CN105238388B - 一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法 - Google Patents
一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及细胞内糖链抗原活检技术领域，尤其是一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法，通过双光子荧光标记抗体LP‑IgG和硝酸纤维素膜包被的固相抗体Ab，使得在检测时，固相抗体通过抗原反应特异性捕获待测抗原，形成免疫复合物Ab·Ag，加入双光子荧光标记抗体LP‑IgG，与免疫复合物充分反应后(LP‑IgG·Ab·Ag)，经洗涤去除非特异性物质，即可检测判定结果；克服了传统糖链抗原的检测方法中的灵敏度和稳定性较差，操作步骤繁琐的缺陷，并且也使得检测试样不再局限于血液和外周血，只要带有糖链抗原的试样即可用该双分子荧光标记探针LP制备成的试剂盒来进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及细胞内糖链抗原活检技术领域，尤其是一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法。
背景技术
糖链抗原(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)是一种与胰腺癌、胆囊癌、结肠癌和胃癌相关的肿瘤标识物，其单克隆抗体为1116NS19-9，简称Ab19-9；糖链抗原(Carbohydrate antigen 125，CA125)是一种与卵巢癌、输卵管腺癌、子宫内膜癌和宫颈癌相关的肿瘤标识物，其单克隆抗体为OC125，简称Ab125。CA19-9测定广泛用于结肠直肠癌胃癌、胰癌、肝细胞癌肺癌、乳癌的临床监测与诊断；而CA125测定则广泛用于卵巢癌、输卵管腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌和乳腺癌的临床监测与诊断。
因此，对于检测体内糖链抗原需要一种快速、专一、可靠的检测方法，并且这种快速、专一、可靠的检测方法也是早期肿瘤或癌症的诊断和预警的有效途径之一。现有技术中，对于糖链抗原的检测，其采用的方法较多，但由于这些方法的灵敏度和稳定性较差，并且在进行检测操作时较为繁琐，检测的试样仅限于血液与外周血，进而逐步在糖链抗原检测领域受到了局限性，造成早期肿瘤或癌症的诊断和预警的结果不理想。
免疫荧光法，其特异性强、灵敏度高、速度快，与放射免疫法相比，无放射污染，操作简便；由于单光子荧光激发波长一般在350～560nm,易产生光致毒与光漂白；因此，在免疫荧光法中得到较大程度应 用的是双光子荧光。但是，将双光子荧光应用于肿瘤或者癌症标志物的糖链抗原的活检，还未见有任何文献报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法。
双光子荧光采用800～1100nm的高强度激光作为激发光源,不仅能克服单光子荧光的缺点,还能实现深层暗场成像与定点激发,避免组织自发荧光干扰以及降低组织吸光系数,从而显著地提高成像的清晰度、检测的灵敏度与分辨率。
本发明以[Morales AR,Yanez CO,Schafer-Hales KJ,Marcus AI,BelfieldKD.Biomolecule labeling and imaging with a new fluorenyl two-photonfluorescent probe.Bioconjugate Chem.,2009,20:1992–2000]为参考文献，将该文献中制备的双光子荧光探针LP标记抗-糖链抗原单克隆抗体-IgG，并将其借助免疫特异性亲合识别原理与双光子诱导荧光机制实现肿瘤标志物糖链抗原的实时动态活检。
其中双光子荧光探针LP的合成步骤以及合成过程是按照上述的参考文献进行合成，其中的反应的分子结构式为：
其中得出的双光子荧光探针LP为黄色固体物质(m.p.217～218℃)。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ:8.134(dd，6H，Ph-H)，7.933(d，2H，Ph-H)，7.721(t，6H，4H，CH＝CH，and4H，Ph-H)，7.615(s，2H，Ph-H)，7.584(d，2H，Ph-H)，7.521(t，2H，Ph-H)，7.413(t，2H，Ph-H)，7.335(m，4H，Ph-H)，3.232(m，7H，OCH2，CH3)，2.884(t，2H，OCH2)，2.765(s，4H，CH2)，2.581(m，4H，CH2)，1.953(m，2H，CH2)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ:170.545(C＝O)，167.416(Ar-C＝N)，157.103，154.175，149.362，140.854，140.513，137.075，135.014，132.236，131.352，128.264，127.853，127.317，123.425，122.971，121.773，71.852，69.921，58.764，55.735，52.606，48.344，34.236，26.224，25.382。元素分析(％，C55H45N3O6S2计算值)：C 72.71(72.74)，H 5.06(4.99)，N4.68(4.63)，O 10.53(10.57)，S 7.01(7.06)；HRMS(EI)(C55H45N3O6S2计算值)，m/z：907.2753(907.2750)。
本发明的技术方案主要是将结构式为：
的双光子荧光标记探针LP用于细胞内糖链抗原活检。
其在用于细胞内糖链抗原活检的过程中包括有直接法和间接法，直接法是将抗原采用稀释缓冲液稀释至一定的浓度；再将稀释好的抗原滴加在固相载体上，以封闭缓冲液覆盖无抗原的区域，进而避免荧光指示剂的非特异性吸附；再将双光子荧光指示剂稀释至实验所需要的浓度，按照包被、封闭、一次洗涤、点样、二次洗涤、荧光标记示 踪、三次洗涤、检测的步骤标记抗体，并稀释至一定的浓度；再滴加双光子荧光标记抗体LP-Ab样品至固定有抗原的固相载体上，温育，以使抗原抗体结合，与免疫复合物充分反应后；再洗涤缓冲液冲洗固相载体三次，去除未结合样品及荧光指示剂；在双光子荧光显微镜下进行定性/定量观察。
间接法是用稀释缓冲液将抗原稀释至一定浓度；将稀释好的抗体Ab滴加至固相载体上，以封闭剂覆盖无抗原区域，避免荧光指示剂的非特异性吸附；；使用稀释缓冲液将样品稀释至一定浓度；将处理好的样品滴加至固定有抗体的固相载体上，温育，以使抗原抗体结合，形成Ab·Ag；再将双光子荧光标记抗体LP-IgG滴加至抗原抗体结合后的固相载体上，以使之与抗体结合，形成LP-IgG·Ab·Ag；再以洗脱缓冲液冲洗固相载体三次，去除未结合样品及荧光指示剂；在双光子荧光显微镜下进行定性/定量观察。
本发明的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其由双光子荧光标记探针LP、抗糖链抗原单克隆抗体-Ab、硝酸纤维素膜、抗糖链抗原单克隆抗体-IgG、阳性对照品、阴性对照品、封闭缓冲液和洗涤缓冲液组成；其中，所述的封闭缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为20mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.5％的BSA；所述的洗涤缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为50mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.05％的吐温20；
上述的荧标试剂盒用于细胞内糖链抗原活检的方法，包括以下步骤：
(1)包被：在硝酸纤维素膜上滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab，一滴一点，各点间相隔1-2cm，并滴加完成后，置于温度为4℃环境中，吸附0.5-1h；
(2)封闭：将步骤(1)包被完成的硝酸纤维素膜浸入封闭缓冲 液中，在37℃下温育0.5-2h；
(3)一次洗涤：将步骤(2)封闭完成的硝酸纤维素膜采用洗涤缓冲液清洗至少三次，静置干燥；
(4)点样：向步骤(3)一次洗涤完成的硝酸纤维素膜按照步骤(1)滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab形成的点滴加阳性样品、阴性样品和待测样品，其中阳性样品、阴性样品和待测样品滴加的点的个数相等，每点滴加2-6uL；
(5)二次洗涤：待步骤(4)滴加的样品液完全渗入硝酸纤维素膜后，室温静置10-30min，采用洗涤缓冲液清洗膜片至少三次，静置干燥；
(6)荧光标记示踪：向步骤(5)处理完成的膜片上加入双光子荧光标记抗体LP-IgG，加入量为每点滴加2-6uL，在37℃下温育处理0.5-2h；
(7)三次洗涤：将步骤(6)处理好的膜片采用洗涤缓冲液清洗至少三次，取出膜片，去除表面残余液体；
(8)检测：将硝酸纤维素膜平铺在玻璃片上，在双光子荧光显微镜下检测。
上述的阳性样品为纯化的糖链抗原Ag，其浓度为0.1-100ug/mL；阴性样品为封闭缓冲液。
上述的双光子荧光标记抗体LP-IgG，其制备方法是将摩尔质量为(1.9-2.1)×10- 5mmol的抗糖链抗原单克隆抗体-IgG溶于0.5mL的二甲基亚砜中，并采用摩尔浓度为0.1mol/L的溶液将pH调至9，将1.1×10-5mmol的双光子荧光标记探针LP加入，搅拌反应24h，得到反应混合液，加入4倍体积的乙醚稀释反应混合液，析出沉淀，过滤，得固体；再向固体中加入二甲基亚砜至固体刚好溶解为止，得溶解液； 并向溶解液中再次加入乙醚至不再有沉淀析出，过滤，干燥，得黄色固体，即为双光子荧光标记抗体LP-IgG。
上述的去除表面残余液体是采用吸水纸吸干表面残余液体。
上述的抗糖链抗原单克隆抗体-IgG，其制备方法是取4mL抗血清，并向其中加入pH值为4.0，摩尔浓度为0.06mol/L的醋酸缓冲液8mL，并采用氢氧化钠调整pH至4.8，在振荡条件下，加入120uL的正辛酸，在室温下振荡混合30min，在4℃下，10000rpm离心15min，去沉淀，并将上清液装入透析袋中，在0.01mol，pH值为7.4的PBS缓冲液中，透析12h，再加入等体积的饱和硫酸铵溶液，在4℃静置30min，再在12000rpm离心20min，取沉淀，得到抗糖链抗原单克隆抗体-IgG。
上述的抗血清是经抗糖链抗原单克隆抗体-Ab三次免疫兔48天后，对其血液进行沉淀分离得到的血清。
本发明所述的双光子荧光标记抗体LP-Ab是按照双光子荧光标记抗体LP-IgG的制备方法进行制备的，具体是是将摩尔质量为(1.9-2.1)×10-5mmol的抗糖链抗原单克隆抗体-Ab溶于0.5mL的二甲基亚砜中，并采用摩尔浓度为0.1mol/L的溶液将pH调至9，将1.1×10-5mmol的双光子荧光标记探针LP加入，搅拌反应24h，得到反应混合液，加入4倍体积的乙醚稀释反应混合液，析出沉淀，过滤，得固体；再向固体中加入二甲基亚砜至固体刚好溶解为止，得溶解液；并向溶解液中再次加入乙醚至不再有沉淀析出，过滤，干燥，得黄色固体，即为双光子荧光标记抗体LP-Ab。
本发明通过双光子荧光标记抗体LP-IgG和硝酸纤维素膜包被的固相抗体Ab，使得在检测时，固相抗体通过抗原反应特异性捕获待测抗原，形成免疫复合物Ab·Ag，加入双光子荧光标记抗体LP-IgG，与免疫复合物充分反应后(LP-IgG·Ab·Ag)，经洗涤去除非特异性物质，即可检测判定结果。
上述方法有效的将双分子荧光标记探针应用于细胞内糖链抗原活检，使得对肿瘤或者癌症标志物的糖链抗原的活检的灵敏度和稳定性提高，使得在进行检测分析时的清晰度和分辨率较高，克服了传统糖链抗原的检测方法中的灵敏度和稳定性较差，操作步骤繁琐的缺陷，并且也使得检测试样不再局限于血液和外周血，只要带有糖链抗原的试样即可用该双分子荧光标记探针LP制备成的试剂盒来进行检测。
上述采用双分子荧光标记探针LP应用于糖链抗原活检时，克服了免疫荧光法单光子荧光容易产生的光致毒、光漂白及组织自发荧光的干扰的缺陷，提高了对糖链抗原活检的灵敏度和稳定性，提高了检测结果的准确性。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例
本发明是按照以下实施例进行操作的：
采用的试剂为：Ab19-9和Ab125，上海江莱生物科技有限公司；PBS：1.35mol/LNaCl，47mmol/L KCl，100mmol/L Na2HPO4，20mmol/L NaH2PO4，pH 7.4，上海博谷生物科技有限公司；Triton X-100：聚乙二醇辛基苯基醚，CP，广州市应泓化工有限公司；EGTA：乙二醇-双(2-氨基乙醚)四乙酸，南京安培化工科技有限公司；PIPES：N,N’-双(2-乙磺酸)哌嗪，南京安培化工科技有限公司；HEPES：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸，南京安培化工科技有限公司；
另外，在试验中所使用的其他常规药品和试剂均为一般的国产分析纯或化学纯试剂。
首先按照参考文献为[Morales AR,Yanez CO,Schafer-Hales KJ,Marcus AI,Belfield KD.Biomolecule labeling and imaging with a new fluorenyl two-photonfluorescent probe.Bioconjugate Chem.,2009,20:1992–2000]公开的内容，对双光子荧光探针LP，其合成的工艺步骤为：
进而制得LP为黄色固体物质。
其次抗糖链抗原单克隆抗体IgG的制备：
具体的制备方法是：取4mL抗血清，并向其中加入pH值为4.0，摩尔浓度为0.06mol/L的醋酸缓冲液8mL，并采用氢氧化钠调整pH至4.8，在振荡条件下，加入120uL的正辛酸，在室温下振荡混合30min，在4℃下，10000rpm离心15min，去沉淀，并将上清液装入透析袋中，在0.01mol，pH值为7.4的PBS缓冲液中，透析12h，再加入等体积的饱和硫酸铵溶液，在4℃静置30min，再在12000rpm离心20min，取沉淀，得到抗糖链抗原单克隆抗体-IgG。
再者，采用纯化的糖链抗原Ag，浓度在0.1-100ug/mL的范围作为阳性样品；采用上述的封闭缓冲液作为阴性样品；
其中：封闭缓冲液的摩尔浓度为20mmol/L、pH值为7.4的PBS加入质量百分比为0.5％的BSA组成的；洗涤缓冲液为摩尔浓度为50mmol/L、pH为7.4的PBS加入质量百分比为0.05％的Tween20组成的。
制备双光子荧光标记抗体LP-IgG和双光子荧光标记抗体LP-Ab：
双光子荧光标记抗体LP-IgG，其制备方法是将摩尔质量为(1.9-2.1)×10-5mmol的抗糖链抗原单克隆抗体-IgG溶于0.5mL的二甲基亚砜中，并采用摩尔浓度为0.1mol/L的溶液将pH调至9，将1.1×10-5mmol的双光子荧光标记探针LP加入，搅拌反应24h，得到反应混合液，加入4倍体积的乙醚稀释反应混合液，析出沉淀，过滤，得固体；再向固体中加入二甲基亚砜至固体刚好溶解为止，得溶解液；并向溶解液中再次加入乙醚至不再有沉淀析出，过滤，干燥，得黄色固体，即为双光子荧光标记抗体LP-IgG。
双光子荧光标记抗体LP-Ab，其制备方法是将摩尔质量为(1.9-2.1)×10-5mmol的抗糖链抗原单克隆抗体-Ab溶于0.5mL的二甲基亚砜中，并采用摩尔浓度为0.1mol/L的溶液将pH调至9，将1.1×10-5mmol的双光子荧光标记探针LP加入，搅拌反应24h，得到反应混合液，加入4倍体积的乙醚稀释反应混合液，析出沉淀，过滤，得固体；再向固体中加入二甲基亚砜至固体刚好溶解为止，得溶解液；并向溶解液中再次加入乙醚至不再有沉淀析出，过滤，干燥，得黄色固体，即为双光子荧光标记抗体LP-Ab。
再将其按照以下的检测方法进行检测：
(1)包被：在硝酸纤维素膜上滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab，一滴一点，各点间相隔1-2cm，并滴加完成后，置于温度为4℃ 环境中，吸附0.5-1h；
(2)封闭：将步骤(1)包被完成的硝酸纤维素膜浸入封闭缓冲液中，在37℃下温育0.5-2h；
(3)一次洗涤：将步骤(2)封闭完成的硝酸纤维素膜采用洗涤缓冲液清洗至少三次，静置干燥；
(4)点样：向步骤(3)一次洗涤完成的硝酸纤维素膜按照步骤(1)滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab形成的点滴加阳性样品、阴性样品和待测样品，其中阳性样品、阴性样品和待测样品滴加的点的个数相等，每点滴加2-6uL；
(5)二次洗涤：待步骤(4)滴加的样品液完全渗入硝酸纤维素膜后，室温静置10-30min，采用洗涤缓冲液清洗膜片至少三次，静置干燥；
(6)荧光标记示踪：向步骤(5)处理完成的膜片上加入双光子荧光标记抗体LP-IgG，加入量为每点滴加2-6uL，在37℃下温育处理0.5-2h；
(7)三次洗涤：将步骤(6)处理好的膜片采用洗涤缓冲液清洗至少三次，取出膜片，去除表面残余液体；
(8)检测：将硝酸纤维素膜平铺在玻璃片上，在双光子荧光显微镜下检测。
检测后的判定标准和采用的检测仪器为：
以锁模飞秒钛蓝宝石激光器(Mira 900-F，美国Coherent公司)双光子荧光显微镜为检测仪器；并在采用肉眼进行观察时，以荧光信号的强度来进行判断，其荧光信号强度判定的标准如下：
“-”表示无荧光；
“-+”表示荧光较弱；
“+”表示荧光清晰可见；
“++”表示荧光明显可见，强度大；
“+++～++++”表示荧光非常明亮；
“-”定为阴性，“-+”定为假阳性，“+”及“+”以上的结果，均定为阳性。
并且将待测样品按照以上标准，进行定性判断分析样品检测结果的阴阳性，进而达到准确高效的检测出待测样品中的阴阳性，提高对待测试样的检测灵敏度和稳定性。
Claims (6)
1.一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，其由双光子荧光标记探针LP、抗糖链抗原单克隆抗体-Ab、硝酸纤维素膜、抗糖链抗原单克隆抗体-IgG、阳性对照品、阴性对照品、封闭缓冲液和洗涤缓冲液组成；其中，所述的封闭缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为20mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.5％的BSA；所述的洗涤缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为50mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.05％的吐温20；
双光子荧光标记探针LP，结构式为：
该荧标试剂盒用于细胞内糖链抗原活检的方法，包括以下步骤：
(1)包被：在硝酸纤维素膜上滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab，一滴一点，各点间相隔1-2cm，并滴加完成后，置于温度为4℃环境中，吸附0.5-1h；
(2)封闭：将步骤(1)包被完成的硝酸纤维素膜浸入封闭缓冲液中，在37℃下温育0.5-2h；
(3)一次洗涤：将步骤(2)封闭完成的硝酸纤维素膜采用洗涤缓冲液清洗至少三次，静置干燥；
(4)点样：向步骤(3)一次洗涤完成的硝酸纤维素膜按照步骤(1)滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab形成的点滴加阳性样品、阴性样品和待测样品，其中阳性样品、阴性样品和待测样品滴加的点的个数相等，每点滴加2-6uL；
(5)二次洗涤：待步骤(4)滴加的样品液完全渗入硝酸纤维素膜后，室温静置10-30min，采用洗涤缓冲液清洗膜片至少三次，静置干燥；
(6)荧光标记示踪：向步骤(5)处理完成的膜片上加入双光子荧光标记抗体LP-IgG，加入量为每点滴加2-6uL，在37℃下温育处理0.5-2h；
(7)三次洗涤：将步骤(6)处理好的膜片采用洗涤缓冲液清洗至少三次，取出膜片，去除表面残余液体；
(8)检测：将硝酸纤维素膜平铺在玻璃片上，在双光子荧光显微镜下检测。
2.如权利要求1所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的阳性样品为纯化的糖链抗原Ag，其浓度为0.1-100ug/mL；所述的阴性样品为封闭缓冲液。
3.如权利要求1所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的双光子荧光标记抗体LP-IgG，其制备方法是将摩尔质量为(1.9-2.1)×10-5mmol的抗糖链抗原单克隆抗体-IgG溶于0.5mL的二甲基亚砜中，并采用摩尔浓度为0.1mol/L的溶液将pH调至9，将1.1×10-5mmol的双光子荧光标记探针LP加入，搅拌反应24h，得到反应混合液，加入4倍体积的乙醚稀释反应混合液，析出沉淀，过滤，得固体；再向固体中加入二甲基亚砜至固体刚好溶解为止，得溶解液；并向溶解液中再次加入乙醚至不再有沉淀析出，过滤，干燥，得黄色固体，即为双光子荧光标记抗体LP-IgG。
4.如权利要求1所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的去除表面残余液体是采用吸水纸吸干表面残余液体。
5.如权利要求1或3所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的抗糖链抗原单克隆抗体-IgG，其制备方法是取4mL抗血清，并向其中加入pH值为4.0，摩尔浓度为0.06mol/L的醋酸缓冲液8mL，并采用氢氧化钠调整pH至4.8，在振荡条件下，加入120uL的正辛酸，在室温下振荡混合30min，在4℃下，10000rpm离心15min，去沉淀，并将上清液装入透析袋中，在0.01mol，pH值为7.4的PBS缓冲液中，透析12h，再加入等体积的饱和硫酸铵溶液，在4℃静置30min，再在12000rpm离心20min，取沉淀，得到抗糖链抗原单克隆抗体-IgG。
6.如权利要求5所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的抗血清是经抗糖链抗原单克隆抗体-Ab三次免疫兔48天后，对其血液进行沉淀分离得到的血清。
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