CN105209623B

CN105209623B - 显性雄性不育的操纵

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Publication number: CN105209623B
Application number: CN201480012653.XA
Authority: CN
Inventors: A.M.西甘
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2034-03-12
Also published as: AU2020202241A1; WO2014164961A3; EP2970998A2; CA2903222A1; US10822614B2; US20200255848A1; US20210079411A1; US10604762B2; AU2020202241B2; US20160017365A1; US20140298510A1; EA201591690A1; CN105209623A; AU2014248841A1; AU2014248841B2; WO2014164961A2; US9803214B2; AU2023200211A1; US20180010145A1; US10113181B2

Abstract

本发明提供了用于调节植物中的雄性育性的组合物和方法。所述组合物包含调节雄性育性的核苷酸序列及其活性片段和变体。本发明还提供了表达盒，所述表达盒包含有效连接到启动子的雄性育性多核苷酸或其活性片段或变体，其中所述多核苷酸的表达调节植物的雄性育性。本发明还提供了各种方法，其中影响雄性育性的序列的水平和/或活性在植物或植物部分中得到调节。在某些实施例中，植物是多倍体植物。

Description

显性雄性不育的操纵

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地讲，涉及影响雄性育性。

背景技术

杂交植物育种的发展已使产生的作物在质量和数量方面取得相当大的进展成为可能。由于经过了杂交程序，故产量增加，所需特性的组合如对病害和虫害的抗性、耐热性和耐旱性，以及植物组成发生变化都可能出现。这些程序在很多情况下主要依赖于提供向雌性亲本贡献花粉的雄性亲本以产生所得的杂种。

大田作物通过利用植物的传粉方法的技术进行育种。如果来自植物的一朵花的花粉转移到同一植物或遗传上相同的植物的同一朵花或另一朵花，则植物自花传粉。如果花粉来自遗传上不同的植物的花，则植物异花传粉。

在某些物种中，诸如芸苔(Brassica campestris)，植物通常自体不育，并且只能够异花传粉。在自花传粉的物种中，诸如大豆和棉花，雄性和雌性植株在解剖学上是雌雄同株的。在自然传粉过程中，一朵花的雄性繁殖器官给同一朵花的雌性繁殖器官传粉。

普通小麦(Triticum aestivum)是具有限定基因组A、B和D的三对同源染色体的六倍体植物。小麦籽粒的胚乳包括来自母本细胞的2个单倍体组(haploid complement)和来自父本细胞的1个单倍体组。小麦籽粒的胚包括来自母本细胞和父本细胞中的每一者的一个单倍体组。六倍性被认为是研究和开发小麦的有用变体的过程中的重大障碍。实际上，人们对小麦的同源基因如何相互作用、如何调控这些同源基因的表达、以及由同源基因产生的不同蛋白质如何独立或协同地发挥作用方面知之甚少。

用遗传性雄性不育体系进行的大部分工作的必要方面是识别影响雄性育性的基因和与这种基因相关的启动子。这种基因和启动子可以在包括本文所述的那些体系在内的多种体系中使用以控制雄性育性。

发明内容

本发明提供了用于调节植物中的雄性育性的组合物和方法。所述组合物包含调节雄性育性的核苷酸序列及其片段和变体。本发明还提供了表达盒，该表达盒包含一种或多种有效连接到启动子的多核苷酸，其中一种或多种多核苷酸的表达调节植物的雄性育性。本发明还提供了各种方法，其中影响雄性育性的多核苷酸的水平和/或活性在植物或植物部分中得到调节。

附图说明

图1A和1B.A、B和D基因组的小麦MS45启动子区的比对(分别为SEQ ID NO：1、2和3)。还提供了共有序列(SEQ ID NO：16)。

图2.小麦MS45启动子共有序列与ZmMS45启动子区的比对。

图3.小麦MS45启动子共有序列与小麦启动子反向重复(pIR)序列的比对。

图4.通过功能获得：GOF-MF恢复育性。

图5.通过功能获得：GOF-MF；MS45恢复育性。

图6.通过功能获得：GOF-pIRMSp恢复育性。

图7.通过功能获得：GOF-pIRMSp；5126：DAM恢复育性。

具体实施方式

下文将结合附图更详细地描述本发明，附图中只显示了本发明的一些实施例，而非全部实施例。确实，这些发明可以以许多不同的形式来体现，不应被认为局限于本文给出的实施例；而是，提供这些实施例是为了使本公开内容能满足适用的法律要求。同样的编号在全文中是指同样的要素。

借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本文所述的发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。

I.雄性育性多核苷酸

本文所公开的组合物包含影响雄性育性的多核苷酸和多肽。具体地讲，提供了小麦MS45启动子序列，其包含SEQ ID NO：1、2或3所示的核苷酸序列，或其片段或变体，如SEQID NO：4或6。

有性繁殖植物发育出特用于产生雄性配子和雌性配子的特化组织。雄性配子的成功产生依赖于雄性繁殖组织的正确形成。体现植物的雄性繁殖器官的雄蕊包含各种细胞类型，包括例如花丝、花药、绒毡层和花粉。如本文所用，“雄性组织”是指有性繁殖植物中的负责产生雄性配子的特化组织。雄性组织包括但不限于雄蕊、花丝、花药、绒毡层和花粉。

成熟花粉粒形成的过程始于小孢子发生，其中性母细胞形成于花药的造孢组织中。随后是小配子发生，其中小孢子以有丝分裂的形式分裂，随后发育成小配子体或花粉粒。“雄性育性”或“雄性可育”的状态是指产生成熟花粉粒的那些植物，所述成熟花粉粒能够使雌性配子受精以产生后代。如本文所用，术语“影响雄性育性”或“调节雄性育性”是指在与合适的对照比较时植物产生成熟花粉粒的能力的任何增强或下降。“成熟花粉粒”或“成熟花粉”是指任何能够使雌性配子受精以产生后代的花粉粒。同样，术语“雄性育性多核苷酸”或“雄性育性多肽”是指调节雄性育性的多核苷酸或多肽。雄性育性多核苷酸可例如编码参与小孢子发生或小配子发生的过程的多肽。

已证实育性基因的表达以多种方式影响雄性育性。Ms22(也称Mscal)的诱变研究得到了表型为雄性不育的玉蜀黍植物，其花药不从穗伸出并且缺乏造孢组织。West andAlbertsen(1985)Maize Newsletter 59：87(West和Albertsen，1985年，《玉蜀黍时事通讯》，第59卷，第87页)；Neuffer et al.(1977)Mutants of maize.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(Neuffer等人，1977年，《玉蜀黍突变体》，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)。另参见美国专利7,919,676。

某些雄性不育基因诸如MAC1、EMS1或GNE2(Sorensen et al.(2002)Plant J.29：581-594(Sorensen等人，2002年，《植物杂志》，第29卷，第581-594页))阻止四分孢子阶段中的细胞生长。SPOROCYTELESS/NOZZLE基因中的突变在发育早期起作用，但不仅影响花药形成而且影响胚珠形成，使得植物为雄性不育和雌性不育。拟南芥(Arabidopsis)的SPOROCYTELESS基因是孢子发生的起始所必需的，并且编码新型的核蛋白(GenesDev.1999Aug 15；13(16)：2108-17(《基因和发育》，1999年8月15日，第13卷，第16期，第2108-2117页))。

已报道Ms26多肽与存在于酵母、植物和哺乳动物中的P450酶具有显著同源性。P450酶已被广泛地研究并且特征性蛋白结构域已被阐明。Ms26蛋白含有几个真核生物P450所特有的结构基序，包括血红素结合结构域FxxGxRxCxG(结构域D)、结构域A A/GGXD/ETT/S(双氧结合)、结构域B(类固醇结合)和结构域C。系统树分析揭示Ms26与存在于拟南芥(Arabidopsis thaliana)和救荒野豌豆(Vicia sativa)中的参与脂肪酸ω-羟基化作用的P450最密切相关。参见例如美国专利公布No.2012/0005792，该专利公布以引用的方式并入本文。

Ms45多核苷酸是在玉蜀黍(参见例如US 5,478,369)和小麦(2012年9月6日提交的美国临时专利申请61/697,590)中得到表征的雄性育性多核苷酸。在小孢子空泡化期间，Ms45的突变可导致小孢子发生出现中断，从而致使突变的植物雄性不育。当克隆的Ms45多核苷酸被引入到此类突变的雄性不育植物中时，该基因可补足所述突变并赋予雄性育性。克隆的Ms45基因，例如玉蜀黍或小麦或水稻的Ms45基因，也可用于补足由靶向Ms45启动子的pIR分子的表达诱导的雄性不育，如本文所描述。本文描述的某些使用MS45基因和/或启动子的实施例可用其他基因如MS26或Ms22实施。

操纵雄性育性多核苷酸在小麦中的表达的策略将需要考虑各个小麦品种的倍性水平。普通小麦是包含被指定为A、B和D的三个基因组的六倍体(N＝21)；每个基因组包含七对非同源染色体。一粒小麦品种是二倍体(N＝7)，而二粒小麦品种是四倍体(N＝14)。

本文公开了分离的或实质上纯化的核酸分子或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、或蛋白质、或它们的生物活性部分，实质上或基本上不含通常在该多核苷酸或蛋白质的天然环境中存在的、与该多核苷酸或蛋白质相伴随或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质，当通过重组技术产生时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。最优的是，“分离的”多核苷酸不含在衍生该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列(即，位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)(最佳的是蛋白质编码序列)。例如，在各个实施例中，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在衍生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。实质上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的污染性蛋白质的蛋白质制备物。当本文所公开的多肽或其生物活性部分用重组法产生时，最佳的是，培养基具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白质的化学品。

“受试植物”或“受试植物细胞”是其中已针对目的基因实现了遗传变更(诸如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。

对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型植物或植物细胞，即其基因型与用于进行导致产生该受试植物或细胞的遗传变更的起始材料相同的野生型植物或植物细胞；(b)其基因型与该起始材料相同但已用无效构建体(即用已知对目的性状没有作用的构建体，如包含标志基因的构建体)进行了转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的后代当中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与该受试植物或植物细胞相同但不被暴露于会引发目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于目的基因不被表达的条件下的该受试植物或植物细胞本身。

A.雄性育性序列的片段和变体

还提供了本发明所公开的多核苷酸的片段和变体以及由其编码的蛋白质。所谓“片段”，意指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列从而由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可编码保留该天然蛋白质的生物活性从而影响雄性育性的蛋白质片段。或者，可用作杂交探针的多核苷酸片段通常不编码保持生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段的范围可为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸并且最多至编码本文所公开的多肽的全长多核苷酸。启动子多核苷酸的片段可保留或不保留启动子功能。启动子多核苷酸的片段可用来产生在靶向该启动子的抑制构建体中有用的pIR(启动子反向重复序列，亦称发夹)。参见例如Matzke，et al.，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227(Matzke等人，2001年，《遗传学与发育新观点》，第11卷，第221-227页)；Mette et al.，EMBO J.(2000)19：5194-5201(Mette等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，2000年，第19卷，第5194-5201页)。

编码影响雄性育性的多肽的生物活性部分的多核苷酸的片段可编码至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、525或537个连续的氨基酸，或最多至存在于影响雄性育性的全长多肽中的氨基酸的总数。编码影响雄性育性的多肽的多核苷酸的可用作杂交探针或PCR引物的片段，通常不需要编码影响雄性育性的多肽的生物活性部分。

因此，如本文所公开的雄性育性多核苷酸的片段可以编码雄性育性多肽的生物活性部分，或者其可以是可使用下文所公开的方法被用作杂交探针或PCR引物的片段，或者其可以是与雄性育性多核苷酸天然相关的启动子序列的片段。雄性育性多肽的生物活性部分可通过以下所述来制备：分离本文所公开的雄性育性多核苷酸中的一者的一部分，表达雄性育性蛋白质的编码部分(例如，通过体外重组表达)，以及评估雄性育性多肽的编码部分的活性。作为雄性育性多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600或1629个核苷酸、或者最多至全长雄性育性多核苷酸中存在的核苷酸的数目。

“变体”旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸当中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。如本文所用，“天然”或“野生型”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码本文所公开的雄性育性多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然等位基因变体(如这些)可用公知的分子生物学技术进行鉴定，例如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括通过合成获得的多核苷酸，诸如那些例如通过使用定点诱变产生但仍编码雄性育性多肽的多核苷酸。通常，通过本文别处所述的序列比对程序和参数测定，本文所公开的特定多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

本文所公开的特定多核苷酸(即，参考多核苷酸)的变体还可通过比较变体多核苷酸所编码的多肽与该参考多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评估。任何两种多肽之间的序列同一性百分数可用本文别处描述的序列比对程序和参数来计算。在任何给定的本文所公开的多核苷酸对是通过比较它们编码的两种多肽所共享的序列同一性百分数进行评估的情况中，两种被编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

“变体”蛋白质旨在意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位点处缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而从该天然蛋白质衍生的蛋白质。本文所公开的变体蛋白质具有生物活性，即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性，即本文所述的雄性育性活性。这类变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。通过本文别处所述的序列比对程序和参数测定，本文所公开的雄性育性蛋白的生物活性变体将与天然蛋白的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。本文所公开的蛋白质的生物活性变体与该蛋白质可相差少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个(诸如6-10个)、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基。

本文所公开的蛋白质可通过各种方式(包括氨基酸置换、缺失、截短和插入)进行变更。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，雄性育性多肽的氨基酸序列变体和片段可通过在DNA中作出突变来制备。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域熟知的。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页)；美国专利No.4,873,192；Walker andGaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan PublishingCompany，New York)(Walker和Gaastra编辑，1983年，《分子生物学技术》(麦克米兰出版公司，纽约))以及其中引证的参考文献。有关不会影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导可在以下文献所述的模型中找到：Dayhoff et al.(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)(Dayhoff等人，1978年，《蛋白序列和结构图表集》(美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区))，将该文献以引用方式并入本文。保守置换，诸如将一个氨基酸用另一个具有相似性质的氨基酸进行交换，可能是最佳的。

因此，本文所公开的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及保持功能的DNA序列变体这两者。同样，雄性育性多肽和蛋白质涵盖天然存在的多肽以及其变型形式和修饰形式这两者。此类多核苷酸和多肽变体将继续具有所需的雄性育性活性。将在编码该变体的DNA中所作的突变一定不能将序列设置在阅读框外，并且最佳地将不会产生互补区域，该互补区域可能产生二级mRNA结构。参见EP专利申请公开No.75,444。

不期望本文所涵盖的蛋白质序列的缺失、插入和置换会造成该蛋白质特性的根本变化。然而，当在进行置换、缺失或插入之前难以预测其确切效应时，本领域技术人员将认识到该效应将通过常规的筛选测定法进行评估。即，该活性可通过测定雄性育性活性来评估。

雄性育性的增强或下降可以以多种方式来测定。本领域的普通技术人员可以通过以下所述来容易地评估变体或片段的活性：将该多核苷酸引入到对于该多核苷酸的稳定雄性不育等位基因而言为纯合的植物中，随后观察植物中的雄性组织发育。在某些实施例中，将该变体或片段多核苷酸引入到因赋予显性雄性不育的多核苷酸的表达而雄性不育的植物中。这种赋予显性雄性不育的多核苷酸可例如为针对育性基因的天然启动子的pIR，或者编码干扰繁殖组织的发育的多肽(如DAM-甲基酶或芽孢杆菌RNA酶)的多核苷酸(参见例如美国专利No.5,792,853或5,689,049；PCT/EP89/00495)。

功能性变体多核苷酸和蛋白质还涵盖由诱变和重组程序(诸如DNA改组)获得的序列和蛋白质。用这种程序，可操纵一种或多种不同的雄性育性序列以产生具有所需性质的新的雄性育性多肽。以此方式，从一组相关的多核苷酸序列产生重组多核苷酸的文库，所述相关的多核苷酸序列包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用该方法，可将编码目的结构域的序列基序在本文所公开的雄性育性多核苷酸和其他已知的雄性育性多核苷酸之间进行改组，以获得编码具有改善的目的性质(诸如在酶的情况中为提高的K_m)的蛋白质的新基因。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751(Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747-10751页)；Stemmer(1994)Nature 370：389-391(Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页)；Crameri et al.(1997)NatureBiotech.15：436-438(Crameri等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第436-438页)；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272：336-347(Moore等人，1997年，《分子生物学杂志》，第272卷，第336-347页)；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)；Crameri et al.(1998)Nature 391：288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页)以及美国专利No.5,605,793和No.5,837,458。

II.序列分析

如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的情形中是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调序列同一性百分数以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城(Mountain View，California)的Intelligenetics公司)中所执行那样进行计算。

本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在该比较窗口中的部分与参比序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算所述百分数：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。

除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用采用以下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：使用GAP权重50和长度权重3及nwsgapdna.cmp打分矩阵，获得核苷酸序列的同一性百分数和相似性百分数；使用GAP权重8和长度权重2及BLOSUM62打分矩阵，获得氨基酸序列的同一性百分数和相似性百分数。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两条所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的对应的比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。

术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。本文所公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。

III.表达盒

本文所公开的雄性育性多核苷酸可在表达盒中提供，以用于在目的生物体中表达。表达盒可包含有效连接到本文所公开的雄性育性多核苷酸的5′和3′调控序列。“有效连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸与调控序列(例如，启动子)之间的有效连接是可使该目的多核苷酸得以表达的功能性连接。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓有效连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。

本文所公开的表达盒在5′-3′转录方向上可包含在宿主细胞(即，植物)中起作用的转录和翻译起始区(即，启动子)、目的多核苷酸、以及转录和翻译终止区(即，终止区)。表达盒还提供有多个限制性位点和/或重组位点，以使雄性育性多核苷酸的插入处于本文别处所述的调控区的转录调控之下。调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或目的多核苷酸对于宿主细胞而言或彼此之间可以是天然的/同功的。或者，调控区和/或目的多核苷酸对于宿主细胞而言或彼此之间可以是异源的。如本文所用，指涉多核苷酸或多肽序列的“异源”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预从其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。例如，有效连接到异源多核苷酸的启动子来自于与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/类似的物种的话，一者或两者实质上从它们的原始形式和/或基因座修饰而得，或者该启动子不是该被有效连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用，嵌合多核苷酸包括与转录起始区有效连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。

在某些实施例中，本文所公开的多核苷酸可与本文别处所公开的目的多核苷酸序列或表达盒的任何组合进行堆叠。例如，本文所公开的雄性育性多核苷酸可与本文别处所公开的编码雄性配子破坏性多核苷酸或多肽、细胞毒素、标记、或其他雄性育性序列的任何其他多核苷酸堆叠。堆叠的多核苷酸可有效连接到与雄性育性多核苷酸相同的启动子，或者可有效连接到另外的启动子多核苷酸。

如本文别处所述，表达盒可包含有效连接到目的多核苷酸的启动子，连同对应的终止区。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于有效连接的目的雄性育性多核苷酸或雄性育性启动子序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以源自另一来源(即，外来的或异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因与发育》，第5卷，第141-149页)；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe et al.(1990)Gene 91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)；以及Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。

如适当的话，可对目的多核苷酸进行优化以使其在转化的植物中的表达提高。也就是说，可使用植物偏好的密码子来合成多核苷酸，以改进表达。有关宿主偏好的密码子用法的讨论，参见例如Campbell and Gowri (1990)Plant Physiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。本领域可获得用于合成植物偏好的基因的方法。参见例如美国专利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，所述专利和文献以引用方式并入本文。

已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类得到充分表征的可能有害于基因表达的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免可预见的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130(ElroyStein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie et al.(1995)Gene 165(2)：233-238(Gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页))；MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)(Johnson et al.(1986)Virology 154：9-20(Johnson等人，1986年，《病毒学》，第154卷，第9-20页))和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling et al.(1987)Nature 325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie et al.(1989)in Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，载于《RNA的分子生物学》，Cech编辑，Liss，纽约，第237-256页))；以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel et al.(1991)Virology 81：382-385)(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页)。另参见Della-Cioppa etal.(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。也可利用其他已知的用于增强翻译的方法，例如内含子等等。

在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如，转换和颠换)。

A.包含雄性育性多核苷酸的表达盒

在特定实施例中，本文所公开的表达盒包含有效连接到雄性育性多核苷酸的启动子、或其活性片段或变体，如本文所公开。在某些实施例中，本文所公开的雄性育性启动子或其活性片段或变体有效连接到本文所公开的雄性育性多核苷酸或其活性片段或变体。

在某些实施例中，植物启动子可优先地在某些组织(诸如雄蕊、花药、花丝和花粉)或发育生长阶段(诸如造孢组织、小孢子和小配子体)中起始转录。这种植物启动子称为“组织偏好的”、“细胞类型偏好的”或“生长阶段偏好的”。仅在某些组织中起始转录的启动子称为“组织特异性的”。同样，仅在某些生长阶段起始转录的启动子称为“生长阶段特异性的”。“细胞类型特异性”启动子仅在一种或多种器官中的某些细胞类型中驱动表达，例如雄蕊细胞，或雄蕊内的单独细胞类型如花药、花丝或花粉细胞。

本文所公开的雄性育性多核苷酸及其活性片段和变体可有效连接到雄性组织特异性的或雄性组织偏好的启动子，包括例如雄蕊特异性的或雄蕊偏好的启动子、花药特异性的或花药偏好的启动子、花粉特异性的或花粉偏好的启动子、绒毡层特异性的启动子或绒毡层偏好的启动子，等等。可基于所需的结果来选择启动子。例如，目的多核苷酸可有效连接到组成型启动子、组织偏好的启动子、生长阶段偏好的启动子或其他启动子，以在植物中表达。

在一个实施例中，启动子可以是在植物的雄性组织中优先地表达目的多核苷酸的那些启动子。该过程中没有一定要使用特定的雄性育性组织偏好的启动子，而是可以使用本领域的技术人员已知的许多此类启动子中的任一种。一个这种启动子为5126启动子，其优先地将其所连接的多核苷酸的表达引导向植物的雄性组织，如在美国专利No.5,837,851和No.5,689,051中所述。其他例子包括美国专利No.6,037,523中描述的玉蜀黍Ms45启动子；美国专利No.6,452,069中描述的SF3启动子；WO 02/063021中描述的BS92-7启动子；美国专利No.5,470,359中描述的SGB6调节元件；TA29启动子(Koltunow，et al.，(1990)PlantCell 2：1201-1224(Koltunow等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1201-1224页)；Goldberg，et al.，(1993)Plant Cell 5：1217-1229(Goldberg等人，1993年，《植物细胞》，第5卷，第1217-1229页)和美国专利No.6,399,856)；2型金属硫蛋白样基因启动子(Charbonnel-Campaa，et al.，Gene(2000)254：199-208(Charbonnel-Campaa等人，《基因》，2000年，第254卷，第199-208页))以及芸苔属Bca9启动子(Lee，et al.，(2003)Plant CellRep.22：268-273(Lee等人，2003年，《植物细胞报道》，第22卷，第268-273页))。

在一些实施例中，表达盒包含有效连接到雄性育性多核苷酸的雄性配子偏好的启动子。雄性配子偏好的启动子包括PG47启动子(US 5,412,085；US 5,545,546；Plant J 3(2)：261-271(1993)(《植物杂志》，第3卷，第2期，第261-271页，1993年))，以及ZM13启动子(Hamilton，et al.，(1998)Plant Mol.Biol.38：663-669(Hamilton等人，1998年，《植物分子生物学》，第38卷，第663-669页)；肌动蛋白解聚因子启动子(如Zmabp1、Zmabp2；参见例如Lopez，et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7415-7420(Lopez等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第7415-7420页)；玉蜀黍果胶甲酯酶样基因ZmC5的启动子(Wakeley，et al.，(1998)Plant Mol.Biol.37：187-192(Wakeley等人，1998年，《植物分子生物学》，第37卷，第187-192页))；肌动蛋白抑制蛋白基因启动子Zmprol(Kovar，et al.，(2000)The Plant Cell 12：583-598(Kovar等人，2000年，《植物细胞》，第12卷，第583-598页))；硫酸化五肽植物磺肽素基因ZmPSK1(Lorbiecke，et al.，(2005)Journal ofExperimental Botany 56(417)：1805-1819(Lorbiecke等人，2005年，《实验植物学杂志》，第56卷，第417期，第1805-1819页))；钙调蛋白结合蛋白Mpcbp的启动子(Reddy，et al.，(2000)J.Biol.Chem.275(45)：35457-70(Reddy等人，2000年，《生物化学杂志》，第275卷，第45期，第35457-70页))。

如本文所公开，组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子以及WO 99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odellet al.(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten etal.(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)，等等。其他组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149；No.5,608,144；No.5,604,121；No.5,569,597；No.5,466,785；No.5,399,680；No.5,268,463；No.5,608,142；和No.6,177,611。

“种子偏好的”启动子包括在种子发育期间活跃的那些启动子(诸如种子贮藏蛋白的启动子)以及在种子萌发期间活跃的那些启动子。参见Thompson et al.(1989)BioEssays 10：108(Thompson等人，1989年，《生物学论文集》，第10卷，第108页(该文献以引用方式并入本文)。这种种子偏好的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息基因启动子)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白基因启动子)；milps(肌醇-1-磷酸合成酶基因启动子)(参见WO 00/11177和美国专利No.6,225,529；将这两篇文献以引用的方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白-1(Glob-1)基因启动子是代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、22kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、27kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、γ-玉米醇溶蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。另参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好启动子；该专利以引用方式并入本文。另外的胚特异性启动子在如下文献中公开：Sato et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：8117-8122(Sato等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第8117-8122页)；Nakase et al.(1997)PlantJ 12：235-46(Nakase等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第235-46页)；和Postma-Haarsmaet al.(1999)Plant Mol.Biol.39：257-71(Postma-Haarsma等人，1999年，《植物分子生物学》，第39卷，第257-71页)。另外的胚乳特异性启动子在如下文献中公开：Albani et al.(1984)EMBO 3：1405-15(Albani等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第1405-15页)；Albani et al.(1999)Theor.Appl.Gen.98：1253-62(Albani等人，1999年，《理论与应用遗传学》，第98卷，第1253-62页)；Albani et al.(1993)Plant J.4：343-55(Albani等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第343-55页)；Mena et al.(1998)The Plant Journal116：53-62(Mena等人，1998年，《植物杂志》，第116卷，第53-62页)；以及Wu et al.(1998)Plant Cell Physiology 39：885-889(Wu等人，1998年，《植物细胞生理学》，第39卷，第885-889页)。

分裂细胞或分生组织偏好的启动子已在如下文献中公开：Ito et al.(1994)Plant Mol.Biol.24：863-878(Ito等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第863-878页)；Reyad et al.(1995)Mo.Gen.Genet.248：703-711(Reyad等人，1995年，《分子遗传学与普通遗传学》，第248卷，第703-711页)；Shaul et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：4868-4872(Shaul等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第4868-4872页)；Ito etal.(1997)Plant J.11：983-992(Ito等人，1997年，《植物杂志》，第11卷，第983-992页)；以及Trehin et al.(1997)PlantMol.Biol.35：667-672(Trehin等人，1997年，《植物分子生物学》，第35卷，第667-672页)。

胁迫诱导型启动子包括盐/水胁迫诱导型启动子，诸如P5CS(Zang et al.(1997)Plant Sciences 129：81-89(Zang等人，1997年，《植物科学》，第129卷，第81-89页))；低温诱导型启动子，如cor15a(Hajela et al.(1990)Plant Physiol.93：1246-1252(Hajela等人，1990年，《植物生理学》，第93卷，第1246-1252页))，cor15b(Wlihelm et al.(1993)Plant Mol Biol 23：1073-1077(Wlihelm等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1073-1077页))，wsc120(Ouellet et al.(1998)FEBS Lett.423-324-328(Ouellet等人，1998年，《欧洲生化学会联合会快报》，423-324-328))，ci7(Kirch et al.(1997)Plant MolBiol.33：897-909(Kirch等人，1997年，《植物分子生物学》，第33卷，第897-909页))，ci21A(Schneider et al.(1997)Plant Physiol.113：335-45(Schneider等人，1997年，《植物生理学》，第113卷，第335-45页))；干旱诱导型启动子，如Trg-31(Chaudhary et al(1996)Plant Mol.Biol.30：1247-57(Chaudhary等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第1247-57页))，rd29(Kasuga et al.(1999)Nature Biotechnology 18：287-291(Kasuga等人，1999年，《自然生物技术》，第18卷，第287-291页))；渗透诱导型启动子，如Rab17(Vilardell et al.(1991)Plant Mol.Biol.17：985-93(Vilardell等人，1991年，《植物分子生物学》，第17卷，第985-93页)和渗透蛋白(Raghothama et al.(1993)Plant Mol Biol23：1117-28(Raghothama等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1117-28页))；以及热诱导型启动子，如热休克蛋白(Barros et al.(1992)Plant Mol.19：665-75(Barros等人，1992年，《植物分子生物学》，第19卷，第665-75页)；Marrs et al.(1993)Dev.Genet.14：27-41(Marrs等人，1993年，《发育遗传学》，第14卷，第27-41页))，和smHSP(Waters et al.(1996)J.Experimental Botany 47：325-338(Waters等人，1996年，《实验植物学杂志》，第47卷，第325-338页))。其他胁迫诱导型启动子包括rip2(美国专利No.5,332,808和美国专利公开No.2003/0217393)和rp29a(Yamaguchi-Shinozaki et al.(1993)Mol.Gen.Genetics 236：331-340(Yamaguchi-Shinozaki等人，1993年，《分子遗传学与普通遗传学》，第236卷，第331-340页))。

如本文别处所述，包含雄性育性多核苷酸的表达盒可与其他目的多核苷酸堆叠。任何目的多核苷酸均可与雄性育性多核苷酸堆叠，包括例如雄性配子破坏性多核苷酸和标记多核苷酸。

本文所公开的雄性育性多核苷酸可堆叠在包含有效连接到具有雄性配子破坏性的多核苷酸的启动子的表达盒中或与所述表达盒堆叠；所述多核苷酸即干扰雄性配子的功能、形成或传播的多核苷酸。可通过多种方法中的任一种来操作雄性配子破坏性多核苷酸以阻止雄性配子的功能、形成或传播。以举例而非限制的方式，这可包括使用这样的多核苷酸，其编码基因产物如DAM-甲基化酶或芽孢杆菌RNA酶(参见例如，美国专利No.5,792,853或5,689,049；PCT/EP89/00495)；编码干扰淀粉累积或影响花粉中的渗透平衡的基因产物(参见例如，美国专利No.7,875,764、8,013,218、7,696,405)；抑制对于雄性配子的功能、形成或传播重要的基因产物的形成(参见例如美国专利No.5,859,341、6,297,426)；编码与另一种基因产物结合以阻止雄性配子的形成或功能的基因产物(参见美国专利No.6,162,964、6,013,859、6,281,348、6,399,856、6,248,935、6,750,868、5,792,853)；与对雄性配子的功能、形成或传播至关重要的基因反义，或导致所述基因的共抑制(参见美国专利No.6,184,439、5,728,926、6,191,343、5,728,558、5,741,684)；通过使用发夹式形成物干扰雄性育性多核苷酸的表达(Smith et al.(2000)Nature 407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)；WO 99/53050和WO 98/53083；Matzke，et al.，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227(Matzke等人，2001年，《遗传学与发育新观点》，第11卷，第221-227页)；另参见Scheid，et al.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99：13659-13662(Scheid等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第13659-13662页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nature Reviews Genetics 4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然评论遗传学》，第4卷，第29-38页)；Aufsaftz，et al.，(2002)Proc.Nat’l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506(Aufsaftz等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第4期，第16499-16506页)；Sijen，et al.，(2001)Curr.Biol.11：436-440(Sijen等人，2001年，《当代生物学》，第11卷，第436-440页)等。

雄性配子破坏性多核苷酸包括显性负基因，诸如甲基化酶基因和生长抑制基因。参见美国专利No.6,399,856。显性负基因包括白喉毒素A链基因(Czako and An(1991)Plant Physiol.95 687-692(Czako和An，1991年，《植物生理学》，第95卷，第687-692页)；Greenfield et al.(1983)PNAS 80：6853(Greenfield等人，1983年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第6853页))；细胞分裂周期突变体，如玉蜀黍中的CDC(Colasanti et al.(1991)PNAS 88：3377-3381(Colasanti等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第3377-3381页))；WT基因(Farmer et al.(1994)Mol.Genet.3：723-728(Farmer等人，1994年，《分子遗传学》，第3卷，第723-728页))；和P68(Chen et al.(1991)PNAS 88：315-319(Chen等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第315-319页))。

雄性配子破坏性多核苷酸的另外的例子包括但不限于来自菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthermi)的果胶裂解酶基因pelE(Kenn et al(1986)J.Bacteriol.168：595(Kenn等人，1986年，《细菌学杂志》，第168卷，第595页))；来自苏云金杆菌以色列变种(Bacillusthuringiensis Israeliensis)的CytA毒素基因(McLean et al(1987)J.Bacteriol.169：1017(1987)(McLean等人，1987年，《细菌学杂志》，第169卷，第1017页，1987年)，美国专利No.4,918,006)；DNA酶、RNA酶、蛋白酶或表达反义RNA的多核苷酸。雄性配子破坏性多核苷酸可编码涉及抑制花粉和柱头的相互作用、花粉管生长、受精或它们的组合的蛋白质。

本文所公开的雄性育性多核苷酸可与本文所公开的表达盒堆叠，所述表达盒包含有效连接到编码报道分子或标记产物的目的多核苷酸的启动子。本领域已知的合适报道分子多核苷酸的例子可见于例如以下文献：Jefferson et al.(1991)in Plant MolecularBiology Manual，ed.Gelvin et al.(Kluwer Academic Publishers)，pp.1-33(Jefferson等人，1991年，载于《植物分子生物学手册》，Gelvin等人编辑，克吕维尔学术出版社，第1-33页)；DeWet et al.Mol.Cell.Biol.7：725-737(1987)(DeWet等人，《分子与细胞生物学》，第7卷，第725-737页，1987年)；Goff et al.EMBO J.9：2517-2522(1990)(Goff等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，第9卷，第2517-2522页，1990年)；Kain et al.BioTechniques 19：650-655(1995)(Kain等人，《生物技术》，第19卷，第650-655页，1995年)；以及Chiu etal.Current Biology 6：325-330(1996)(Chiu等人，《当代生物学》，第6卷，第325-330页，1996年)。在某些实施例中，目的多核苷酸编码选择性报道分子。这些多核苷酸可包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的多核苷酸。合适的选择性标记多核苷酸的例子包括但不限于编码对氯霉素、甲氨蝶呤、潮霉素、链霉素、壮观霉素、博来霉素、磺酰胺、溴苯腈、草甘膦和膦丝菌素的抗性的基因。

在一些实施例中，本文公开的表达盒包含编码可评分的或可筛选的标记的目的多核苷酸，其中所述多核苷酸的存在产生可测量的产物。例子包括β-葡糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，其编码各种显色底物已知的酶(例如，美国专利No.5,268,463和No.5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶和碱性磷酸酶。其他可筛选的标记包括花青素/类黄酮多核苷酸，包括例如编码调控植物组织中花青素色素(红色)的产生的产物的R-基因座多核苷酸，控制类黄酮色素的生物合成的基因，诸如玉蜀黍C1和C2、B基因、p1基因和bronze基因座基因等。由目的多核苷酸编码的合适的标记的另外的例子包括青色荧光蛋白(CYP)基因、黄色荧光蛋白基因、编码荧光素酶的发光基因(其存在可使用例如，X光片、闪烁计数、荧光光度法、微光摄像机、光子计数照相机或多孔发光测定法来检测)、绿色荧光蛋白(GFP)和DsRed2(Clontechniques(《克隆技术》)，2001年)，其中用标记基因转化的植物细胞为红色，并因而为视觉上可选择的。另外的例子包括编码各种显色底物(例如，PADAC、显色头孢菌素)已知的酶的p-内酰胺酶基因、编码可转化显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶的xylE基因、α-淀粉酶基因和编码能够将酪氨酸氧化为多巴和多巴醌(其继而缩合以形成易于检测的化合物黑色素)的酶的酪氨酸酶基因。

表达盒还可包含用于选择转化的细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(Su et al.(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术与生物工程》，第85卷，第610-9页)和Fetter et al.(2004)Plant Cell 16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-28页))，青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-54页))和Kato et al.(2002)Plant Physiol 129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-42页))和黄色荧光蛋白(得自Evrogen公司的PhiYFP^TM，参见Bolte et al.(2004)J.CellScience 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-54页))。对于另外的选择性标记，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton等人，1992年，《生物技术新观点》，第3卷，第506-511页)；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao et al.(1992)Cell 71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley et al.(1980)in The Operon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页)；Hu et al.(1987)Cell48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown et al.(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge et al.(1988)Cell52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA 86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschle et al.(1990)Science 248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，Universtty of Heidelberg(Gossen，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子与细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子结构生物学主题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂与化学疗法》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University ofHeidelberg(Bonin，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂与化学疗法》，第36卷，第913-919页)；Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，施普林格出版社，柏林)；Gill et al.(1988)Nature 334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。这些公开内容以引用的方式并入本文。以上选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因均可用于本文所公开的组合物和方法中。

在一些实施例中，本文所公开的表达盒包含编码有效连接到第一启动子多核苷酸的雄性育性多核苷酸的第一目的多核苷酸，该第一目的多核苷酸与编码有效连接到雄性组织偏好的启动子多核苷酸的雄性配子破坏性基因产物的第二目的多核苷酸堆叠。在其他实施例中，本文所述的表达盒还可以与编码有效连接到第三启动子多核苷酸的标记多核苷酸的第三目的多核苷酸堆叠。

在特定实施例中，本文所公开的表达盒包含编码本文所公开的有效连接到启动子的小麦雄性育性基因的第一目的多核苷酸，所述启动子可为组织偏好的启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。表达盒还可以包含编码有效连接到雄性组织偏好的启动子的雄性配子破坏性基因产物的第二目的多核苷酸。在某些实施例中，本文所公开的表达盒还可以包含编码有效连接到组成型启动子(诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子)的标记基因(诸如来自产绿色链霉菌(Streptomyces viridochomagenes)的膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)基因)的第三目的多核苷酸。

IV.植物

A.具有改变的雄性育性多肽的水平/活性的植物

还提供了具有改变的雄性育性多肽的水平和/或活性和/或改变的雄性育性水平的植物。在一些实施例中，本文所公开的植物已在它们的基因组中稳定地掺入了如本文所公开的异源雄性育性多核苷酸或其活性片段或变体。因此，提供了这样的植物、植物细胞、植物部分和种子，它们包含本文所公开的如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的任一者示出的至少一种异源雄性育性多核苷酸或任何有用片段或变体。

还提供了包含本文所公开的表达盒的植物，该表达盒包含有效连接到在植物中有活性的启动子的雄性育性多核苷酸。在一些实施例中，雄性育性多核苷酸的表达调节植物的雄性育性。在某些实施例中，雄性育性多核苷酸的表达增强植物的雄性育性。例如，提供了包含这样的表达盒的植物，该表达盒包含有效连接到启动子的如SEQ ID NO：8示出的MS45多核苷酸或其活性片段或变体。当Ms45多核苷酸表达时，植物的雄性育性增强。

在某些实施例中，向雄性不育植物提供表达盒，该表达盒包含如本文所公开的有效连接到在植物中有活性的启动子的异源雄性育性多核苷酸、或其活性片段或变体。当异源雄性育性多核苷酸表达时，植物的雄性育性得到恢复。在特定实施例中，本文所公开的植物包含具有如本文所公开的有效连接到启动子的异源雄性育性多核苷酸、或其活性片段或变体的表达盒，该表达盒与包含有效连接到在植物中有活性的启动子的目的多核苷酸的一个或多个表达盒堆叠。例如，目的堆叠多核苷酸可包括雄性配子破坏性多核苷酸和/或标记多核苷酸。

本文所公开的植物还可以包含本文所述的具有至少两种多核苷酸的堆叠表达盒，使得所述至少两种多核苷酸在超过50％的减数分裂中(即，不是随机地)被一起继承。因此，当包含具有两种多核苷酸的堆叠表达盒的植物或植物细胞发生减数分裂时，所述两种多核苷酸分离到同一个后代(子系)细胞中。这样，堆叠的多核苷酸将很可能在它们被呈递至的任何细胞中一起表达。例如，植物可以包含具有雄性育性多核苷酸的表达盒，该表达盒与包含雄性配子破坏性多核苷酸的表达盒堆叠，使得雄性育性多核苷酸和雄性配子破坏性多核苷酸被一起继承。特别地，雄性不育植物可以包含具有本文所公开的有效连接到组成型启动子的雄性育性多核苷酸的表达盒，该表达盒与包含有效连接到雄性组织偏好启动子的雄性配子破坏性多核苷酸的表达盒堆叠，使得所述植物产生成熟的花粉粒。然而，在这种植物中，具有雄性育性多核苷酸的花粉子细胞的发育将受到雄性配子破坏性多核苷酸的表达影响。

B.植物和引入方法

如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分中完好的植物细胞，所述植物部分诸如为胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药、谷粒等。如本文所用，“谷粒”意指商业种植者出于栽培或繁殖物种以外的目的生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，前提条件是这些部分包含所引入的核酸序列。

本文所公开的方法包括将多肽或多核苷酸引入植物细胞。“引入”旨在意指以使得多核苷酸或多肽的序列得以进入细胞内部的方式将多核苷酸或多肽呈递到植物。本文所公开的方法不依赖于将序列引入宿主细胞的具体方法，只要多核苷酸或多肽可进入宿主的至少一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸或多肽引入宿主细胞(即，植物)的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。在一些实施例中，通过与另一植物有性杂交将多核苷酸引入到植物。例如，将包含目的多核苷酸的花粉转移到受体植物的柱头，以产生包含该目的多核苷酸的后代。

“稳定转化”旨在意指被引入宿主(即，植物)的核苷酸构建体整合到了植物的基因组中，并能够被其后代继承。“瞬时转化”旨在意指多核苷酸被引入宿主(即，植物)并短暂表达，或者多肽被引入宿主(即，植物)。

转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的方案，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而异。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔法(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页)、农杆菌介导的转化(Townsend等人，美国专利No.5,563,055；Zhao等人，美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页)和弹道粒子加速(参见例如Sanford等人，美国专利No.4,945,050；Tomes等人，美国专利No.5,879,918；Tomes等人，美国专利No.5,886,244；Bidney等人，美国专利No.5,932,782；Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment，”in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，“通过微粒轰击直接将DNA转移进完整植物细胞中”，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑(施普林格出版社，柏林))；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)；和Lecl转化(WO 00/28058)。另参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年度评论》，第22卷，第421-477页)；Sanford etal.(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论与应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta et al.1990)Biotechnology 8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；Tomes，美国专利No.5,240,855；Buising等人，美国专利No.5,322,783和No.5,324,646；Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into IntactPlant Cells via Microprojectile Bombardment，”in Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：FundamentalMethods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，“通过微粒轰击向完整植物细胞中直接转移DNA”，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg编辑，施普林格出版社，柏林)(玉蜀黍)；Klein et al.(1988)PlantPhysiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；Bowen等人，美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet et al.(1985)in The ExperimentalManipulatton of Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操纵》，Chapman等人编辑，朗文出版社，纽约，第197-209页)(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(晶须介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell 4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)和Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年检》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda et al.(1996)NatureBiotechnology 14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀黍)；全部上述文献以引用的方式并入本文。

本领域技术人员可获知小麦转化方案。参见例如，He et al.(2010)J.Exp.Botany61(6)：1567-1581(He等人，2010年，《实验植物学杂志》，第61卷，第6期，第1567-1581页)；Wuet al.(2008)Transgenic Res.17：425-436(Wu等人，2008年，《转基因研究》，第17卷，第425-436页)；Nehra et al.(1994)Plant J.5(2)：285-297(Nehra等人，1994年，《植物杂志》，第5卷，第2期，第285-297页)；Rasco-Gaunt et al.(2001)J.Exp.Botany 52(357)：865-874(Rasco-Gaunt等人，2001年，《实验植物学杂志》，第52卷，第357期，第865-874页)；Razzaq et al.(2011)African J.Biotech.10(5)：740-750(Razzaq等人，2011年，《非洲生物技术杂志》，第10卷，第5期，第740-750页)。另参见Tamás-Nyitrai，et al.(2012)Biolistic-and Agrobacterium-Mediated Transformation Protocols for Wheat in Plant Cell Culture Protocols，Methods in Molecular Biology 877：357-384(Tamás-Nyitrai等人，2012年，“生物射弹和农杆菌介导的小麦转化方案”，载于《分子生物学方法》的分册《植物细胞培养方案》，第877卷，第357-384页)。

在具体的实施例中，可以使用多种瞬时转化方法为植物提供本文所公开的雄性育性多核苷酸或表达盒。此类瞬时转化方法包括但不限于直接向植物中引入雄性育性多肽或其变体和片段，或者向植物中引入雄性育性转录物。这类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见例如Crossway et al.(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学与普通遗传学》，第202卷，第179-185页)；Nomura et al.(1986)PlantSci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)和Hush et al.(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，以上所有文献以引用方式并入本文。或者，可以使用本领域已知的技术将本文所公开的雄性育性多核苷酸或表达盒瞬时转化到植物中。此类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免DNA随后释放的方式进行沉淀。因此，可能从粒子结合的DNA发生转录，但将它释放出来以整合进基因组中的频率大大降低。这种方法包括使用包被有聚乙基亚胺(PEI；Sigma#P3143)的粒子。

在其他实施例中，通过使植物与病毒或病毒核酸接触，可以将本文所公开的雄性育性多核苷酸或表达盒引入植物中。一般来讲，此类方法涉及将本文所公开的核苷酸构建体掺入到病毒DNA或RNA分子内部。认识到，本文所公开的雄性育性序列可最初作为病毒聚蛋白的一部分来合成，其随后可通过体内或体外蛋白水解进行加工，由此产生所需的重组蛋白。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、No.5,316,931，和Porta et al.(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页)；以上专利和文献以引用方式并入本文。

用于在植物基因组中特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，将多核苷酸插入在所需的基因组位置是用位点特异性重组系统来实现的。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些专利以引用方式并入本文。简而言之，可将本文所公开的多核苷酸包含在旁侧分布有两个不相同的重组位点的转移盒中。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点在旁侧分布有与该转移盒的所述位点对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，将转移盒整合在该靶标位点处。目的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置处。

可以根据常规方式将已转化的细胞培育成植物。这些植物称为T0植物。参见例如，McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可使这些植物生长，用相同的转化植株或不同的植株进行传粉，所得的后代具有所鉴定的所需表型特征的所需表达。可以培育两代或更多代(例如T1、T2、T3)以确保所需表型特性的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以此方式，本发明提供在其基因组中稳定掺入了本文所公开的雄性育性多核苷酸(例如本文所公开的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。包含本文所公开的任何表达盒的种子可根据尺寸参数分选，所述尺寸参数包括但不限于种子长度、种子宽度、种子密度、种子颜色或它们的任何组合。

本文所公开的雄性育性多核苷酸和表达盒可用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物物种的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属物种(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghum vulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia ibtegrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜类、观赏植物类、草类和针叶树类。

在特定实施例中，将小麦植物用于本文所公开的方法和组合物中。如本文所用，术语“小麦”是指小麦属(Triticum)的任何物种，包括其亲代以及通过与其他物种进行杂交而得到的其后代。小麦包括“六倍体小麦”和“四倍体小麦”，前者具有AABBDD的基因组结构、由42条染色体构成，后者具有AABB的基因组结构、由28条染色体构成。六倍体小麦包括普通小麦(T.aestivum)、斯佩耳特小麦(T.spelta)、摩卡小麦(T.mocha)、密穗小麦(T.compactum)、印度圆粒小麦(T.sphaerococcum)、瓦维洛夫小麦(T.vavilovii)，以及它们的种间杂交品种。四倍体小麦包括硬粒小麦(T.durum)(也称为硬质小麦或Triticumturgidum ssp.durum)、野生二粒小麦(T.dicoccoides)、栽培二粒小麦(T.dicoccum)、波兰小麦(T.polonicum)，以及它们的种间杂交品种。此外，术语“小麦”包括六倍体或四倍体小麦属物种的可能亲代，诸如提供A基因组的乌拉尔图小麦(T.uartu)、栽培一粒小麦(T.monococcum)或野生一粒小麦(T.boeoticum)，提供B基因组的拟斯卑尔托山羊草(Aegilops speltoides)，以及提供D基因组的粗山羊草(T.tauschii)(也称为节节麦(Aegilops squarrosa)或Aegilops tauschii)。用于本发明中的小麦栽培种可属于但不限于上文列出物种中的任一种。还涵盖了通过常规技术使用小麦属物种作为亲本与非小麦属物种进行有性杂交产生的植物，所述非小麦属物种诸如黑麦(Secale cereale)，包括但不限于黑小麦。在一些实施例中，小麦植物适用于具有本领域技术人员已知的合适农学特性的谷物(诸如六倍体小麦或硬质小麦的商业品种)的商业生产。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员诸如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。

可用于实施本发明方法和组合物的针叶树类包括例如松树类，如厚皮刺果松(Pinus taeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinus radiata)；黄杉(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(true firs)如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；和雪松如西部红雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。在特定实施例中，本文所公开的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施例中，玉米植物是最佳的。

其他目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。

通常，中间宿主细胞将被用于实施本文所公开的方法和组合物，以增加克隆载体的拷贝数。随着拷贝数增加，可分离极大数量的含有目的核酸的载体来引入所需的植物细胞中。在一个实施例中，采用不会引起所述多肽在细菌中的表达的植物启动子。

原核生物最通常由大肠杆菌的多种菌株代表；然而，也可使用其他微生物株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合序列的常用原核控制序列，包括例如以下的常用启动子：β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang et al.(1977)Nature 198：1056(Chang等人，1977年，《自然》，第198卷，第1056页))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)(Goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057页)和λ衍生的P L启动子以及N-基因核糖体结合位点(Shimatake et al.(1981)Nature 292：128)(Shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128页)。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标记也是有用的。这种标记的例子包括确定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。

选择载体以使得能引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒感染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达本文所公开的蛋白质的表达系统可用芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)(Palva et al.(1983)Gene 22：229-235)(Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235页)；Mosbach et al.(1983)Nature302：543-545)(Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545页)。

在一些实施例中，本文所公开的表达盒或雄性育性多核苷酸在植物中维持在半合子状态。半合子状态为当仅有基因(或一组基因)的一个拷贝，而在姊妹染色体上没有对应等位基因时存在的遗传状态。在某些实施例中，本文所公开的表达盒包含有效连接到雄性育性多核苷酸的第一启动子，该雄性育性多核苷酸与有效连接到雄性组织偏好启动子的雄性配子破坏性多核苷酸堆叠，并且将此类表达盒引入处于半合子状态的雄性不育植物。当雄性育性多核苷酸表达时，由于雄性育性多核苷酸使该植物恢复到可育状态，故该植物能够成功地产生成熟的花粉粒。鉴于表达盒处于半合子状态，故在花粉粒形成过程中，只有某些子细胞将遗传该表达盒。由于堆叠的被编码的雄性配子破坏性基因产物的雄性组织偏好的表达，遗传了包含雄性育性多核苷酸的表达盒的子细胞将不会发育为成熟的花粉粒。未遗传该表达盒的那些花粉粒将继续发育为成熟的花粉粒并具有功能性，但它们将不包含该表达盒的雄性育性多核苷酸，因此将不会通过花粉将雄性育性多核苷酸传递到后代。

V.调节雄性育性多肽的浓度和/或活性

提供了用于调节植物中的本文所公开的雄性育性多肽的浓度和/或活性的方法。本文针对雄性育性多肽的浓度和/或活性所用的术语“影响”或“调节”，是指当与适当的对照比较时，雄性育性多肽的浓度和/或活性的任何增大或减小。一般来讲，本文所公开的雄性育性多肽的浓度和/或活性相对于天然的对照植物、植物部分或细胞增大或减小至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本文所公开的调节可在植物生长至所需的发育阶段过程中和/或在其后进行。在特定的实施例中，在单子叶植物(特别是小麦)中对本文所公开的雄性育性多肽进行调节。

可采用多种方法来测定雄性育性多肽的浓度和/或活性的调节。例如，雄性育性多肽的表达水平可以例如通过测定植物中雄性育性多肽或RNA的水平来直接测量(即，蛋白质印迹法或RNA印迹法)，或者例如通过测定植物中雄性育性多肽的雄性育性活性来间接测量。用于测量雄性育性活性的方法在本文别处进行描述。在特定的实施例中，对雄性育性多肽浓度和/或活性的调节包括对植物中的雄性育性多肽的水平的调节(即，增大或减小)。测量雄性育性多肽的水平和/或活性的方法在本领域中是已知的并且在本文别处进行讨论。在另有其他实施例中，对营养组织中、繁殖组织中、或营养组织和繁殖组织两者中的雄性育性多肽的水平和/或活性进行调节。

在一个实施例中，通过将雄性育性多肽或相应的雄性育性多核苷酸引入植物来增大该多肽的活性和/或浓度。随后，使用本领域技术人员已知的方法选出具有引入的雄性育性序列的植物，所述方法诸如但不限于DNA印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析。在某些实施例中，将标记多核苷酸与雄性育性多核苷酸一起引入，以便帮助选择具有或缺乏本文所公开的雄性育性多核苷酸的植物。将经前述实施例改变或修饰的植物或植物部分在形成植物的条件下培育足以调节雄性育性多肽在该植物中的浓度和/或活性的时间。形成植物的条件在本领域中是公知的。

如本文别处所讨论，许多用来将多肽提供给植物的方法是本领域已知的，包括但不限于将多肽直接引入植物中，或者将编码雄性育性多肽的多核苷酸构建体引入植物中(瞬时引入或稳定引入)。还应认识到，本文所公开的方法可采用不能够在转化的植物中指导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸。因而，雄性育性多肽的水平和/或活性可通过改变编码雄性育性多肽的基因或其启动子来增大。参见例如Kmiec，美国专利5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868。因此提供了在雄性育性基因中携带突变的经诱变处理的植物，其中所述突变增加雄性育性基因的表达或增大被编码的雄性育性多肽的活性。

在其他实施例中，通过向植物引入如本文别处所公开的包含雄性育性多核苷酸(例如SEQ ID NO：8或10)或其活性片段或变体的表达盒来增大雄性育性多肽的浓度和/或活性。雄性育性多核苷酸可以有效连接到对于植物是异源的或者对于植物是天然的启动子。通过增大植物中的雄性育性多肽的浓度和/或活性，该植物的雄性育性也增大。因此，可以通过增大雄性育性多肽的浓度和/或活性来增大植物的雄性育性。例如，通过增大雄性育性多肽的浓度和/或活性，可使雄性不育植物恢复雄性育性。

还应认识到，可通过采用不能够在转化的植物中指导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸，来调节该多肽的水平和/或活性。例如，本文所公开的多核苷酸可用来设计可在用于改变或突变生物体中的基因组核苷酸序列的方法中应用的多核苷酸构建体。这类多核苷酸构建体包括但不限于：RNA：DNA载体、RNA：DNA突变载体、RNA：DNA修复载体、混合双链体寡核苷酸、自身互补RNA：DNA寡核苷酸和引起重组的寡核苷酸。这类核苷酸构建体和使用方法是本领域已知的。参见美国专利No.5,565,350、No.5,731,181、No.5,756,325、No.5,760,012、No.5,795,972和No.5,871,984；将所有这些专利以引用的方式并入本文。另参见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821和Beetham et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778(Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第8774-8778页)；将上述专利和文献以引用方式并入本文。因此应认识到，本文所公开的方法并不依赖于将完整多核苷酸掺入到基因组中，只要将该多核苷酸引入细胞而使植物或其细胞被改变即可。

在一个实施例中，基因组可在将该多核苷酸引入细胞之后被改变。例如，可将多核苷酸或其任何部分掺入到植物的基因组中。本文所公开的基因组的变更包括但不限于基因组中核苷酸的添加、缺失和置换。虽然本文所公开的方法并不依赖于任何具体数目的核苷酸的添加、缺失和置换，但应认识到此类添加、缺失或置换包含至少一个核苷酸。

RNA干扰是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性的转录后基因沉默的过程(Fire et al.，Nature 391：806(1998)(Fire等人，《自然》，第391卷，第806页，1998年))。植物中的相应过程通常称作转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，而在真菌中也称作压制(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基因的表达的进化上保守的细胞防御机制，并且通常由不同的植物区系和门共有(Fire et al.，Trends Genet.15：358(1999)(Fire等人，《遗传学趋势》，第15卷，第358页，1999年))。

小RNA在控制基因表达中起到重要作用。包括开花在内的许多发育过程的调节是由小RNA控制的。现在可以通过使用能在植物中产生小RNA的转基因构建体来工程构建出植物基因的基因表达的变化。

小RNA似乎是通过与互补的RNA或DNA靶序列的碱基配对发挥功能。当与RNA结合时，小RNA引起该靶序列的RNA切割或翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据认为小RNA能介导该靶序列的DNA甲基化。这些事件的结果是，无论具体的机制如何，基因表达都被抑制。

如本文所用，术语“Cas基因”指这样的基因，其通常与侧翼CRISPR基因座偶联、相关或接近或在侧翼CRISPR基因座的附近。

CRISPR基因座(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats，规律成簇间隔短回文重复序列)(也称SPIDR——SPacer Interspersed DirectRepeats，间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由短且高度保守的DNA重复序列(通常24至40bp，重复1至140次，也称CRISPR重复序列)组成，所述DNA重复序列是部分回文的。重复的序列(通常是物种特异性的)被恒定长度的可变序列(通常20至58bp，取决于CRISPR基因座(2007年3月1日公布的WO2007/025097))间隔。

CRISPR基因座首先在大肠杆菌中确认(Ishino et al.(1987)J.Bacterial.169：5429-5433(Ishino等人，1987年，《细菌学杂志》，第169卷，第5429-5433页)；Nakata et al.(1989)J.Bacterial.171：3553-3556(Nakata等人，1989年，《细菌学杂志》，第171卷，第3553-3556页))。在地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、鱼腥藻属(Anabaena)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中已鉴定出类似的散在短序列重复序列(Groenen et al.(1993)Mol.Microbiol.10：1057-1065(Groenen等人，1993年，《分子微生物学》，第10卷，第1057-1065页)；Hoe et al.(1999)Emerg.Infect.Dis.5：254-263(Hoe等人，1999年，《新发传染病》，第5卷，第254-263页)；Masepohl et al.(1996)Biochim.Biophys.Acta 1307：26-30(Masepohl等人，1996年，《生物化学与生物物理学学报》，第1307卷，第26-30页)；Mojica etal.(1995)Mol.Microbiol.17：85-93(Mojica等人，1995年，《分子微生物学》，第17卷，第85-93页))。CRISPR基因座与其他SSR不同之处在于重复序列的结构，所述重复序列也被命名为短规则间隔重复序列(short regularly spaced repeats，SRSR)(Janssen et al.(2002)OMICS J.Integ.Biol.6：23-33(Janssen等人，2002年，《组学：整合生物学杂志》，第6卷，第23-33页)；Mojica et al.(2000)Mol.Microbiol.36：244-246(Mojica等人，2000年，《分子微生物学》，第36卷，第244-246页))。所述重复序列是成簇出现的短元件，其通常被恒定长度的可变序列规则地间隔(Mojica et al.(2000)Mol.Microbiol.36：244-246(Mojica等人，2000年，《分子微生物学》，第36卷，第244-246页))。

术语“Cas基因”、“CRISPR相关(Cas)基因”在本文中可互换使用。关于Cas蛋白家族的综合综述在以下文献中提供：Haft et al.(2005)Computational Biology，PLoS ComputBiol 1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060(Haft等人，2005年，《计算生物学》，PLoS Comput Biol 1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060)。如该文献中所描述，除了四个之前已知的基因家族外，还描述了41个CRISPR相关(Cas)基因家族。该文献表明，CRISPR系统属于不同的类别，具有不同的重复序列模式、不同组的基因以及不同物种范围。给定的CRISPR基因座中的Cas基因的数目可随物种而不同。Cas内切核酸酶基因可为Cas9内切核酸酶基因，如但不限于2007年3月1日公布的WO2007/025097的SEQ ID NO：462、474、489、494、499、505和518中列出的Cas9基因，该专利以引用方式并入本文。

如本文所用，术语“指导RNA”指crRNA(CRISPR RNA)(其包含可变寻靶结构域)和tracrRNA这两种RNA分子的合成融合体。在一个实施例中，指导RNA包含12至30个核苷酸序列的可变寻靶结构域和可与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。

术语“可变寻靶结构域”指位于指导RNA中的GUUUU序列基序的5’的核苷酸序列，其与植物细胞、植物或种子的基因组中的双链DNA靶位点的一条链互补。

指导RNA和Cas内切核酸酶能够形成称为“指导RNA/Cas内切核酸酶复合物”或“指导RNA/Cas内切核酸酶系统”的复合物，该复合物使得Cas内切核酸酶能够在DNA靶位点引入双链断裂。

本文所用的词语“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))该词语的语法对象。举例而言，“一个要素”意指一个或多个要素。

本说明书中提到的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出以引用方式并入本文一样。

虽然为了理解清晰目的已经通过举例说明和实例方式较详细地描述了本发明，但显然可以在所附权利要求书范围内实施一些改变和修改。

表1.SEQ ID NO汇总

SEQ ID：	说明
		1	小麦MS45启动子_4AL
2	小麦MS45启动子_4BS
		3	小麦MS45启动子_4DL
4	小麦MS45启动子共有序列
		5	玉蜀黍MS45启动子片段
6	小麦pIR
		7	PHP 54693 T-DNA(5804bp)
8	PHP37034中使用的水稻MS45基因组区域(2079bp)
		9	PHP37034中使用的玉蜀黍MS45启动子区域(488bp)
10	水稻MS26cds
		11	植物优化的DAM(837bp)
12	PHP 56791 T-DNA
		13	PHP 54783 T-DNA
14	图2的玉蜀黍/小麦共有序列
		15	图3的小麦PRO/pIR共有序列
16	图1A和1B的全长共有序列
		17	PHP 56988 T-DNA

实验

实例1.小麦MS45调节区的鉴定

本实例证明与控制小麦MS45的植物内(in planta)表达的元件对应的小麦DNA序列的鉴定。

使用玉米(Zea mays)MS45的413个氨基酸的序列(Cigan et al.(2001)Sex PlantReprod.14：135-142(Cigan等人，2001年，《植物有性繁殖》，第14卷，第135-142页))搜索中国春小麦的小麦基因组454个序列，CerealsDB，(Wilkenson et al(2012)BMCBioinformatics 13：219)(Wilkenson等人，2012年，《BMC生物信息学》，第13卷，第219页)，以鉴定和装配含有小麦MS45直系同源序列的重叠群(contig)。装配了三个不相同的大约1000个核苷酸的重叠群，对应于来自4AL、4BS和4DL相应的六倍体小麦普通小麦(Triticumaestivum)的序列(SEQ ID NO：1、2和3)。这些序列的比对揭示了来自小麦的三个重叠群的高度序列同一性(图1)。类似地，含有所述小麦启动子的共有序列的500bp区域(SEQ ID NO：4)与含有ZmMS45启动子区域的500bp区域(SEQ ID NO：5)的比对显示了小麦和玉蜀黍序列的核苷酸位置369-426之间相似性接近73％同一性的区域，这表明了调节元件在小麦和玉蜀黍之间的保守性。总体上，在小麦和玉蜀黍的整个500碱基对区域中观察到45％序列同一性(图2)。

产生了合成的DNA序列(SEQ ID NO：6)，其含有与小麦Ms45共有序列的98％序列同一性(图3)。将SEQ ID NO：6的合成的小麦Ms45启动子反向重复序列用于以下实例中描述的基因抑制研究中。

实例2.启动子反向重复序列表达影响小麦中的植物育性

本实例证明可通过表达对编码参与雄性育性途径的蛋白质的基因的启动子有特异性的启动子反向重复序列分子(pIR)，来改变植物的育性或育性潜力。

通过将泛素启动子与含有小麦MS45启动子的一部分的反向重复序列连接，来产生启动子反向重复序列构建体(SEQ ID NO：6)，包括反向重复序列之间的NOS间隔区段。用于制备载体PHP54693的核酸分子和方法之前已有描述(Cigan et al Plant Journal(2005)43，929-940)(Cigan等人，《植物杂志》，2005年，第43卷，第929-940页)。SEQ ID NO：7含有PHP54693的T-DNA序列。使用本领域已知的和本文别处提到的方法，通过农杆菌介导的转化将PHP54693引入到小麦Fielder品种中。

在温室中栽培植株；通过定量聚合酶链式反应(QPCR)测定转基因拷贝数。将植株栽培至成熟，记录雄性育性表型。结果在表2中显示。

表2：含有PHP54693的转基因小麦植株的雄性育性表型。

PHP54693	总事件	单或低拷贝	多拷贝

雄性不育	36	20	16
				雄性可育	13	8	5
	49

抑制足以造成在73％的事件中呈雄性不育。单拷贝和多拷贝T-DNA插入事件两者以大约相等的频率呈雄性不育，表明单拷贝和多拷贝插入事件都是有效的。

对来自几株独立的PHP54693植株的花药进行镜检揭示，与来自未转化的Fielder植株的类似阶段的花药形成对比的是，这些花药缺乏花粉。此外，观察到从雄性不育PHP54693植株的花药分离的小孢子在发育的四分孢子期之后解体。这个观察结果与观察到来自雄性不育玉蜀黍ms45突变株的小孢子解体的阶段类似。这些结果证明，针对小麦MS45启动子的pIR构建体能够产生雄性不育小麦植株。

要指出的是，PHP54693的pIR由组成型的异源启动子即ZmUBI驱动。这证明本领域技术人员可从供在抑制构建体中使用的众多启动子中进行选择，包括任何在其中靶基因被表达和其中需要抑制的组织中提供表达的启动子。在某些实施例中，该启动子可优先地在一种或多种雄性繁殖组织中驱动表达。

该反向重复序列构建体可含有被靶向的启动子的在小麦或其他多倍体生物的多种不同基因组中实质上保守的序列，以减少相关的被靶向的基因的表达。此外，可将在一个或多个启动子中独特的序列添加到反向重复序列构建体中的保守序列，使得所有基因组的所有启动子序列都被靶向以减少被靶向的区域的表达。

实例3.外源MS45基因产物的表达恢复育性

本实例证明，含有靶向小麦MS45启动子的pIR构建体(PHP54693 T-DNA，SEQ IDNO：7)的雄性不育植株当还含有外源MS45基因产物时可恢复雄性育性。

制备出含有源自水稻的MS45编码序列(SEQ ID NO：8)和与之有效连接的异源玉蜀黍Ms45启动子(SEQ ID NO：9)的构建体。如上所述通过农杆菌介导的转化将这个构建体引入到小麦Fielder品种中。将再生的转化小麦植株在温室中栽培。所有再生的PHP37034小麦植株都是雄性可育的。

使用含有单拷贝PHP37034 TDNA插入的小麦植株(雄株1)作为花粉供体并将其与两株不相同的雄性不育PHP54693植株(雌株1和雌株2)杂交。从这些杂交株收获种子并进行种植，通过PCR对后代进行基因型分析确定PHP54693和PHP37034 TDNA插入的存在。将仅含有PHP54693 TDNA的植株或同时含有PHP54693和PHP37034 TDNA的植株栽培至成熟，并记录雄性育性表型。

如表3中所示，仅含有PHP54693的组1和组2小麦植株不含有花粉，因此是雄性不育的(无种子)。相比之下，这两组中还含有PHP37034的PHP54693植株能散发花粉，因此能够自体受精(结种子)。PHP54693/PHP37034后代中每株植株的种子数目与从未转化的Fielder品种植株获得的种子数目类似。

表3：含有显性不育构建体PHP54693和恢复构建体PHP37034的转基因小麦植株的雄性育性表型。

这些数据提供了出乎意料的结果，即在六倍体Fielder小麦中，小麦Ms45启动子的A、B和D基因组拷贝被PHP54693抑制，导致足以赋予小麦雄性不育的Ms45表达的丧失或减少。这些结果进一步证明，PHP37034中所含的外源MS45基因构建体能够使含有抑制内源小麦MS45基因的显性雄性不育构建体PHP54693的六倍体小麦植株恢复育性。

实例4.使用外源MS45基因产物恢复PHP54693植株中的育性。

PHP37034中表达水稻MS45基因的启动子可源自玉蜀黍以外的来源；例如，可以使用玉蜀黍MS45、5126、BS7和MS26基因的水稻和拟南芥同源物，或者任何能够转录MS45使得转录单元的表达使植株变成雄性可育的植物启动子，包括组成型启动子。在某些方面，使用非小麦启动子来表达育性恢复基因如MS45基因是有利的。例如，在来自相同物种的启动子反向重复序列降低靶基因功能而使得植株不能存活或不能繁殖的情况中，可使用来自不同物种的启动子来在转录水平上(transcriptionally)表达互补的基因功能(例如MS45)，从而避开这个潜在问题。或者，可以使用与MS45以外的基因天然相关的启动子，前提条件是至少在其中需要互补的组织中出现表达，包括来自小麦或来自其他物种的雄性组织偏好的启动子或组成型启动子。此外，如果天然启动子例如小麦MS45启动子被充分改变从而不被pIR靶向的话，则可以使用该天然启动子来驱动育性恢复基因。

另外，PHP37034中的MS45基因可来自水稻以外的来源，例如玉蜀黍或小麦MS45编码区，或者Ms45基因或能够补足Ms45功能和恢复雄性育性的类似基因的其他植物来源。

本发明的实例合在一起证明了可以使用启动子反向重复序列介导的抑制来使内源多倍体植物育性基因失活，并且可在从基因型来看不育的植株中恢复可育表型。

实例5.使用半合保持系进行LOF-pIRmf雄性不育植株的近交系保持和增加。

产生雄性不育植株的纯系以便用不同的近交系品种进行异花传粉来产生杂种种子，这将是有利的。通常，并入显性不育作为引起雄性不育的手段的策略不能自花传粉。本实例提供这种方法。

在一些实施例中，当使用启动子反向重复序列策略来使参与雄性育性的基因沉默(功能失去(Loss of Function)：LOF-pIRmf)时，供应被沉默的基因的外源拷贝可恢复雄性育性。这是通过功能获得(Gain of Function)恢复育性(GOF-MF)的例子(图4)。如前所描述，当沉默小麦MS45基因并使用该被抑制的育性基因的外源来源进行恢复时，雌性近交系为LOF-pIRmf的例子，而雄性恢复系为GOF-MF的例子(图5)。

产生近交保持群体来增加雄性不育近交系将是有利的。为实现这一点，在一个针对小麦的实施例中，将表达水稻MS45基因的玉蜀黍MS45启动子(GOF-MF)连接到处于玉蜀黍PG47启动子控制下的玉蜀黍α淀粉酶基因和连接到处于大麦LTP2启动子(参见例如美国专利5,525,716)控制下并且还携带PINII终止子序列的DsRed2基因(GOF-MF-AA-DsRED)。通过农杆菌介导的转化将这个构建体直接转化到小麦中。使含有单拷贝GOF-MF-AA-DsRED盒的小麦植株去雄，并用来自含有LOF-pIRmf构建体和GOF-MF构建体的雄性可育植株的花粉使柱头受精。收获种子，通过PCR筛选仅含有GOF-MF-AA-DsRED插入和LOF-pIRmf TDNA插入的植株或种子。种植这些种子并使植株自花传粉。种植来自这些自花传粉的植株的发红色荧光的种子，通过QPCR筛选后代是否有纯合LOF-pIRmf TDNA插入。来自这一代后代的种子以发红色荧光和不发红色荧光1：1的频率分离。发红色荧光的种子对于GOF-MF-AA-DsRED半合、对于LOF-pIRmf纯合，而不发荧光的种子对于LOF-pIRmf纯合。不发荧光的种子的后代为雄性不育，在杂种生产中可用作雌性近交系。发红色荧光的种子产生可用来保持和繁殖雄性不育近交系的后代(对于GOF-MF-AA-DsRED半合；对于LOF-pIRmf纯合)。

实例6.大肠杆菌DNA(腺苷-N6-)-甲基转移酶(DAM)表达影响小麦中的植物育性。

本实例证明可通过在处于玉蜀黍花药启动子5126的控制下时表达大肠杆菌DNA(腺苷-N6-)-甲基转移酶(DAM)来改变小麦植株的育性或育性潜力。

在玉蜀黍中，花药指导的大肠杆菌DAM基因表达导致由于正常绒毡层功能的破坏而出现高频率的雄性不育植株(Unger et al(2001)Trans Res 10：409-422)(Unger等人，2001年，《转基因研究》，第10卷，第409-422页)。但是，尚不清楚多倍体植株中的DAM表达是否将导致雄性不育。

用于制备在小麦植株中表达的载体PHP56791的核酸分子和方法与之前描述的那些核酸分子和方法类似(Unger et al(2001)Trans Res 10：409-422)(Unger等人，2001年，《转基因研究》，第10卷，第409-422页)。对DAM基因的DNA序列进行修饰以便在植物中表达(SEQ ID NO：11)。将该优化的DAM基因置于玉蜀黍5126启动子的转录控制之下(Unger etal(2001)Trans Res 10：409-422)(Unger等人，2001年，《转基因研究》，第10卷，第409-422页)以产生植物转化载体PHP56791。通过与本文别处描述或提到的方法类似的农杆菌介导的转化方法将(SEQ ID NO：12)PHP56791引入到小麦Fielder品种中。

在温室中栽培植株并通过定量聚合酶链式反应(QPCR)测定转基因拷贝数。将植株栽培至成熟，记录雄性育性表型。如表4中所示，在85株原代T0小麦转化株中，有73株植株为雄性不育，而12株为雄性可育。对来自几株独立的PHP56791植株的花药进行镜检揭示，与来自未转化的Fielder植株的类似阶段的花药形成对比的是，这些花药缺乏花粉。此外，花药始终为完全发育的可育花药的尺寸的三分之一到二分之一，并且不含有发育的早期液泡阶段之后的小孢子。PHP56791雄性不育植株中花药的小尺寸和花粉的缺乏类似于在用花药表达的DAM基因转化的玉蜀黍植株中观察到的雄性不育表型。

这些结果证明，从PHP56791中玉蜀黍花药启动子表达的植物优化的DAM基因能够产生雄性不育小麦植株。

表4：含有PHP56791的植株中雄性不育的频率

PHP56791	总事件	单或低拷贝	多拷贝

雄性不育	73	46	27
				雄性可育	12	8	4
	85

实例7.小麦雄性不育恢复系的制备和含有PHP56791的小麦植株的雄性育性的恢复

本实例证明，含有构建体PHP56791的雄性不育植株当还含有启动子沉默构建体时可恢复雄性育性。

在玉蜀黍中，启动子沉默构建体有效地在转录水平上沉默植物内的内源启动子和转化启动子(Cigan et al Plant Journal(2005)43，929-940)(Cigan等人，《植物杂志》，2005年，第43卷，第929-940页)。本实例旨在测试被设计用来沉默玉蜀黍花药启动子5126的启动子反向重复序列是否能够指导小麦中的类似雄性不育表型。此外，如果育性不被玉蜀黍5126启动子反向重复序列影响，则该实验将确定这个沉默盒是否能抑制PHP56791转基因小麦植株中的DAM基因的花药表达。

用于制备能够抑制用来表达PHP56791中的DAM基因的玉蜀黍5126启动子的植物载体PHP54783的核酸分子和方法基本上如针对PHP20089所描述(Cigan et al PlantJournal(2005)43，929-940)(Cigan等人，《植物杂志》，2005年，第43卷，第929-940页)。通过与本文别处描述或提到的方法类似的农杆菌介导的转化方法将PHP54783(SEQ ID NO：13)引入到小麦Fielder品种中。从组织培养物再生出转化植株并在温室中栽培。通过定量聚合酶链式反应(QPCR)测定转基因拷贝数。将植株栽培至成熟，记录雄性育性表型。

所有仅含有PHP54783TDNA插入的植株均为雄性可育，表明与这个pIR抑制盒在玉蜀黍中的表达不同的是，Zm5126 pIR不导致雄性不育小麦植株。

为确定Zm5126 pIR沉默盒是否能够逆转与PHP56791相关的雄性不育表型，使用来自两个不同的单拷贝PHP54783 TDNA插入(雄株1和雄株2)的花粉对三株不同的雄性不育PHP56791植株(雌株1、3、4)进行受精。从这些杂交株收获种子并进行种植，通过PCR对后代进行基因型分析确定PHP54783和PHP56791 TDNA插入的存在。将仅含有PHP56791的植株或同时含有PHP56791和PHP54783的植株栽培至成熟，并记录雄性育性表型。如表5中所示，仅含有PHP56791的组1和组4小麦植株不含有花粉，因此是雄性不育的(无种子)。

表5：含有显性不育构建体PHP56791和恢复构建体PHP54783的转基因小麦植株的雄性育性表型。

相比之下，组1、3和4中还含有PHP54783的PHP56791植株能散发花粉，因此能够自体受精(结种子)。PHP56791/PHP54783后代中每株植株的种子数目与从未转化的Fielder品种植株获得的种子数目类似。这些结果证明玉米5126启动子反向重复序列能够恢复含有显性雄性不育构建体PHP56791的小麦植株的育性。

实例8.在小麦中赋予雄性不育和恢复育性的启动子和基因产物的来源。

表达PHP56791中的大肠杆菌DAM基因的启动子可为花药偏好的启动子，如玉蜀黍MS45、BS7或MS26基因的启动子，或者例如玉蜀黍MS45、5126、BS7或MS26基因的水稻或拟南芥同源物的启动子，使得由这个植物启动子：DAM转录单元进行的表达使小麦植株变成雄性不育。在某些方面，使用非小麦启动子来表达DAM基因是有利的。例如，在来自相同物种的启动子反向重复序列具有降低靶启动子功能的潜力而使得植株不能存活或不能繁殖的情况中，可使用来自不同物种的启动子来在转录水平上表达显性不育基因(例如DAM)，从而避开这个潜在问题。

另外，PHP56791中的大肠杆菌DAM基因可被DAM以外的来源替换，例如，芽孢杆菌RNA酶或另一种能使植物由于绒毡层功能降低或雄性繁殖组织发育的其他破坏而变成雄性不育的基因产物。

本发明的实例合在一起证明了可以使用pIR介导的抑制来使显性雄性不育基因失活，并且可在从基因型来看不育的植株中恢复可育表型。

实例9.使用半合保持系进行LOF-DomMS雄性不育植株的近交系保持和增加。

产生雄性不育植株的纯系以便用不同的近交系品种进行异花传粉来产生杂种种子，这将是有利的。通常，包括显性方法的不育策略防止植株发生自花传粉。本实例提供这种方法。

在一些实施例中，通过引入包含如下的启动子的构建体来实现显性雄性不育，该启动子驱动某种基因表达某种基因产物如蛋白质或RNA，该基因产物由于对繁殖发育如花药发育、绒毡层发育或小孢子功能造成一般破坏或特异性破坏而产生雄性不育植株。在这些显性功能失去(LOF-DomMS)例子中，可通过共表达能沉默用来驱动显性不育基因的启动子(MSp)的外源启动子反向重复序列(pIR)构建体(MSpMS)来实现育性的恢复。这是通过由启动子反向重复序列进行的功能获得(GOF-pIRMSp)来恢复育性的例子(图6)。如前所描述，通过Zm5126：DAM(MSpMS)破坏正常绒毡层功能是LOF-DomMS雌性近交系的一个例子；使用外源来源的Zm5126pIR(pIRMSp)恢复育性是GOF-pIRMSp的一个例子(图7)。

产生可用来增加含有MSpMS的雄性不育近交系的近交保持群体将是有利的。为实现这一点，将GOF-pIRMSp连接到处于PG47启动子控制下的玉蜀黍α淀粉酶基因和连接到处于大麦LTP2启动子(参见例如美国专利5,525,716)控制下并且还携带PINII终止子序列的DsRed2基因(GOF-pIRMSp-AA-DsRED)。通过农杆菌介导的转化将这个构建体直接转化到小麦中。使含有单拷贝GOF-pIRMSp-AA-DsRED盒的小麦植株去雄，并用来自含有MSpMS/GOF-pIRMSp的雄性可育植株的花粉使柱头受精。收获种子，通过PCR筛选仅含有GOF-pIRMSp-AA-DsRED和MSpMS TDNA插入的植株或种子。使植株自花传粉。种植来自这些自花传粉的植株的发红色荧光的种子，通过QPCR筛选后代是否有纯合MSpMS TDNA插入。来自这一代后代的种子将以发红色荧光和不发红色荧光1∶1的频率分离。发红色荧光的种子对于GOF-pIRMSp-AA-DsRED半合和对于MSpMS纯合；而不发红色荧光的种子对于MSpMS纯合。不发红色荧光的种子的后代为雄性不育，在杂种生产中可用作雌性近交系。发红色荧光的种子产生将被用来繁殖雄性不育近交系的后代(对于GOF-pIRMSp-AA-DsRED半合；对于MSpMS纯合)。在以上例子中，MSpMS可为Zm5126DAM，而GOF-pIRMSp将对应于Zm5126pIR。

由于在杂种种子的生产中所产生的后代将含有半合的引起显性不育的基因构建体MSpMS，产生含有纯合雄性育性恢复构建体(GOF-pIRMSp)的雄性近交系品种将是有利的。可设想到，这些雄性近交系品种将在杂种的生产中被使用。通过用来自雄性可育pIRMSp/pIRMSp雄性近交系的花粉对MSpMS/MSpMS雄性不育雌株进行受精而产生的F1种子，在基因型上为MSpMS/pIRMSp，而在表型上为雄性可育。

实例10.含有LOF-pIRmf和GOF-MF-AA-DsRED的雄性不育近交系的保持

在本实例中，使用连接到(a)处于PG47启动子控制下的玉蜀黍α淀粉酶基因和(b)处于大麦LTP2启动子(参见例如美国专利5,525,716)控制下的DsRed2基因的玉蜀黍MS45基因的功能拷贝GOF-MF-AA-DsRED，使含有靶向小麦MS45启动子的pIR构建体(PHP54693T-DNA；TaMS45pIR)的小麦植株恢复育性。

产生雄性不育植株的纯系以便用不同的近交系品种进行异花传粉来产生杂种种子，这将是有利的。使用含有PHP56988(T-DNA，包含玉蜀黍MS45基因、连接该基因的表达玉蜀黍α淀粉酶的花粉PG47启动子、和由表达荧光标记DsRed2的大麦LTP2启动子组成的第三基因；SEQ ID NO：17)的小麦植株来保持雄性育性。这个保持系构建体PHP56988最初通过农杆菌介导的转化产生。然后使用来自含有MS45恢复构建体(实例4)的TaMS45pIR植株的花粉对含有PHP56988的去雄小麦植株进行受精。收获种子，通过PCR筛选后代植株以选择那些仅含有GOF-MF-AA-DsRED(PHP56988)和LOF-pIRmf TDNA(PHP54693)插入的植株。使植株自花传粉。种植来自这些自花传粉的植株的发红色荧光的种子(表明遗传了PHP56988中的DsRed标记)，并通过QPCR筛选后代是否有纯合LOFpIRmf(PHP54693)；来自这一代后代的种子以发红色荧光和不发红色荧光1：1的频率分离。发红色荧光的种子对于GOF-MF-AA-DsRED(PHP56988)半合(一个拷贝)和对于LOF-pIRmf(PHP54693)纯合(两个拷贝)，而不发荧光的种子对于LOF-pIRmf(PHP54693)纯合。由于LOF-pIRmf TDNA插入物的存在，不发荧光的种子的后代为雄性不育。发红色荧光的种子的后代(对于GOF-MF-AA-DsRED半合；对于LOF-pIRmf纯合)为雄性可育并且结种子。

本实例证明了由LOF-pIRmf载体PHP54693中携带的针对小麦MS45启动子的启动子反向重复序列所赋予的雄性不育表型，可通过GOF-MF-AA-DsRED中含有的功能性Ms45拷贝的存在和作用被逆转。另外，雄性可育表型与雄性不育表型的1：1分离与分别仅存在PHP56988(GOF-MF-AA-DsRED)和PHP54693(LOF-pIRmf)或PHP54693(LOF-pIRmf)相一致。

实例11.含有LOF-pIRmf的杂种植株中雄性育性的恢复。

用作雌株并用不同的雄性近交系品种进行异花传粉的LOF-pIRmf雄性不育植株的纯系，将产生其中LOF-pIRmf插入将为半合的杂种种子。源自这个F1种子的后代植株将为雄性不育而不能够产生花粉和自交种子。策划出容许含有半合LOF-pIRmf插入的杂种种子自体受精的策略将是有利的。在这些例子中，描述了克服F1杂种中由LOF-pIRmf赋予的不育的各种策略。

一种克服F1不育的解决方案将是使用含有分别不被TaMS45pIR或LOF-pIRmf沉默的Ms45或pIR靶向育性基因的一个拷贝的雄性近交系品种。这个解决方案在实例3中描述，其中含有PHP37034的小麦植株当与含有纯合或半合TaMs45pIR的植株杂交时恢复育性。因此，雄性近交系品种可含有纯合PHP37034或类似的恢复构建体并在杂种种子生产中用作花粉供体。所有的F1杂种种子将产生可育植株，因为外源供应的Ms45的半合拷贝将通过补足被TaMs45pIR的作用沉默的小麦Ms45基因来恢复功能。

第二种恢复F1植株中的育性的解决方案将是使用含有分别不被TaMS45pIR或LOF-pIRmf沉默的小麦Ms45或pIR靶向育性基因启动子的一个基因修饰拷贝(genic modifiedcopy)的雄性近交系品种。在这个实例中，内源小麦Ms45启动子可用将不被TaMs45pIR靶向而沉默但将能够表达小麦Ms45的育性补足形式的DNA序列替换。可使用DNA切割试剂(例如，锌指核酸酶、TALE核酸酶、定制的大范围核酸酶或指导RNA/Cas内切核酸酶系统)操纵植物基因组，以在内源天然小麦Ms45基因的区域中引入双链断裂并引入这样的外源供应的DNA模板，该DNA模板含有足以表达小麦Ms45但不被TaMs45pIR靶向而沉默的启动子序列(例如，玉蜀黍或水稻Ms45或5126，或源自小麦或非小麦的序列的组合)。通过在这个区域中产生促进同源重组的双链断裂，小麦Ms45启动子可被替换或改变至该区域不再是抑制或沉默的靶标的程度。在育性基因座含有这个非靶标启动子的雄性近交系将在杂种种子生产中用作花粉供体。所有的F1种子都将产生雄性可育植株，因为现在连接到非靶启动子的内源TaMs45基因的半合拷贝不被也在这些后代中存在的TaMs45pIR的作用沉默。

另一个可被策划用于在F1植株中恢复育性的解决方案，将是设计仅作为成对系统(LOF-pIR1mf/LOF-pIR2mf)发挥功能而当仅以半合未成对状态存在时不发挥功能的启动子反向重复序列。组成型表达的启动子反向重复序列RNA被dicer酶DCL3加工成最初结合到AGO4的24nt siRNA。AGO4-siRNA双链体通过与DNA进行碱基配对而将沉默复合物导向同源基因组区域。由于这些24nt小RNA的产生独立于组成型表达的启动子反向重复序列RNA的来源，因此可设想到可设计多种启动子反向重复序列构建体来产生足够的24nt小RNA覆盖被靶向的启动子区域。在这个实例中，含有半合启动子反向重复序列的雌性近交系将用任何野生型雄性近交系品种受精。含有半合未成对启动子反向重复序列的后代将是雄性可育的，因为单个启动子反向重复序列不能够沉默育性靶启动子。可设计启动子反向重复序列对，使得第一启动子反向重复序列构建体将仅含有靶序列的一部分，而第二启动子反向重复序列可含有为进行沉默所需的靶启动子的其余部分。由于被靶向的启动子因单个启动子反向重复序列覆盖不完全而将不被沉默或抑制，只有在成对的第一和第二启动子反向重复序列存在下靶启动子才将被沉默。所产生的在植物基因组中的单个位置含有独特的启动子反向重复序列构建体对的植株将被杂交，以由于成对的启动子反向重复序列的组合作用对育性基因的沉默而产生雄性不育雌性近交系。这个雌性近交系将被GOF-MF-AA-DsRED构建体保持，该构建体将容许产生如下的分离群体：一半的种子群体将因为GOF-MF-AA-DsRED和半合LOF-pIR1mffLOF-pIR2mf的存在而发荧光，而另一半的种子群体将不发荧光而是仅含有半合LOF-pIR1mf/LOF-pIR2mf。含有GOF-MF-AA-DsRED和半合LOF-pIR1mf/LOF-pIR2mf的后代将为雄性可育，而后代LOF-pIR1mffLOF-pIR2mf植株将为雄性不育并在杂种生产中用作雌性近交系。用野生型雄性近交系对LOF-pIR1mf/LOF-pIR2mf植株受精将导致产生将分离开LOF-pIR1mf插入和LOF-pIR2mf插入的每个拷贝的后代，从而产生将为雄性可育的仅含LOF-pIR1mf和仅含LOF-pIR2mf的植株，因为这些单个LOF-pIRmf形式不能够沉默可育基因的内源拷贝。可设想到，可设计多个启动子反向重复序列的组合以使得能够沉默靶启动子；这些可包括但不限于含有毗连DNA序列段的启动子反向重复序列对、相等地或不相等地分裂DNA序列、靶启动子序列、或由非毗连的、重叠的或非重叠的DNA靶序列段组成的嵌合体。此外，可设想到，这些成对启动子反向重复序列构建体内的这些序列的顺序可进行改变并且相对于靶DNA序列的顺序而言是不同的。

Claims

1.一种靶向小麦MS45基因启动子的表达盒，其中所述表达盒包含核酸分子，所述核酸分子包含启动子反向重复序列，所述启动子反向重复序列靶向(a)由SEQ ID NO: 1、2或3的核苷酸序列组成的多核苷酸。

2.一种在小麦植物或小麦植物细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括将包含有效连接到目的异源多核苷酸的启动子的表达盒引入到所述植物或所述植物细胞中，其中所述启动子由选自以下的核苷酸序列组成：

(a) 由SEQ ID NO: 1、2或3的核苷酸序列组成的核苷酸序列；以及

(b) 由SEQ ID NO: 1、2或3的核苷酸序列组成的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录。

3.一种在表现出雄性不育的小麦植物的后代中恢复雄性育性的方法，所述方法包括将小麦植物的育种对杂交，所述小麦植物的育种对包括：(a)第一植物和第二植物，其中所述第一植物包含外源核酸分子，所述外源核酸分子当被表达时抑制所述第一植物的功能获得性雄性育性基因或所述第一植物的使用启动子反向重复序列驱动所述功能获得性雄性育性基因的启动子，其中所述启动子反向重复序列靶向SEQ ID NO: 1、2和/或3的多核苷酸且抑制内源Ms45基因的表达，使得所述第一植物为雄性不育，和(b)第二植物，其中所述第二植物表达功能获得性雄性育性基因，使得所述第二植物为雄性可育，并且其中所述第二植物中的所述功能获得性雄性育性基因在所述第二植物与所述第一植物杂交时能够恢复雄性育性；和

获得雄性可育的后代。

4.一种增加雄性不育小麦种子的方法，所述方法包括：

(a) 将第一小麦植物去雄，所述第一小麦植物对于功能获得性雄性育性基因半合并且其中所述功能获得性雄性育性基因与(1)破坏雄性繁殖组织的功能和/或发育的基因和(2)标记基因有效连接；

(b) 用来自第二小麦植物的花粉为所述第一小麦植物进行传粉，其中所述植物为雄性可育并且包含靶向所述第二小麦植物的功能获得性雄性育性基因的外源核酸构建体，其中所述外源核酸构建体包含启动子反向重复序列，所述启动子反向重复序列靶向选自SEQ IDNO: 1、2或3的多核苷酸且抑制内源Ms45基因的表达，并且其中所述第二小麦植物包含保持所述第二小麦植物中的育性的功能获得性雄性育性基因；

(c) 收获种子；

(d) 选择包含以下的种子：(1)与所述破坏雄性繁殖组织的功能和/或发育的基因和所述标记基因有效连接的所述功能获得性雄性育性基因及(2)所述靶向所述第二小麦植物的功能获得性雄性育性基因或启动子的外源核酸构建体；

(e) 种植来自步骤(d)的种子；

(f) 使从步骤(d)的种子生长的植物自花传粉；

(g) 收获来自步骤(f)的所得后代的种子；

(h) 对步骤(g)中收获的种子选择表达所述标记的种子，其中所述表达所述标记的种子(1)对于与所述破坏雄性繁殖组织的功能和/或发育的基因和所述标记基因连接的功能获得性雄性育性基因半合及(2)对于所述外源核酸纯合；

(i) 种植来自步骤(h)的种子；

(j) 使从步骤(i)的种子生长的植物自花传粉；

(k) 收获来自步骤(j)的所得后代的种子；

(l) 对步骤(k)中收获的种子选择对于所述靶向所述植物的功能获得性雄性育性基因的外源核酸构建体纯合并且不含有所述标记基因的种子。

5.一种增加雄性不育小麦植物的方法，所述方法包括：

a. 用来自包含与破坏雄性繁殖组织的功能和/或发育的基因和标记基因有效连接的功能获得性雄性育性基因及靶向第二植物的功能获得性雄性育性基因的外源核酸构建体的植物的花粉为从权利要求4的步骤(l)的种子生长的植物进行传粉；并且

b. 收获来自步骤(a)的所得后代的种子，其中对于靶向所述植物的功能获得性雄性育性基因的外源核酸抑制分子纯合的种子为雄性不育并且不含有所述标记基因。

6.一种产生雄性不育雌性小麦植物的方法，所述方法包括：

c. 种植来自权利要求4的步骤(l)的种子，并且

d. 使所述种子生长成植物，其中所得的植物对于所述外源核酸构建体纯合并且为雄性不育。

7.一种产生杂种小麦植物种子的方法，所述方法包括：

用雄性可育小麦植物为根据权利要求6所述的雄性不育雌性小麦植物进行传粉。

8.一种增加雄性不育雌性小麦种子的方法，所述方法包括：

(a) 将第一小麦植物去雄，其中所述第一小麦植物对于包含多核苷酸的可表达的外源核酸半合，所述多核苷酸当被表达时抑制显性雄性不育基因或与所述显性雄性不育基因有效连接的启动子的表达而使得所述第一小麦植物为雄性不育雌性植物，其中所述多核苷酸包含启动子反向重复序列，所述启动子反向重复序列靶向由SEQ ID NO: 1、2或3的核苷酸序列组成的多核苷酸且抑制内源Ms45基因的表达，并且其中所述可表达的外源核酸与以下有效连接：(1)破坏雄性繁殖组织的功能和/或发育的基因和(2)标记基因；

(b) 用来自如下的雄性可育小麦植物的花粉为所述第一小麦植物进行传粉，所述雄性可育小麦植物对于可表达的外源核酸分子半合，并且对于显性不育基因半合，所述可表达的外源核酸分子包含当被表达时抑制第一小麦植物中的显性雄性不育基因或第一小麦植物中的与所述显性雄性不育基因有效连接的启动子的表达的多核苷酸；

(c) 收获种子；

(d) 选择对于与所述破坏雄性繁殖组织的功能和/或发育的基因和所述标记基因连接的可表达的外源核酸半合并且对于所述显性雄性不育基因半合的种子；

(e) 种植来自步骤(d)的种子；

(f) 使从步骤(d)的种子生长的植物自花传粉；并且

(g) 收获来自步骤(f)的种子；

(h) 选择(1)对于与所述破坏雄性繁殖组织的功能和/或发育的基因和所述标记基因连接的所述可表达的外源核酸半合并且(2)对于所述显性不育基因纯合的种子；

(i) 种植来自步骤(h)的种子；

(j) 使从步骤(h)的种子生长的植物自花传粉；并且

(k) 收获来自步骤(j)的植物的种子；并且

(l) 选择对于所述显性不育基因纯合的种子。

9.一种产生雄性不育雌性小麦植物的方法，所述方法包括：

e. 种植来自权利要求8的步骤(l)的种子；并且

f. 使所述种子生长成植物，其中所得的植物对于所述显性不育基因纯合。

10.一种产生杂种小麦植物种子的方法，所述方法包括：

用雄性可育近交系植物为对于根据权利要求9所述的显性不育基因纯合的雄性不育雌性植物进行传粉。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述小麦植物是多倍体植物。

12.一种繁殖由根据权利要求9所述的方法产生的雄性不育小麦植物的方法，所述方法包括将所述植物与对于包含如下的多核苷酸的可表达的外源核酸半合的植物进行杂交，所述多核苷酸当被表达时抑制显性雄性不育基因的表达或影响与所述显性雄性不育基因有效连接的启动子的功能，并且其中所述可表达的外源核酸与以下有效连接：(1)破坏雄性繁殖组织的功能和/或发育的基因和(2)标记基因。