影响
IR组肝细胞活力比N组明显下降(P<0.05)，表明体外模拟缺血再灌注过程成功地造成了肝细胞的缺血再灌注损伤。给予5ng/mL化合物(Ⅰ)预处理1小时，缺血再灌注损伤肝细胞的活力较缺血再灌注组和生理盐水组增强(P<0.05)，但未能恢复到正常组肝细胞活力水平(P<0.05)，生理盐水组则与缺血再灌注组差异无统计学意义(P>0.05)。而0.5ng/mL和50ng/mL浓度的化合物(Ⅰ)预处理1小时，均未能增强缺血再灌注损伤肝细胞的活力(P>0.05)，其肝细胞活力与生理盐水组之间差异也无统计学意义(P>0.05)。结果见表1(▲表示与N组比较，P<0.05，差异有统计学意义；★表示与IR组和NS组比较，P<0.05，差异有统计学意义，下同)。
2、化合物(Ⅰ)预处理对肝细胞缺血再灌注损伤的细胞繁殖和毒性的影响
与正常组相比，体外模拟缺血再灌注损伤使细胞死亡率>90％。给予5ng/mL化合物(Ⅰ)预处理1小时，肝细胞死亡率下降约35％，差异有统计学意义(P<0.05)，但其细胞死亡率仍比正常组高约50％，差异有统计学意义(P<0.05)；而生理盐水组肝细胞死亡率比缺血再灌注组虽略有下降(约为8％)，但差异无统计学意义。0.5ng/mL和50ng/mL浓度的化合物(Ⅰ)预处理1小时，肝细胞死亡率比缺血再灌注组分别降低6％和13％，但差异无统计学意义(P>0.05)；而与生理盐水组的肝细胞死亡率相近(P>0.05)。结果见表2。
3、化合物(Ⅰ)预处理对缺血再灌注损伤肝细胞肝功能指标的影响
与正常组比较，缺血再灌注损伤组细胞培养上清液中的ALT水平未见明显升高(P>0.05)；而AST、LDH水平以及AST/ALT比值显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。给予5ng/mL化合物(Ⅰ)预处理1小时，肝细胞培养上清液中的AST、LDH水平以及AST/ALT比值较缺血再灌注组和生理盐水组降低，但仍较正常组高(P<0.05)；而ALT水平与缺血再灌注组和生理盐水组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。生理盐水组细胞培养上清液中的ALT、AST、LDH水平以及AST/ALT比值与缺血再灌注组之间差异无统计学意义(P>0.05)。0.5ng/mL和50ng/mL化合物(Ⅰ)预处理1小时，均未能使肝细胞培养上清液中的AST、LDH水平降低(P>0.05)。结果见表3。
本研究显示，化合物(Ⅰ)(RE2组)使肝细胞对之后经历的缺血再灌注损伤的耐受力增强，表现为肝细胞活力增强，细胞死亡率降低。以上结果提示，化合物(Ⅰ)预处理能够减轻人肝细胞缺血再灌注损伤，起到肝细胞保护作用。
表1MTT法检测化合物(Ⅰ)预处理对缺血再灌注损伤肝细胞活力的影响
组别 样本数n A值
N组 6 2.222±0.135
IR组 6 1.585±0.113▲
RE1组 6 1.509±0.073▲
RE2组 6 2.076±0.144▲★
RE3组 6 1.569±0.118▲
NS组 6 1.484±0.085▲
表2LDH释放法肝细胞繁殖与毒性定量检测细胞死亡率
组别 样本数n 细胞死亡率
N组 5 0.000±0.145
IR组 5 0.915±0.076▲
RE1组 5 0.851±0.157▲
RE2组 5 0.531±0.058▲★
RE3组 5 0.791±0.065▲
NS组 5 0.834±0.107▲
表3肝细胞培养上清液中ALT、AST、LDH水平的变化(n＝5)
组别 ALT AST AST/ALT LDH
N组 14.0±1.58 21.1±0.84 1.53±0.13 100.8±9.52
IR组 12.8±0.84 33.0±2.24▲ 2.58±0.07▲ 247.2±13.76▲
RE1组 14.0±1.58 33.0±1.58▲ 2.37±0.16▲ 260.0±11.77▲
RE2组 14.0±1.58 27.2±0.84▲★ 1.96±0.24▲★ 204.0±8.60▲★
RE3组 13.8±0.84 32.8±2.17▲ 2.38±0.17▲ 239.6±6.54▲
NS组 12.8±0.84 31.2±0.84▲ 2.45±0.22▲ 249.2±8.87▲
实施例3
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (7)

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将杭白菊的干燥头状花序粉碎，用80～90％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱6个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、55:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为85％。
5.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备肝脏保护的药物中的应用。
7.权利要求5所述的药物组合物在制备肝脏保护的药物中的应用。
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