CN105218842B - 一种酶法制备丝素/弹性蛋白复合膜材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备丝素/弹性蛋白复合膜材料的方法，应用β‑酪氨酸酶进行丝素中氨基酸转化，增加丝素蛋白中酪氨酸残基的数量，继而借助于酪氨酸酶催化氧化丝素与弹性蛋白交联，制备出丝素/弹性蛋白复合膜。具体步骤如下：(1)丝素溶液制备；(2)添加β‑酪氨酸酶、苯酚，催化丝素中丝氨酸转化成酪氨酸；(3)丝素溶液中添加酪氨酸酶，催化氧化丝素上酪氨酸残基与弹性蛋白反应；(4)丝素/弹性蛋白风干成膜或冷冻干燥成膜。与传统化学交联法制备功能型丝素膜相比，本发明酶催化效率高、酶处理条件缓和、复合膜性能改善明显；酶法构建的丝素/弹性蛋白复合膜，不但生物相容性好，膜材料力学性能也得到改善。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法制备丝素/弹性蛋白复合膜材料的方法，特别是一种利用β-酪氨酸酶进行丝素中氨基酸转化，借助于酪氨酸酶催化丝素与弹性蛋白交联，制备复合丝素膜材料的方法，属于纺织生物技术领域。
背景技术
源于桑蚕丝的丝素蛋白有良好的生物相容性，以其为原料加工的丝素蛋白膜在医用组织工程材料构建中有较广泛的用途。弹性蛋白是一种高度交联的细胞外基质蛋白质，极难溶于水，它主要由平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及软骨细胞产生，在生物体内可与微原纤维交联形成弹性纤维，有着被动伸缩的功能，赋予所在组织、器官以伸缩性和可逆的变形能力。作为一种具有巨大发展潜力的天然生物资源，弹性蛋白有着其他合成高分子材料无法比拟的弹性、稳定性和生物相容性，使其成为生物医用材料领域中令人期待的组织工程支架。
为改善再生丝素蛋白膜材料的应用性能，可采用丝素与弹性蛋白相结合的方式，构建新型医用再生丝素蛋白材料。丝素蛋白的改性方法包括化学交联法、酶催化改性法、共混改性法等。不同丝素膜改性方法中，化学改性法应用较广泛，其基本原理是利用丝素蛋白中含有较多氨基、羟基等极性反应性基团的特点，借助于化学交联剂(如戊二醛、多元羧酸等)使丝素大分子间发生交联，或与外源功能性化合物发生接枝。这类方法在改善丝素膜性能的同时也存在一定的不足，如使用的交联剂易产生有害物质残留，产生环境污染等。近年来，随着生物技术在高分子材料改性中的研究日趋深入，以生物酶技术进行丝素材料功能化改性的研究日益受到重视。
丝素蛋白结构中，具有反应性的氨基酸残基包括丝氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸和赖氨酸等。其中，丝氨酸和酪氨酸在丝素蛋白中含量较高，两者分别含有醇羟基和酚羟基。相比而言，酪氨酸残基的反应性较高，在多酚氧化酶(漆酶或酪氨酸酶)的催化氧化下，其中的酚羟基能生成反应性较强的多巴醌，进一步引发与氨基或羟基化合物反应。由于丝素蛋白中酪氨酸残基分布于由疏水性较强的丙氨酸和甘氨酸组成的大分子链中，影响了酶促反应的可及度，因此丝素酶法接枝的效率有待提升。β-酪氨酸酶能催化苯酚与含羟甲基的丝氨酸反应生成L-酪氨酸，若借助于β-酪氨酸酶的催化作用，将丝素蛋白中含醇羟基的丝氨酸转化成具有酚羟基结构的酪氨酸，则可大大提升丝素材料的反应性，实现基于酪氨酸酶催化条件下丝素与弹性蛋白交联，制备复合蛋白膜材料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种酶法制备丝素/弹性蛋白复合膜材料的方法，所得到的复合膜材料有较好的生物相容及良好弹性，可拓展其作为医用材料的应用范畴。
为解决上述技术问题，本发明利用β-酪氨酸酶进行丝素中氨基酸转化，增加丝素蛋白中酪氨酸残基的数量；借助于酪氨酸酶催化氧化丝素与弹性蛋白交联，提高丝素/弹性蛋白复合膜材料膜的性能，具体工艺与步骤如下：
(1)丝素溶液制备：以溴化锂或氯化钙溶解桑蚕丝，制备丝素溶液；
处理工艺处方及条件：将桑蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的水溶液体系中，在30～80℃溶解后将丝素溶液装入透析袋，以去离子水中透析8～36小时后过滤，制得浓度为10～50g/L丝素溶液；
(2)β-酪氨酸酶催化氨基酸转化：在步骤(1)丝素溶液中添加β-酪氨酸酶和苯酚，催化丝素中丝氨酸转化成酪氨酸；
处理工艺处方及条件：β-酪氨酸酶1～100U/ml、苯酚1～10g/L、磷酸吡哆醛0～5g/L、氯化铵0～5g/L，温度20～60℃，pH范围6.0～9.0，处理1～48小时；处理结束后将丝素溶液以去离子水透析8～36小时；
(3)酪氨酸酶催化丝素与弹性蛋白交联：在步骤(2)丝素溶液中添加酪氨酸酶，催化氧化丝素上酪氨酸与弹性蛋白反应；
处理工艺处方及条件：酪氨酸酶1～100U/ml、弹性蛋白5～50g/L，温度20～50℃，pH范围6.0～8.0，处理1～24小时；
(4)丝素/弹性蛋白复合膜成型：取步骤(3)反应后溶液，通过延流使其在成型模具内平整铺展，在室温下风干成膜或在-50℃～-20℃条件下冷冻干燥成膜。
一种酶法制备丝素/弹性蛋白复合膜材料的方法，所述丝素溶液制备时选用溴化锂溶液、溴化锂-乙醇水溶液或氯化钙-乙醇水溶液；所述β-酪氨酸酶、酪氨酸酶品种来源于动物、植物或微生物。
本发明利用β-酪氨酸酶、酪氨酸酶的催化作用，使弹性蛋白在丝素蛋白分子表面接枝，构建丝素复合膜材料，与传统化学交联法制备丝素复合膜相比，本发明具有以下优点：
(1)酶催化效率高，在利用β-酪氨酸酶催化丝素中氨基酸转化、酪氨酸酶催化丝素与弹性蛋白交联反应中，酶催化效率高，酶制剂用量较少；
(2)酶处理条件缓和，在低温和近中性条件下制备丝素/弹性蛋白复合膜，具有能耗低、处理工艺安全的优点，避免了化学交联法反应易造成环境污染、丝素膜生物安全性低等诸多方面的缺陷；
(3)复合膜性能改善明显，利用酶法构建的丝素/弹性蛋白复合膜，不但具有良好的生物相容性，膜材料力学性能也得到了改善，在医学领域有广泛应用前景。
具体实施方式
采用β-酪氨酸酶、酪氨酸酶催化丝素和弹性蛋白交联，制备复合膜材料，具体实施例如下：
实施例1
(1)丝素溶液准备：桑蚕丝加入到溴化锂-乙醇-水(质量比45:45:10)溶液中，60℃溶解后将丝素溶液装入透析袋，在去离子水中透析24小时，期间每小时换1次水，透析后过滤得到20g/L的丝素水溶液；
(2)β-酪氨酸酶催化氨基酸转化：在步骤(1)丝素溶液中添加20U/mlβ-酪氨酸酶、5g/L苯酚、磷酸吡哆醛2g/L和氯化铵2g/L，在45℃、pH7.5条件下处理40小时；处理结束后将丝素溶液以去离子水透析24小时；
(3)酪氨酸酶催化丝素与弹性蛋白交联：在步骤(2)丝素溶液中添加10U/ml酪氨酸酶、10g/L弹性蛋白，在温度30℃、pH7.0条件下处理12小时；
(4)丝素/弹性蛋白复合膜成型：取步骤(3)反应后的溶液，通过延流使其在聚四氟乙烯(PTFE)成型模具内平整铺展，在室温下风干成膜。
丝素/弹性蛋白复合膜试样1：处理中未添加β-酪氨酸酶和酪氨酸酶；
丝素/弹性蛋白复合膜试样2：处理中添加β-酪氨酸酶和酪氨酸酶；
经上述工艺处理后，评价NIH/3T3细胞在丝素/弹性蛋白复合膜培养基中浸渍24小时后的存活率，并测定复合膜的断裂强度和断裂伸长率。结果表明，试样1的NIH/3T3细胞存活率为82％、断裂强度和断裂伸长率分别为5.0MPa、0.6％；试样2的细胞存活率为85％、断裂强度和断裂伸长率能分别达到6.3MPa、1.5％。
实施例2
(1)丝素溶液准备：桑蚕丝加入到到氯化钙-乙醇-水(摩尔比1:1:7)，70℃溶解后将丝素溶液装入透析袋，在去离子水中透析30小时，期间每小时换1次水，透析后过滤得到15g/L的丝素水溶液；
(2)β-酪氨酸酶催化氨基酸转化：在步骤(1)丝素溶液中添加10U/mlβ-酪氨酸酶、4g/L苯酚、磷酸吡哆醛1g/L和氯化铵1g/L，在温度40℃、pH8.0条件下处理30小时；处理结束后将丝素溶液以去离子水透析24小时；
(3)酪氨酸酶催化丝素与弹性蛋白交联：在步骤(2)丝素溶液中，添加8U/ml酪氨酸酶、8g/L弹性蛋白，在温度30℃、pH7.0条件下处理20小时；
(4)丝素/弹性蛋白复合膜成型：取步骤(3)反应后溶液，通过延流使其在聚四氟乙烯(PTFE)成型模具内平整铺展，在-50℃冷冻干燥成膜。
丝素/弹性蛋白复合膜试样3：处理中未添加β-酪氨酸酶和酪氨酸酶；
丝素/弹性蛋白复合膜试样4：处理中未添加β-酪氨酸酶，添加酪氨酸酶；
丝素/弹性蛋白复合膜试样5：处理中添加β-酪氨酸酶和酪氨酸酶；
经上述工艺处理后，评价NIH/3T3细胞在上述丝素/弹性蛋白复合膜培养基中浸渍24小时后的存活率，并测定复合膜的断裂强度和断裂伸长率。其中试样3测得的NIH/3T3细胞存活率为89％、断裂强度和断裂伸长率能分别达到1.9MPa、1.6％；试样4的细胞存活率为91％、断裂强度和断裂伸长率能分别达到2.3MPa、2.8％；试样5的细胞存活率为90％、断裂强度和断裂伸长率能分别达到3.1MPa、3.5％
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (2)
1.一种酶法制备丝素/弹性蛋白复合膜材料的方法，特征是一种利用β-酪氨酸酶进行丝素中氨基酸转化，借助于酪氨酸酶催化氧化丝素与弹性蛋白交联，制备复合丝素膜材料的方法，具体工艺与步骤如下：
(1)丝素溶液制备：以溴化锂或氯化钙溶解桑蚕丝，制备丝素溶液；
处理工艺处方及条件：将桑蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的水溶液体系中，在30～80℃溶解后将丝素溶液装入透析袋，以去离子水中透析8～36小时后过滤，制得浓度为10～50g/L丝素溶液；
(2)β-酪氨酸酶催化氨基酸转化：在步骤(1)丝素溶液中添加β-酪氨酸酶和苯酚，催化丝素中丝氨酸转化成酪氨酸；
处理工艺处方及条件：β-酪氨酸酶1～100U/ml、苯酚1～10g/L、磷酸吡哆醛0～5g/L、氯化铵0～5g/L，温度20～60℃，pH范围6.0～9.0，处理1～48小时；处理结束后将丝素溶液以去离子水透析8～36小时；
(3)酪氨酸酶催化丝素与弹性蛋白交联：在步骤(2)丝素溶液中添加酪氨酸酶，催化氧化丝素上酪氨酸与弹性蛋白反应；
处理工艺处方及条件：酪氨酸酶1～100U/ml、弹性蛋白5～50g/L，温度20～50℃，pH范围6.0～8.0，处理1～24小时；
(4)丝素/弹性蛋白复合膜成型：取步骤(3)反应后溶液，通过延流使其在成型模具内平整铺展，在室温下风干成膜或在-50℃～-20℃条件下冷冻干燥成膜。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述丝素溶液制备时选用溴化锂溶液、溴化锂-乙醇水溶液或氯化钙-乙醇水溶液；所述β-酪氨酸酶、酪氨酸酶来源于动物、植物或微生物。
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