CN105239165A

CN105239165A - 塑料袋联合聚蔗糖泛影葡胺分离法建立免疫细胞库及应用

Info

Publication number: CN105239165A
Application number: CN201510611167.6A
Authority: CN
Inventors: 仇志根; 李春艳
Original assignee: Shanghai Ji Quan Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Ji Quan Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2016-01-13

Abstract

本发明公开了塑料袋联合聚蔗糖泛影葡胺分离法建立免疫细胞库构建方法和应用，本发明的构建步骤包括：(1)带针头塑料袋，采集静脉血，肝素抗凝，检测传染病病毒和免疫细胞数量；(2)加入生理盐水稀释；(3)聚蔗糖泛影葡胺溶液加入带导管的塑料袋；(4)将(1)所得加入(3)聚蔗糖泛影葡胺溶液界面上；(5)离心；(6)塑料袋收集白膜层和上层血浆；(7)离心；(8)收集沉淀，获得所需免疫细胞；(9)加入冷冻保护剂；(10)置液氮中冷冻保存，将免疫细胞详细信息，包括姓名、性别、年龄、免疫细胞数量、传染病病毒结果等，输入电脑，建立完善的数据档案，即构建出免疫细胞库。本发明成本低廉，有抗肿瘤应用价值。

Description

塑料袋联合聚蔗糖泛影葡胺分离法建立免疫细胞库及应用

技术领域

本发明涉及一种细胞库的构建方法及应用，特别涉及一种免疫细胞库的构建方法及应用。

技术背景

外科手术、化疗、放疗是治疗恶性肿瘤的常用手段，这些治疗方法有一定的侵袭性，会损伤正常细胞，毒副作用大。免疫细胞治疗肿瘤，能特异性杀伤肿瘤细胞，而不会损伤正常细胞，毒副作用小，因而被称为抗肿瘤治疗的第四种方法。

2010年，美国FDA批准了世界上第一个免疫细胞治疗前列腺癌的药物，经过512例的临床试验，可以使前列腺癌患者生存期延长4个月。国内很多医院也开展免疫细胞治疗肿瘤的临床研究，广西医科大学肿瘤医院报道，采用CD3单克隆抗体、白细胞介素2等激活的免疫细胞，治疗23例小细胞肺癌，有效率78％，1年生存率82％，明显高于对照组的有效率35％，1年生存率47％。

免疫细胞治疗肿瘤的程序是，首先采集肿瘤患者静脉血，送到细胞工厂，分离静脉血中的免疫细胞，加入免疫细胞培养液，以及重组人白细胞介素2、r干扰素，CD3单克隆抗体等细胞因子激活免疫细胞，放置于CO2培养箱中(或者生物反应器)培养，免疫细胞开始增殖，2-3周后，免疫细胞可增殖数百倍到一千倍，免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力也大大增强，杀伤性免疫细胞CD3⁺CD56⁺双阳性细胞比例由1％～2％上升到30％以上，最高可以达到50％，最后收集免疫细胞，通过一系列严格的检测后，将扩增的免疫细胞回输给肿瘤患者，免疫细胞在肿瘤患者体内发挥杀伤肿瘤细胞的作用，从而达到治疗肿瘤的目的。

但是，现有的免疫细胞治疗肿瘤的制备程序存在缺陷，因为，治疗肿瘤的免疫细胞来自肿瘤患者，肿瘤患者的免疫细胞功能受损，杀伤肿瘤细胞能力低下，尽管采用CD3单克隆抗体、白细胞介素2等细胞因子激活，免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力获得增强，但是依然低于健康人免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力。科学研究也证明这一点。有学者比较了肿瘤患者和健康人静脉血免疫细胞，经过CD3单克隆抗体、r干扰素、白细胞介素2等细胞因子激活后，第14天，肿瘤患者的免疫细胞扩增95倍，低于健康人145倍；肿瘤患者免疫细胞杀伤肿瘤细胞株K562的能力是44％，低于健康人的62％。这说明，现有的使用肿瘤病人免疫细胞进行免疫细胞治疗的程序并不是最优的方案。

为了克服上述的缺点，因此，在健康状态下，将健康人高质量的免疫细胞储存起来，保管在免疫细胞库中，待将来储存人患肿瘤时用于自体免疫细胞治疗，是一种良好的方法。

发明内容

静脉血中含有红细胞、粒细胞、单个核细胞(主要是淋巴细胞，即免疫细胞)。其中，红细胞、粒细胞比重大于1.077，单个核细胞比重小于1.077，聚蔗糖泛影葡胺是一种密度介于1.077-1.090之间而近似于等渗的溶液，将静脉血置于聚蔗糖泛影葡胺界面上，通过离心，红细胞、粒细胞会沉淀，单个核细胞会浮在聚蔗糖泛影葡胺界面上，这样就把免疫细胞(其中95％是淋巴细胞)分离出来。

现有的分离免疫细胞技术方案是，先用注射器采集静脉血，然后取15ml或者50ml离心管，加入适量体积的聚蔗糖泛影葡胺溶液于离心管底部，然后加入经过生理盐水稀释的静脉血于聚蔗糖泛影葡胺界面上，盖上离心管盖，拧紧，然后离心，红细胞和粒细胞沉淀于离心管底部，免疫细胞位于中间层，离心完毕，打开离心管盖，吸取免疫细胞。这种分离法，操作过程全部是敞开的，免疫细胞完全暴露在空气中，容易受到细菌污染。

为了克服上述缺点，本发明采用带针头的塑料袋采集静脉血，使用带有导管的塑料袋分离免疫细胞，使用塑料袋收集免疫细胞，全部操作均在密闭的塑料袋中，操作简便，避免细菌污染。

本发明的技术方案概述如下：

(1)使用带针头的塑料袋采集健康人静脉血30～100mL，肝素抗凝，取其中静脉血2～5mL，检测乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、艾滋病病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、厌氧菌培养、需氧菌培养、血细胞三分类检测、免疫细胞CD3、CD4、CD56、CD8检测。

(2)步骤(1)所获得的静脉血，按照质量/体积比1∶1的比例，加入1倍体积的生理盐水，充分混匀。

(3)取带导管塑料袋一只，按照稀释静脉血质量/体积比1∶1/3～1/4的比例，通过导管加入1/3～1/4体积的聚蔗糖泛影葡胺溶液于塑料袋中。

(4)将步骤(2)所获得静脉血稀释液，缓慢的通过导管，加入到步骤(3)所获得含有聚蔗糖泛影葡胺的塑料袋中，并置于聚蔗糖泛影葡胺溶液界面上。

(5)步骤(4)所得的塑料袋，22℃离心，离心机转速为1800～2000转/分钟，时间18～20分钟。静脉血稀释液分2层，下层沉淀是红细胞和粒细胞，上层是血浆，中间层是一层白膜，含有大量的免疫细胞。

(6)步骤(5)含白膜层的塑料袋，悬于压浆板上，操作压浆板，将塑料袋中的白膜层和血浆通过导管挤压到另外一只塑料袋中。

(7)步骤(6)所获得的含白膜层和血浆的塑料袋，再离心，离心机转速为1000～1300转/分钟，时间10～15分钟，免疫细胞沉淀，弃上清，即获得免疫细胞。

(8)步骤(7)获得免疫细胞中，加入冷冻保护剂，经过程序降温，降温速率为-1℃～-3℃/分钟，温度降至-80℃～-90℃后，置于液氮中冷冻保存，并建立可供检索的免疫细胞信息档案，即构建人免疫细胞库。

其中，冷冻保护剂是含10％(体积百分比)二甲基亚砜免疫细胞培养基，该培养基是由90％的(体积百分比)无血清免疫细胞培养基含10％(体积百分比)10％白蛋白构成。

以上全过程均在无菌环境中进行操作。

本发明所获得的免疫细胞，解冻后，免疫细胞活力达到90％以上，按照免疫细胞浓度0.5～1×10⁶/mL，接种于塑料培养袋，用无血清免疫细胞培养基，加入白细胞介素2、r干扰素、CD3单克隆抗体，10％白蛋白，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，免疫细胞开始扩增，每培养3～4天检测免疫细胞数量，添加新鲜免疫细胞培养基，使免疫细胞终浓度0.5～1×10⁶/mL，20天后，免疫细胞扩增800～1000倍，在原始免疫细胞接种10×10⁶情况下，可收集高达1×10¹⁰免疫细胞，用于临床治疗肿瘤。

本发明所述的一种免疫细胞库构建方法，可以从健康人静脉血中获得免疫细胞，建立免疫细胞储存库，根据本发明的方法，储存于库内的免疫细胞，可以经过激活、扩增、获得大量具有强大杀伤肿瘤细胞的能力，用于治疗自身肿瘤。并且，能够长时间保存而不丧失活性，操作简便，建库成本低，具有应用前景。

具体实施方式

以下实施例中，所用的原料或者试剂除特别说明外，均为市售可得。

实施例1

免疫细胞采集分离：

以上全过程均在无菌环境中进行操作。

免疫细胞库的构建：

将获得免疫细胞加入冷冻保护剂，装入冻存管。冷冻保护剂配方是含10％(体积百分比)二甲基亚砜培养基，该培养基是由90％的(体积百分比)无血清免疫细胞培养基含10％(体积百分比)10％白蛋白构成。采用程序降温系统(CBSfreezer2100)，降温速率为-1℃～-3℃/分钟，温度降至-80℃～-90℃，然后将冻存管保存在-196℃液氮罐中。将其详细信息(包括姓名、性别、年龄、地址、联系方式、免疫细胞数量、各种检查结果等信息)输入电脑，建立完善的数据档案备查。

实施例2

免疫细胞采集分离：

以上全过程均在无菌环境中进行操作。

免疫细胞库的构建：

将获得免疫细胞用50％DMSO和50％右旋糖苷冷冻保护剂预处理，装入冻存塑料袋，排除空气，密封，放入铝制冻存盒，置-80℃超低温冰箱，缓慢降温，2小时后，免疫细胞温度降至-80℃，然后将冻存盒保存在-196℃液氮罐中。将其详细信息(包括姓名、性别、年龄、地址、联系方式、免疫细胞数量、各种检查结果等信息)输入电脑，建立完善的数据档案备查。

实施例3

免疫细胞采集分离：、

以上全过程均在无菌环境中进行操作。

免疫细胞库构建：

将获得免疫细胞用含10％(体积百分比)DMSO和80％(体积百分比)RPMI1640培养液以及10％(体积百分比)白蛋白冷冻保护剂预处理，装入冻存管。采用程序降温系统(CBSfreezer2100)，降温速率为-1℃～-3℃/分钟，温度降至-80℃～-90℃，然后将冻存管保存在-196℃液氮罐中。将其详细信息(包括姓名、性别、年龄、地址、联系方式、免疫细胞数量、各种检查结果等信息)输入电脑，建立完善的数据档案备查。

Claims

1.一种塑料袋联合聚蔗糖泛影葡胺分离法建立免疫细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，分离静脉血中免疫细胞，其步骤包括：

(1)使用带针头的塑料袋，采集静脉血30～100mL，肝素抗凝，经检测后，按照质量/体积比1∶1的比例，加入1倍体积的生理盐水，充分混匀。

(2)取带导管塑料袋一只，按照稀释静脉血质量/体积比1∶1/3～1/4的比例，加入1/3～1/4体积的聚蔗糖泛影葡胺溶液。

(3)将步骤(1)所获得静脉血稀释液，缓慢的通过导管，加入到步骤(2)所得塑料袋含聚蔗糖泛影葡胺溶液界面上。

(4)将步骤(3)所获得的塑料袋，离心，中间层是白膜层，含大量免疫细胞。

(5)将步骤(4)获得免疫细胞的塑料袋，悬于压浆板，操作压浆板，将塑料袋中的白膜层和血浆通过导管挤压到另外一只塑料袋中。

(6)步骤(5)所获得的含白膜层的塑料袋，离心，免疫细胞沉淀，弃上清，即获得免疫细胞。

第二步，构建免疫细胞库，其步骤包括：

将获得免疫细胞加入冷冻保护剂，装入冻存管，程序降温后，将冻存管保存在-196℃液氮罐中。将其详细信息(包括姓名、性别、年龄、地址、联系方式、免疫细胞数量、各种检查结果等信息)输入电脑，建立完善的数据档案备查。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，检测包括：乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、艾滋病病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、厌氧菌培养、需氧菌培养、血细胞三分类检测、免疫细胞CD3、CD4、CD56、CD8检测。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，离心机转速为1800～2000转/分钟，时间为18～20分钟。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，离心机转速为1000～1300转/分钟，时间10～15分钟。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二步中，冷冻保护剂配方是含10％(体积百分比)二甲基亚砜，10％(体积百分比)白蛋白，80％(体积百分比)RPMI1640培养液构成。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二步中，程序降温速率为-1℃～-3℃/分钟，温度降至-80℃～-90℃。

7.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二步中，构建免疫细胞库在抗肿瘤方面的应用。