CN105209493A - 用于诊断和治疗用途的her3特异性单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

提供了分离的或重组的抗-HER3单克隆抗体。在一些情况下，实施方案的抗体可用于人疾病诸如癌症的检测、诊断和/或治疗性治疗。

Description

用于诊断和治疗用途的HER3特异性单克隆抗体

本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请No.61/782,770(其整体通过引用并入本文)的权益。

序列表的并入

通过电子递交随同提交在称为“UTFH.P0295WO_ST25.txt”的文件中包含的序列表(其为25KB(如在Microsoft中测量的)并且创建于2014年3月11日)，所述序列表通过引用并入本文。

发明背景

1.发明领域

本发明总体上涉及癌症生物学领域。更具体地，其涉及用于癌症的治疗和检测的HER3靶向单克隆抗体。

2.相关领域的描述

表皮生长因子受体(EGFR)家族(ErbB/HER)由4个已知的成员：EGFR(HER1、erbB-1)、HER2(erbB-2)、HER3(erbB-3)和HER4(erbB-4)组成。每一种受体蛋白具有相同的基本结构，其由细胞外氨基末端结构域、单个跨膜生成序列和细胞内胞浆域组成。ErbB信号转导具有复杂的网络，所述网络具有超过11种的相互作用配体用于不同结合特异性和信号转导途径的激活。HER受体与配体的复杂内容和相互作用为显著的信号多样化提供巨大潜力。

越来越多的证据表明，HER3在HER靶向治疗剂(包括小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，例如吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼以及HER家族受体靶向单克隆抗体诸如曲妥单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗和帕妥珠单抗)的抗性机制中起着重要作用。调蛋白/神经调节蛋白(NRG)是与HER3和HER4相互作用的复杂配体家族的成员。神经调节蛋白结合激活ErbB3，并通过PI3K/AKT和Ras/Raf7MAPK途径导致异二聚体受体复合物的形成和HER3的下游信号传导的激活。因此，阻断神经调节蛋白结合的HER3结合性单克隆抗体具有阻断HER3信号转导和抑制癌细胞增殖的潜力。

发明概述

本文所描述的是强效阻断HER3信号转导和抑制癌细胞增殖的HER3单克隆抗体。因此，在第一实施方案中，提供了特异性结合HER3的分离的或重组的单克隆抗体。在某些方面中，所述抗体与与Rab46、Rab1210、Rab189或Rab774单克隆抗体竞争对HER3的结合。在某些方面，所述抗体可包含Rab46、Rab1210、Rab189或Rab774单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的全部或部分。在其它方面，所述抗体可包含对应于来自本发明的实施方案的Rab46、Rab1210、Rab189或Rab774单克隆抗体的轻可变链和/或重可变链的第一、第二和/或第三互补性决定区(CDR)的氨基酸序列。

在某些方面，所述分离的抗体包含与Rab46、Rab1210、Rab189或Rab774重链和轻链氨基酸序列的CDR区具有至少80％、90％或95％同一性的CDR序列。在其它方面，除在一个或多个CDR上的1或2个氨基酸取代、缺失或插入外，所述抗体包含与Rab46、Rab1210、Rab189或Rab774CDR区相同的CDR区。例如，所述抗体可包含其中CDR序列在V_HCDR1、V_HCDR2、V_HCDR3、V_LCDR1、V_LCDR2和/或V_LCDR3中相对于Rab46、Rab1210、Rab189或Rab774单克隆抗体的CDR包含1或2个氨基酸取代的CDR。因此，在一些具体方面，本发明的实施方案的抗体包含(a)与Rab46(SEQIDNO:9)、Rab1210(SEQIDNO:15)、Rab189(SEQIDNO:21)或Rab774(SEQIDNO:27)的V_HCDR1具有至少80％同一性的第一V_HCDR；(b)与Rab46(SEQIDNO:10)、Rab1210(SEQIDNO:16)、Rab189(SEQIDNO:22)或Rab774(SEQIDNO:28)的V_HCDR2具有至少80％同一性的第二V_HCDR；(c)与Rab46(SEQIDNO:11)、Rab1210(SEQIDNO:17)、Rab189(SEQIDNO:23)或Rab774(SEQIDNO:29)的V_HCDR3具有至少80％同一性的第三V_HCDR；(d)与Rab46(SEQIDNO:12)、Rab1210(SEQIDNO:18)、Rab189(SEQIDNO:24)或Rab774(SEQIDNO:30)的V_LCDR1具有至少80％同一性的第一V_LCDR；(e)与Rab46(SEQIDNO:13)、Rab1210(SEQIDNO:19)、Rab189(SEQIDNO:25)或Rab774(SEQIDNO:31)的V_LCDR2具有至少80％同一性的第二V_LCDR；和(f)与Rab46(SEQIDNO:14)、Rab1210(SEQIDNO:20)、Rab189(SEQIDNO:26)或Rab774(SEQIDNO:32)的V_LCDR3具有至少80％同一性的第三V_LCDR。在某些方面，这样的抗体是包含人IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG4或遗传修饰的IgG)主链上的前述CDR的人源化或去免疫抗体。

在其它方面，分离的抗体包含与单克隆抗体Rab46的对应CDR序列具有至少80％同一性的第一V_H、第二V_H、第三V_H、第一V_L、第二V_L和第三V_LCDR序列，所述CDR序列分别由SEQIDNO:9、10、11、12、13和14显示。在一个方面，分离的抗体包含与单克隆抗体Rab46的CDR序列相同的CDR序列。

在另一个方面，分离的抗体包含与Rab46(SEQIDNO:1)、hRab46H-1(SEQIDNO:33)或hRab46H-2(SEQIDNO:34)的V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与Rab46(SEQIDNO:2)、hRab46L-1(SEQIDNO:35)或hRab46L-2(SEQIDNO:36)的V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域。例如，所述抗体可包含与hRab46H-1的V_H结构域(SEQIDNO:33)具有至少95％同一性的V_H结构域和与hRab46L-1(SEQIDNO:35)或hRab46L-2(SEQIDNO:36)的V_L结构域具有至少95％同一性的V_L结构域。因此，在一些方面，抗体包含与hRab46H-1的V_H结构域(SEQIDNO:33)相同的V_H结构域和与hRab46L-1的V_L结构域(SEQIDNO:35)相同的V_L结构域。在其它方面，抗体包含与hRab46H-1的V_H结构域(SEQIDNO:33)相同的V_H结构域和与hRab46L-2的V_L结构域(SEQIDNO:36)相同的V_L结构域。在另一个方面，抗体包含与hRab46H-2的V_H结构域(SEQIDNO:34)具有至少95％同一性的V_H结构域和与hRab46L-2(SEQIDNO:36)或hRab46L-1(SEQIDNO:35)的V_L结构域具有至少95％同一性的V_L结构域。例如，抗体可包含与hRab46H-2的V_H结构域(SEQIDNO:34)相同的V_H结构域和与hRab46L-2的V_L结构域(SEQIDNO:36)相同的V_L结构域，或与hRab46H-2的V_H结构域(SEQIDNO:34)相同的V_H结构域和与hRab46L-1的V_L结构域(SEQIDNO:35)相同的V_L结构域。在具体实例中，所述分离的抗体可包含与单克隆抗体Rab46、HER3-hMab-A9、HER3-hMab-A10、HER3-hMab-A11或HER3-hMab-A12的V_H和V_L结构域相同的V_H和V_L结构域。在其它方面，所述抗体是HER3-hMab-A9、HER3-hMab-A10、HER3-hMab-A11或HER3-hMab-A12抗体。

在其它方面，所述分离的抗体包含分别由SEQIDNO:15、16、17、18、19和20所示的与单克隆抗体Rab1210的对应CDR序列具有至少80％同一性的第一V_H、第二V_H、第三V_H、第一V_L、第二V_L和第三V_LCDR序列。在一个方面，所述分离的抗体包含与单克隆抗体Rab1210的CDR序列相同的CDR序列。

在另一个方面，所述分离的抗体包含与Rab1210(SEQIDNO:3)、hRab1210H-1(SEQIDNO:37)或hRab1210H-2(SEQIDNO:38)的V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；与Rab1210(SEQIDNO:4)、hRab1210L-1(SEQIDNO:39)或hRab1210L-2(SEQIDNO:40)的V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域。因此，在一些方面，所述抗体包含与hRab1210H-1的V_H结构域(SEQIDNO:37)具有至少95％同一性的V_H结构域和与hRab1210L-1(SEQIDNO:39)或hRab1210L-2(SEQIDNO:40)的V_L结构域具有至少95％同一性的V_L结构域。例如所述抗体可包含与hRab1210H-1的V_H结构域(SEQIDNO:37)相同的V_H结构域和与hRab1210L-1的V_L结构域(SEQIDNO:39)相同的V_L结构域，或与hRab1210H-1的V_H结构域(SEQIDNO:37)相同的V_H结构域和与hRab1210L-2的V_L结构域(SEQIDNO:40)相同的V_L结构域。在其它方面，抗体包含与hRab1210H-2的V_H结构域(SEQIDNO:38)具有至少95％同一性的V_H结构域和与hRab1210L-2(SEQIDNO:40)或hRab1210L-1(SEQIDNO:39)的V_L结构域具有至少95％同一性的V_L结构域。例如，所述抗体可包含与hRab1210H-2的V_H结构域(SEQIDNO:38)相同的V_H结构域和与hRab1210L-2的V_L结构域(SEQIDNO:40)相同的V_L结构域，或与hRab1210H-2的V_H结构域(SEQIDNO:38)相同的V_H结构域和与hRab1210L-1的V_L结构域(SEQIDNO:39)相同的V_L结构域。在具体的实例中，所述分离的抗体可包含与单克隆抗体Rab1210、HER3-hMab-A13、HER3-hMab-A14、HER3-hMab-A15或HER3-hMab-A16的V_H和V_L结构域相同的V_H和VL结构域。在其它方面，所述抗体为HER3-hMab-A13、HER3-hMab-A14、HER3-hMab-A15或HER3-hMab-A16抗体。

在其它方面，所述分离的抗体包含分别由SEQIDNO:21、22、23、24、25和26编码的与单克隆抗体Rab189的对应CDR序列具有至少80％同一性的第一V_H、第二V_H、第三V_H、第一V_L、第二V_L和第三V_LCDR序列。在一个方面，所述分离的抗体包含与单克隆抗体Rab189的CDR序列相同的CDR序列。

在另一个方面，所述分离的抗体包含与Rab189的V_H结构域(SEQIDNO:5)具有至少约80％同一性的V_H结构域和与Rab189的V_L结构域(SEQIDNO:6)具有至少约80％同一性的V_L结构域。在一个方面，所述分离的抗体包含与单克隆抗体Rab189的V_H和V_L结构域相同的V_H和V_L结构域。

在其它方面，所述分离的抗体包含分别由SEQIDNO:27、28、29、30、31和32所示的与单克隆抗体Rab774的对应CDR序列具有至少80％同一性的第一V_H、第二V_H、第三V_H、第一V_L、第二V_L和第三V_LCDR序列。在一个方面，所述分离的抗体包含与单克隆抗体Rab774的CDR序列相同的CDR序列。

在另一个方面，所述分离的抗体包含与Rab774的V_H结构域(SEQIDNO:7)具有至少约80％同一性的V_H结构域和与Rab774的V_L结构域(SEQIDNO:8)具有至少约80％同一性的V_L结构域。在一个方面，所述分离的抗体包含与单克隆抗体Rab774的V_H和V_L结构域相同的V_H和V_L结构域。

在一些方面，实施方案的抗体可以是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgA、经遗传修饰的IgG同种型或其抗原结合片段。所述抗体可以是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、双价scFv、双特异性或单结构域抗体。所述抗体可以是人抗体、人源化抗体或去免疫抗体。在其它方面，所述分离的抗体是Rab46、Rab1210、Rab189或Rab774抗体。

在一些方面，所述抗体可被缀合于成像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素。

在一个实施方案中，提供了包含含有Rab46的V_H结构域的CDR1-3(SEQIDNO:9、10和11)；Rab1210的V_H结构域的CDR1-3(SEQIDNO:15、16和17)；Rab189的V_H结构域的CDR1-3(SEQIDNO:21、22和23)；Rab774的V_H结构域的CDR1-3(SEQIDNO:27、28和29)的抗体V_H结构域的重组多肽。在另一个实施方案中，提供了包含含有Rab46(SEQIDNO:12、13和14)、Rab1210(SEQIDNO:18、19和20)、Rab189(SEQIDNO:24、25和26)或Rab774(SEQIDNO:30、31和32)的V_L结构域的CDR1-3的抗体V_L结构域的重组多肽。

在一些实施方案中，提供了包含编码含有本文中公开的抗体V_H或V_L结构域的抗体或多肽的核酸序列的分离的多核苷酸分子。

在其它实施方案中，提供了产生本发明的实施方案的单克隆抗体或重组多肽的宿主细胞。在一些方面，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。在某些方面，宿主细胞是杂交瘤细胞。

在其它实施方案中，提供了制造本发明的抗体的方法，所述方法包括在细胞中表达一种或多种编码本文中公开的抗体的V_H或V_L链的多核苷酸分子和从所述细胞纯化所述抗体。

在另外的实施方案中，存在包含本文中论述的抗体或抗体片段的药物组合物。此类组合物还包含药学上可接受的载体并且可包含或可以不包含另外的活性成分。

在本发明的实施方案中，提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用有效量的本文中公开的抗体。在某些方面，所述抗体是本发明的单克隆抗体，诸如Rab46、Rab1210、Rab189、Rab774、HER3-hMab-A9、HER3-hMab-A10、HER3-hMab-A11、HER3-hMab-A12、HER3-hMab-A13、HER3-hMab-A14、HER3-hMab-A15或HER3-hMab-A16抗体或包含从其衍生的抗体区段的重组多肽。

在某些方面，癌症可以是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。

在一个方面，可全身性施用所述抗体。在另外的方面，可静脉内、皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用所述抗体。所述方法还可包括向受试者施用至少第二抗癌疗法。第二抗癌疗法的实例包括但不限于手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。

在其它方面，所述方法还可包括向受试者施用本发明的组合物不止一次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20次或更多次。

在另一个实施方案中，提供了用于检测受试者的癌症的方法，所述方法包括测试相对于对照升高的HER3在来自于受试者的样品中的存在，其中所述测试包括将样品与本文中公开的抗体接触。例如，所述方法可以是体外或体内方法。

某些实施方案涉及特异性结合HER3的抗体或包含特异性结合HER3的分离和/或重组的抗体或多肽的重组多肽组合物。在某些方面，所述抗体或多肽具有与本文中提供的任何单克隆抗体的全部或部分具有、至少具有或至多具有80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性(或可源自其中的任何范围)的序列。在其它方面，所述分离的和/或重组的抗体或多肽具有、至少具有或至多具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个来自本文中提供的序列的任何序列的连续氨基酸或此类序列的组合。

在其它方面，本发明的实施方案的抗体或多肽包含一个或多个本文中公开的氨基酸序列的任何氨基酸序列的一个或多个氨基酸区段。例如，所述抗体或多肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸区段，所述氨基酸区段包含长度为约、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个氨基酸，包括其间的所有值和范围，所述区段与本文中公开的氨基酸序列的任何氨基酸序列具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性。在某些方面，所述氨基酸区段选自如表6或图表1中提供的HER3结合抗体的氨基酸序列之一。

在其它方面，本发明的实施方案的抗体或多肽包含本文中公开的氨基酸序列的任何氨基酸序列的氨基酸区段，其中所述区段始于本文中提供的任何序列中的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25至25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200并且终于所述提供的同一序列中的氨基酸位置4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200。在某些方面，所述区段或其部分选自如表6或图表1中提供的HER3结合抗体的氨基酸序列之一。

在其它方面，本发明的实施方案的抗体或多肽包含与HER3-结合抗体的V、VJ、VDJ、D、DJ、J或CDR结构域(如表6和图表1中提供的)具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性(或可源自其中的任何范围)的氨基酸区段。例如，多肽可包含1、2或3个与如表6和图表1中提供的HER3结合抗体的CDR1、2和/或3具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性(或可源自其中的任何范围)的氨基酸区段。

可针对本文中描述的任何其它方法或组合物应用在本发明的方法和/或组合物的上下文中论述的实施方案。因此，关于一个方法的组合物的实施方案同样可用于本发明的其它方法和组合物。

如本文中在说明书中所用，“一个(a)”或“一种(an)”可意指一个或多个。如本文中在权利要求中所用，当与单词“包含”结合使用时，单词“一个(a)”或“一种(an)”可意指一个或超过一个。

除非明确地指明指仅替代方案或替代方案是互斥的，否则权利要求中术语“或”的使用用于意指“和/或”，虽然本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。如本文中所用，“另一个”可指至少第二个或更多。

在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括装置、用于测定值的方法的固有误差变化或存在于研究受试者之间的变化。

根据下列详细描述本发明的其它目的、特性和有利方面将变得显然。然而，应理解，所述详细描述和特定实施例(虽然显示本发明的优选实施方案)仅通过举例说明的方式给出，因为根据本详细描述，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域普通技术人员将变显然。

附图简述

下列附图形成本说明书的部分并且被包括来进一步例证本发明的某些方面。通过结合本文中所示的特定实施方案的详细说明参考这些附图的一个或多个可更好地理解本发明。

图1.抗体选择的工艺流程。

图2.用于兔Fab表达的噬菌体展示载体。

图3.使用表达异源HER3的CHO细胞进行的抗-Her3抗体对人和小鼠HER3/ErbB3的结合。

图4.纯化的抗-Her3IgG在HER3磷酸化的抑制测定中的剂量反应。

图5.HER3MabIgG在MCF7细胞中产生的pAKT和pERK抑制。

图6.使用α筛选格式和图表的配体阻断测定显示抗-HER3抗体的剂量反应。

图7.抗HER3抗体对MCF7细胞的NRG诱导的细胞生长的抑制。数据显示为由抗体导致的相对于无抗体对照减少的百分比。

图8.通过ELISA测定的人源化HER3单克隆抗体对HER3ECD的浓度依赖性结合。

图9.通过Biacore测定的人源化HER3单克隆抗体对HER3ECD的动力学结合亲和力。

图10.人源化HER3单克隆抗体在T47D癌细胞中对pHER3的浓度依赖性抑制。

图11.人源化HER3单克隆抗体对CWR22癌细胞增殖的浓度依赖性抑制。

图12.人源化HER3单克隆抗体对MCF-7癌细胞增殖的浓度依赖性抑制。

举例说明性实施方案的描述

I.本发明的抗体

在某些实施方案中，设想结合HER3蛋白的至少部分并且抑制HER3信号转导和癌细胞增殖的抗体或其片段。如本文中所用，术语“抗体”意欲广泛地指任何免疫结合剂，诸如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和经遗传修饰的IgG，以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。所述抗体选自嵌合抗体、亲和成熟抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体或抗原结合抗体片段或天然的或合成的配体。

优选地，抗-HER3抗体是单克隆抗体或人源化抗体。实际上本文中所示的研究表明可将HER3-结合抗体的鉴定的CDR置于人框架中，并且所得的人源化抗体保持对于HER3的高亲和力(图8-9)。重要地，人源化抗体还高效地抑制HER3信号转导(图10)并且能够抑制HER3阳性癌细胞的癌细胞复制(图11-12)。因此，本文中提供的HER3结合抗体，特别地人源化抗体，是新的抗癌治疗剂的有前景的候选者。

因此，通过已知的方法和如本文中所描述的，可产生对于HER3蛋白、其各自表位的一个或多个表位或任何前述表位的缀合物(无论此类抗原或表位是从天然来源分离的还是天然化合物的合成衍生物或变体)是特异性的多克隆或单克隆抗体、抗体片段以及结合结构域和CDR(包括任何前述物质的工程化形式)。另一种变异是其中一条重链靶向HER3并且另一条重链靶向不同癌细胞靶诸如HER2、EGFR、IGF1R、cMet或其它细胞表面靶的双特异性抗体的构建。

适合用于本发明的实施方案的抗体片段的实例包括，但不限于：(i)由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的Fab片段；(ii)由V_H和C_H1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单个抗体的V_L和C_H结构域组成的“Fv”片段；(iv)由V_H结构域组成的“dAb”片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的双价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中V_H结构域与V_L结构域通过允许两个结构域结合以形成结合结构域的肽接头连接；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利No.5,091,513)；和(ix)双链抗体，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(美国专利申请公开20050214860)。Fv、scFv或双链抗体分子可通过掺入连接V_H和V_L结构域的二硫桥来稳定。还可产生包含连接于CH3结构域的scFv的微抗体(Hu等人，1996)。

抗体样结合拟肽也被包含在实施方案中。Liu等人(2003)描述了“抗体样结合拟肽”(ABiP)，其为用作简化抗体并且具有更长的血清半衰期以及不太繁冗的合成方法的某些有利方面的肽。

可用抗原诸如HER3细胞外结构域蛋白(NCBI登录号M34309的氨基酸1-643)接种动物，以产生对于HER3蛋白是特异性的抗体。经常地将抗原结合或缀合于另一种分子以增强免疫应答。如本文中所用，缀合物是结合于用于引发动物的免疫应答的抗原的任意肽、多肽、蛋白质或非蛋白质性质的物质。动物中响应抗原接种产生的抗体包含从多种单个抗体生成B淋巴细胞产生的多种非相同分子(多克隆抗体)。多克隆抗体是抗体种类的混合群体，所述抗体种类的每一种可识别相同抗原上的不同表位。给定用于在动物中产生多克隆抗体的正确条件，动物血清中的大多数抗体将识别动物已被其免疫的抗原性化合物上的集体表位。该特异性通过亲和纯化以仅选择识别目标抗原或表位的那些抗体来进一步增强。

单克隆抗体是其中每一个抗体分子识别相同表位(因为所有抗体生成细胞来源于单个B淋巴细胞系)的单种抗体。用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的那些路线相同的路线开始。在一些实施方案中，将啮齿类动物诸如小鼠和大鼠用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或蛙的细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是公知的并且可提供某些有利方面。小鼠(例如，BALB/c小鼠)被常规地使用并且通常提供高百分比的稳定融合物。

杂交瘤技术包括来自先前用HER3抗原免疫的小鼠的单个B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞(通常地小鼠骨髓瘤)的融合。该技术提供扩增单个抗体生成细胞无穷数目代的方法，以便可产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同的抗体(单克隆抗体)。

血浆B细胞可分离自被免疫的兔的新鲜制备的兔外周血单核细胞，并且被进一步选择用于HER3结合细胞。在富集抗体生成B细胞后，可分离总RNA并合成cDNA。可扩增来自重链和轻链的抗体可变区的DNA序列，将其构建入噬菌体展示Fab表达载体，并转化进大肠杆菌(E.coli)。可通过多轮富集淘选选择出HER3特异性结合Fab，并对其进行测序。可将选定的HER3结合命中在兔中表达为全长IgG和使用哺乳动物表达载体系统将其在人胚胎肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中表达为兔/人嵌合形式，并利用快速蛋白液相色谱(FPLC)分离单位使用蛋白G树脂进行纯化。

在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如，包含移植至非人序列、人序列或人源化序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)的来自非人供体的抗原结合序列的抗体。已开发方法来用人来源的类似结构域替代单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，从而保持外来抗体的可变区完整。或者，在人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中产生“完全人”单克隆抗体。也已开发方法来通过重组构建具有啮齿类动物例如小鼠和人氨基酸序列的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转变成更具人形式。在“人源化”单克隆抗体中，仅高变CDR来源于小鼠单克隆抗体，并且框架和恒定区来源于人氨基酸序列(参见美国专利No.5,091,513和6,881,557)。据认为用在人抗体的对应位置中发现的氨基酸序列替代为啮齿类动物的特征的抗体中的氨基酸序列将在治疗使用过程中减小不利免疫反应的可能性。还可将杂交瘤或其它产生抗体的其它细胞经历遗传突变或其它改变，这可以改变或可以不改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。

用于在各种动物物种中产生单克隆抗体以及用于产生不同类型(包括人源化、嵌合和完全人)的单克隆抗体的方法在本领域中是公知的并且是高度可预测的。例如，下列美国专利和专利申请提供此类方法的使能描述：美国专利申请No.2004/0126828和2002/0172677；和美国专利No3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,196,265、4,275,149、4,277,437、4,366,241、4,469,797、4,472,509、4,606,855、4,703,003、4,742,159、4,767,720、4,816,567、4,867,973、4,938,948、4,946,778、5,021,236、5,164,296、5,196,066、5,223,409、5,403,484、5,420,253、5,565,332、5,571,698、5,627,052、5,656,434、5,770,376、5,789,208、5,821,337、5,844,091、5,858,657、5,861,155、5,871,907、5,969,108、6,054,297、6,165,464、6,365,157、6,406,867、6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434和6,891,024。本文中引用的和本文中的所有专利、专利申请公开案和其它出版物在此通过引用并入本申请。

可从任何动物来源(包括鸟类和哺乳动物)产生抗体。优选地，所述抗体是羊、鼠(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡来源的。此外，新的技术允许开发人抗体和从人组合抗体文库筛选人抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在动物免疫不存在的情况下生产特异性抗体，如在美国专利No.6,946,546(其通过引用并入本文)中所描述的。这些技术在Marks(1992)；Stemmer(1994)；Gram等人(1992)；Barbas等人(1994)；和Schier等人(1996)中进行了进一步描述。

可完全预期针对HER3的抗体将具有中和或抵消HER3的作用而无论动物物种、单克隆细胞系或抗体的其他来源的能力。某些动物物种对于产生治疗性抗体可能是不太优选的，因为它们可以更容易引起因补体系统的激活(通过“Fc”部分)而导致的过敏反应。然而，完整抗体可被酶促消化成“Fc”(补体结合)片段，和具有结合结构域或CDR的抗体片段。Fc部分的除去减小抗原抗体片段将引发不期望的免疫应答的可能性，并且因此，无Fc的抗体对于预防性或治疗性治疗可以是优选的。如上所述，还可构建抗体，以成为嵌合抗体或部分或完全人抗体，以减少或消除因向动物施用已在其它物种中产生的或具有来自其它物种的序列的抗体而引起的不利免疫后果。

替代变体通常在蛋白质内的一个或多个位点上含有一个氨基酸对另一个氨基酸的交换，并且可被设计来调节多肽的一个或多个性质(具有或不具有其它功能或性质的丧失)。取代可以是保守的，即，一个氨基酸被具有相似形状和电荷的氨基酸替代。保守取代是本领域公知的，且包括例如如下变化：丙氨酸至丝氨酸、精氨酸到赖氨酸、天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸、天冬氨酸至谷氨酸、半胱氨酸至丝氨酸、谷氨酰胺至天冬酰胺、谷氨酸至天冬氨酸、甘氨酸至脯氨酸、组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺、异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸、亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸、赖氨酸至精氨酸、甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸、苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸、丝氨酸至苏氨酸、苏氨酸至丝氨酸、色氨酸至酪氨酸、酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸、以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。或者，取代可以是非保守，以使得多肽的功能或活性受到影响。非保守性变化通常包括用化学上不同的残基取代残基，诸如用极性或带电荷的氨基酸取代非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。

蛋白质可以是重组的或体外合成的。或者，可从细菌分离非重组或重组蛋白。还设想可将含有此类变体的细菌应用于组合物和方法中。因此，不需要分离蛋白质。

设想在组合物中，每ml存在约0.001mg至约10mg的总多肽、肽和/或蛋白质。因此，组合物中蛋白质的浓度可以是为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或可源自其中的任何范围)。在这当中，约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可以是结合HER3的抗体。

抗体或优选地抗体的免疫部分可被化学缀合于其它蛋白质或表达为与其它蛋白的融合蛋白。为了本说明书和所附权利要求的目的，所有此类融合的蛋白质被包括在抗体或抗体的免疫部分的定义中。

实施方案提供针对HER3的抗体或抗体样分子、连接于至少一种试剂以形成抗体缀合物或有效载荷的多肽和肽。为了增强抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，常规地连接或共价结合或复合至少一种所需的分子或部分。此类分子或部分可以是，但不限于至少一种效应分子或报告分子。效应分子包含具有所需活性例如细胞毒性活性的分子。已被附接于抗体的效应分子的非限定实例包括毒素、治疗性酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相反地，报告分子被定义为可使用测定进行检测的任何部分。已被缀合于抗体的报告分子的非限定性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体诸如生物素。

在本领域中已知几种用于将抗体附接于或缀合于其缀合物部分的方法。一些附接方法包括金属螯合物的使用，使用例如有机螯合剂诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-对-甲苯磺酰胺；和/或附接于抗体的四氯-3-6？-二苯基甘脲-3。单克隆抗体还可在偶联剂诸如二苯基甘脲或高碘酸盐存在的情况下与酶反应。在这些偶联剂存在的情况下或通过与异硫氰酸酯反应来制备与荧光素标记的缀合物。

II.疾病的治疗

本发明的实施方案的某些方面可用于预防或治疗与HER3信号转导相关的疾病或病症。HER3的信号转导可利用任何适当的药物来减弱以阻止癌细胞增殖。优选地，此类物质可以是抗-HER3抗体。

“治疗”和“医治”是指出于获得疾病或健康相关病况的治疗益处的目的向受试者施用或施加治疗剂或对受试者进行手术操作或物理疗法。例如，治疗可包括施用药物有效量的抑制HER3信号转导的抗体。

“受试者”和“患者”是指人或非人，诸如灵长类动物、哺乳动物和脊柱动物。在具体实施方案中，所述受试者是人。

如在整个本申请中所用的，术语“治疗益处”或“治疗上有效的”是指改善或提高受试者在该病况的医学治疗方面的福利的任何效果。这包括，但不限于疾病的体征或症状的频率或严重度。例如，癌症的治疗可包括，例如肿瘤尺寸的减小、肿瘤侵袭性的降低、癌症生长速率的减小或转移的阻止。癌症的治疗还可指患有癌症的受试者的延长的存活。

A.药物制剂

当进行含有抑制性抗体的治疗性组合物的临床应用时，通常有益地制备适合用于期望的应用的药物或治疗性组合物。在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其它实施方案中，活性化合物可包含例如约2％至约75％或约25％至约60％的单位重量，以及可从源自其中的任何范围。

有利地以可注射组合物的形式(作为液体溶液或悬浮液)施用本发明的实施方案的治疗性组合物；还可制备适合在注射之前在液体中配制成溶液或悬浮液的固体形式。还可乳化这些制剂。

短语“药学上或药理学上可接受的”是指当(适当时)向动物诸如人施用时不产生不利反应、过敏反应或其它不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含抗体或额外的活性成分的药物组合物的制备对于本领域普通技术人员来说是已知的。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制剂应当满足如FDA生物标准办公室要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文中所用，“药学上可接受的载体”包括任何和全部含水溶剂(例如，水、醇/含水溶液、盐水溶液、胃肠外媒介物，诸如氯化钠、林格氏葡萄糖等)、非含水溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇，植物油和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯)、分散介质，包衣，表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸附延迟剂、盐、药物，药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、液体和营养补充剂、这样的类似材料及其组合，这对于本领域普通技术人中来说是已知的。根据公知的参数调整药物组合物中的各种组分的pH和确切浓度。

术语“单位剂量”或“剂量”是指适合用于受试者的物理上分开的单位，每一个单位含有经计算产生上文中论述的与其施用(即，适当的途径和治疗方案)相关的期望的反应的预定量的治疗性组合物。待施用的量(根据治疗的次数和单位剂量)取决于期望的效果。向患者或受试者施用的本发明的实施方案的组合物的实际剂量可根据身体和生理因素诸如受试者的体重、年龄、健康和性别、待治疗的疾病的类型、疾病渗透的程度、先前或当前的治疗干预、患者的特发症、施用途径以及具体治疗物质的效力、稳定性和毒素来测定。例如，剂量还可包含每施用约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该这样的范围包括其间的剂量)或更多以及可源自其中的任何范围。在可源自本文中所列的数字的范围的非限定性实例中，可施用约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重的范围等。负责施用的医生在任何情况下将测定用于个体受试者的组合物和适当剂量中的活性成分的浓度。

可配制活性化合物以用于胃肠外施用，例如，配制用于通过静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径的注射。通常地，可将此类组合物制备为液体溶液或悬浮液；还可制备适合用于在注射之前在添加液体后制备溶液或悬浮液的固体形式；以及，还可乳化制剂。

适合注射使用的药物形式包括无菌含水溶液或分散体；包含芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；和用于无菌可注射液或分散体的临时制备的无菌粉剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须具有达到其可容易地被注射的程度的流动性。其还应当在制造和贮存条件下是稳定的，并且必须进行防腐处理以抵抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。

可将蛋白质性质的组合物配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与无机酸(诸如例如盐酸或磷酸)或这样的有机酸如例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)。与游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化氨、氢氧化钙或氢氧化铁，以及衍生自这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

药物组合物可包含含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适当的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的防止可利用各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如糖类或氯化钠。可注射组合物的延长的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝或明胶来实现。

B.联合治疗

在某些实施方案中，本发明的组合物和方法牵涉与第二或另外的疗法组合的抑制HER3在癌细胞增殖中的活性的针对HER3的抗体或抗体片段。此类疗法可用于治疗与HER3介导的细胞增殖相关的任何疾病。例如，所述疾病可以是癌症。

所述方法和组合物(包括联合治疗)提高治疗或保护效果，和/或增强另一种抗癌或抗过度增殖性疗法的疗效。可以以有效地实现所需效果诸如癌细胞的杀死和/或细胞增殖的抑制的组合量提供治疗性和预防性方法和组合物。该方法可包括将所述细胞与抗体或抗体片段和第二疗法接触。可将组织、肿瘤或细胞与一种或多种包含一种或多种试剂(即，抗体或抗体片段或抗癌剂)的组合物或药物制剂接触，或通过将组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物提供1)抗体或抗体片段，2)抗癌剂或3)抗体或抗体片段和抗癌剂。同样地，设想可将这样的联合治疗与化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法结合使用。

术语“接触的”和“暴露的”，当用于细胞时，在本文中用于描述籍以将治疗性构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并置放置的过程。为了实现细胞杀死，例如将两种试剂以有效地杀死细胞或阻止其分裂的组合量递送至细胞。

可在抗癌治疗之前、期间、之后或以各种组合施用抑制性抗体。施用可具有从同时至数分钟至数天至数周的间隔。在其中将抗体或抗体片段与抗癌试剂单独地向患者提供的实施方案中，通常确保相当长的时间不在每一次递送的时间之间终止，以便两种化合物仍然能够对患者产生有利地组合的效果。在此类情况下，设想可为患者提供彼此约在12至24小时或72小时内，更具体地，彼此在约6-12小时内的抗体疗法和抗癌疗法。在一些情形下，可能期望显著延长治疗时期，其中在各自施用之间经历数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

在某些实施方案中，治疗过程将持续1-90天或更多天(该这样的范围包括间隔天数)。设想可在第1至第90天的任何天(该这样的范围包括间隔天数)或其任意组合施用一种试剂，并且在第1至第90天的任何天(该这样的范围包括间隔天数)或其任意组合施用另一种试剂。在一天(24小时的时期)内，可向患者施用试剂一次或多次。此外，在治疗过程后，设想存在不施用抗癌治疗的一段时间。取决于患者的病况，诸如他们的预后、抵抗力、健康等，该时间段可持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长时间(该这样的范围包括间隔天数)。预期必要时可重复治疗周期。

可使用各种组合。对于下列实例，抗体疗法为“A”并且抗癌疗法为“B”：

A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/B

B/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/A

B/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A

向患者施用本发明的任何化合物或疗法将遵从用于此类化合物的施用的一般方案，考虑试剂的毒性(如果有的话)。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于联合治疗的毒性的步骤。

i.化学疗法

可按照本发明的实施方案使用许多化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些试剂或药物根据它们在细胞内的活性模式(例如它们是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期)来分类。或者，可基于其直接交联DNA、嵌入DNA或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂异常的能力表征试剂。

化学治疗剂的实例包括烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，诸如苯并多巴，卡巴醌，美妥替哌和uredopa；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑密胺、三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；番荔枝内酯(尤其是泡番荔枝辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(特别是大环内酯1和大环内酯8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氧化氮芥盐酸盐、美法仑、新恩比兴、胆甾醇苯乙酸氮芥、泼尼氮芥(Prednimustine)、曲磷胺(Trofosfamide)和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷诺氮芥；抗生素，诸如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γlI和加利车霉素ωI1)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉基-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和去氧阿霉素)、表阿霉素、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非罗霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和净司他丁；抗-代谢产物、诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗-肾上腺、诸如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；双蒽生；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依佛鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登素类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；nitraerine；喷司他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根瘤菌素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙基胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地新；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多烯紫杉醇吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基蛋白转移酶抑制剂、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反式铂和任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

ii.放射疗法

引起DNA损伤并且已被广泛使用的其它因素包括通常称为γ-射线、X-射线和/或放射性同位素至肿瘤细胞的直接递送。还设想了DNA损伤因素的其它形式，诸如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV-辐照。最可能的是所有这些因素都对DNA、对DNA的前体、对DNA的复制和修复以及对染色体的装配和维持造成广泛的损伤。X射线的剂量范围为持续长时间(3至4周)的50至200伦琴的日剂量至2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化宽广，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射强度和类型以及被赘生性细胞的吸收。

iii.免疫疗法

本领域普通技术人员将理解，可将另外的免疫疗法与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景中，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向并破坏癌细胞。利妥昔单抗是这样的一个实例。免疫效应子可以是例如对于肿瘤细胞表面上的一些标志物是特异性的抗体。所述抗体单独地可用作治疗的效应子或其可募集其它细胞来实际上实现细胞杀伤。抗体还可被缀合于药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、篦麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且仅用作靶向剂。或者，所述效应子可以是携带与肿瘤细胞靶直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须具有一些适合于靶向，即不存在于大多数其它细胞上的标志物。许多肿瘤标志物存在并且这些标志物的任一种可适合于在本发明的实施方案的背景中进行靶向。常见肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erbB和p155。免疫疗法的另一方面是组合抗癌作用与免疫刺激作用。还存在免疫刺激分子，包括细胞因子，诸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趋化因子，诸如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子，诸如FLT3配体。

目前处于研究或使用中的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如，牛型分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人，1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因疗法，例如，TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如抗-CD20、抗-神经节苷脂GM2和抗-p185(Hollander,2012；Hanibuchi等人，1998；美国专利5,824,311)。设想可将一种或多种抗癌疗法与本文中描述的抗体疗法一起使用。

iv.手术

约60％的具有癌症的人将经历相同类型的手术，所述手术包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和缓解性手术。治愈性手术包括其中癌症组织的全部或部分被物理除去、切除和或破坏的切除，并且可与其它疗法诸如本发明的实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法结合使用。肿瘤切除是指肿瘤的至少部分的物理去除。除了肿瘤切除外，利用手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和用显微镜控制的手术(莫氏手术)。

在癌性细胞、组织或肿瘤的部分或全部切除后，可在体内形成腔。所述治疗可通过用另外的抗癌疗法对所述区域进行灌注、直接注射或局部敷药来实现。可以例如每1、2、3、4、5、6或7天或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复此类治疗。这些治疗同样可具有不同的剂量。

v.其它试剂

设想可将其它试剂与本发明的实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的治疗功效。这些另外的试剂包括实现细胞表面受体和GAP连接、细胞生长抑制和分化剂、细胞粘着的抑制剂、增强过度增殖细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的试剂、或其它生物试剂的上调。通过增加GAP连接的数目产生的细胞信号转导的增加可增强对相邻过度增殖的细胞群体的抗过度增殖作用。在其它实施方案中，可将细胞抑制或分化剂与本发明的实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖的功效。设想细胞粘着的抑制剂改善本发明的实施方案的功效。细胞粘着抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还设想可将增强过度增殖细胞对细胞调亡的敏感性的其它试剂诸如抗体c225与本发明的实施方案的某些方面组合来改善治疗功效。

III.试剂盒和诊断剂

在实施方案的各个方面，预想试剂含有治疗剂和/或其它治疗剂和递送试剂。在一些实施方案中，本发明的实施方案涉及用于制备和/或施用实施方案的疗法的试剂盒。所述试剂盒可包含一个或多个装有本发明的实施方案的任何药物组合物的密封小瓶。所述试剂盒可包括例如至少一种HER3抗体以及制备、配制和/或施用实施方案的组分或进行本发明的方法的一个或多个步骤的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还可包含适当的容器，其为不会与试剂盒的组分反应的容器，诸如eppendorf管、测定板、注射器、瓶子或管。所述容器可由可灭菌性材料诸如塑料或玻璃制造。

所述试剂盒还可包括概述本文中所示的方法的流程步骤的说明书，并且将遵照与本文中描述的方法大体上相同的方法或对于本领域普通技术人员来说是已知的。所述说明书信息可存在于含有机器可读指令的计算机可读介质中，所述指令，当使用计算机执行时，显示递送药物有效量的治疗剂的真实或实际流程。

IV.实施例

下列实施例被包括来显示本发明的优选实施方案。本领域普通技术人员应当理解，实施例中公开的技术遵循由本发明人发现的在本发明的实践中运行良好，从而可被认为构成用于其实施的优选模式的代表性技术。然而，本领域普通技术人员根据本公开内容应理解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下在公开的特定实施方案中产生许多变化并且仍然获得类似或相似的结果。

实施例1-使用从抗原免疫的兔分离的HER3抗原结合血浆B细胞从噬菌体展示Fab文库生成兔单克隆抗体

ErbB3(Genebank登录号M34309)细胞外结构域(ECD)(氨基酸Met1-Thr643)蛋白用于在Bethyllaboratories,Inc(Montgomery,TX)免疫新西兰兔。用100μg/兔给药免疫兔。在初次免疫后，以2-3周的给药间隔施用2次加强给药。通过将HER3ECD蛋白涂覆在96孔板(max-sorb板，Nunc)上，在ELISA中利用一系列血清稀释液测定抗-Her3血清，并且利用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗-兔抗体和TMB底物检测结合抗体。将450nm处的吸光度用于测定抗体血清滴度。当滴度达到>10⁶时，从免疫的兔取出全血样品，并使用荧光辅助细胞分选(FACS)仪(BDFACSAria^TMIII,BDBiosciences)从新鲜制备的兔外周血单核细胞分离血浆B细胞(CD45+CD5-CD19+)。进一步选择分离的血浆细胞中的HER3结合细胞。在抗体生成B细胞富集后，分离总RNA，并按照制造商的建议，使用superscript逆转录酶II(Invitrogen)合成cDNA。使用一组设计的引物(表1)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增来自重链和轻链的抗体可变区的DNA序列，参见，例如，Ridder等人，2001(通过引用并入本文)。将扩增的DNA构建成噬菌体展示Fab表达载体(图2)并转化进大肠杆菌(TG1)细胞。在噬菌体展示载体系统中构建10^8-9的文库大小，通过两轮富集淘选选择出HER3特异性结合Fab，并对其进行测序(LoneStarLabs,TX)。在图1中举例说明了用于抗体选择的方法流程。

可将选定的HER3结合命中在兔中表达为全长IgG，和使用哺乳动物表达载体系统将其在人胚胎肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中表达为兔/人嵌合形式，并利用快速蛋白液相色谱(FPLC)分离单元，使用蛋白G树脂进行纯化。表征纯化的HER3抗体的各种生物学性质。

表1.用于从兔血浆B细胞克隆可变重链和轻链cDNA序列的PCR引物组。

实施例2–利用流式细胞术和ELISA测量人和小鼠HER3/ErbB3的结合

将表达人或小鼠HER3受体的CHOFlp-in(Invitrogen)细胞系用于研究HER3抗体对细胞表面受体的结合。使用不含酶的EDTA离解溶液分离表达HER3的细胞并将以约1x10⁶个细胞/ml的浓度将其重悬浮于PBS,2％FBS中。在4℃用纯化的HER3IgG对细胞进行染色40分钟，通过以1200rpm离心10分钟在含有2％FBS的PBS中洗涤细胞2次。除去上清液，在4℃用缀合有R-PE的抗-兔IgG对细胞染色30分钟。随后用4mL含有2％FBS的PBS洗涤细胞，在流式细胞仪(Quava,Millipore)上分析所述细胞。图3显示兔HER3抗体对人和小鼠HER3表达细胞的结合，如通过与非特异性兔IgG结合对照相比较荧光强度(X-轴)的增加所指示的。

实施例3–利用BiacoreT-100使用表面等离子体共振(SPR)测定进行的HER3结合亲和力的测定

以45μl/分钟的流速在25℃进行所有实验。为了准备BIAcore测定，使用如由制造商描述的胺偶联法将抗-兔IgG抗体(各自50μg/ml，于醋酸盐缓冲液,pH5.0中)固定在羧甲基葡聚糖传感器芯片(CM5)上。将待测试的纯化的兔Mab以5μg/ml的浓度稀释于0.5％P20,HBS-EP缓冲液中，并注射在FC2上以达到500至1000RU。将FC1用作参照细胞。特定的信号对应于在FC2上获得的信号相对在FC1上获得的信号的差异。以在0.5％P20,HBS-EP缓冲液中的系列浓度稀释度(100、50、25、12.5、6.25和3.13、1.56nM)在90秒时间内注射分析物(重组人HER3，在SDS-PAGE凝胶上的表观分子量为97kDa)。在0.5％P20,HBS-EP中从原液制备这些浓度。在30分钟的时间内监测分析物的解离相。也在与双参照相同的条件下注射电泳缓冲液。在每一个运行周期后，通过注射20至45μl的甘氨酸-HCl缓冲液pH1.5再生两种流动细胞。对HER3的结合K_D通过每一种HER3单克隆抗体(表2)的koff/kon动力学速率来计算。

表2.使用BIAcore(SPR)分析测定的对人HER3/ErbB3细胞外结构域的HER3抗体结合动力学常数

纯化的单克隆HER3抗体	KD(nM)
		Rab46	73±0.13
Rab1210	1.0±0.05
		Rab189	3.6±0.16
Rab774	0.16±0.01

实施例4-HER3单克隆抗体的内化研究

将T47D乳腺癌癌细胞培养至80％的汇合。分离细胞，将其重悬浮于完全培养基中以计数细胞。在2μg/ml的HER3IgG存在和不存在的情况下在37℃孵育浓度约1x10⁷个/ml的细胞，进行3小时。用4mLPBS,2％FBS洗涤细胞，并利用HER3抗体(10μg/ml)作为一级结合抗体在4℃染色40分钟。在用PBS,2％FBS洗涤后，用0.5μg缀合有R-PE的山羊抗-兔抗体(BDPharmingen)在4℃对细胞染色30分钟，用箔覆盖所述细胞。用4mLPBS,2％FBS洗涤细胞，随后以1200rpm离心10分钟。将细胞在PBS/10％甲醛中进行固定，并使用流式细胞仪(Quava,Millipore)进行分析。通过下式计算由分离的HER3单克隆抗体介导的HER3受体内化的百分比：(无抗体对照的平均荧光强度(MFI)-抗体处理的细胞的MFI)/对照的MFIX100，示于表3中。

表3.由抗-HER3抗体介导的HER3受体内化的百分比

HER3单克隆抗体	受体内化的百分比
		Rab46	39±2
Rab1210	62±5
		Rab189	55±4
Rab774	60±8

实施例5–兔HER3单克隆抗体对pHER3、pAKT和pERK1/2的抑制

将MCF7细胞以约3x10⁵个细胞/ml的细胞密度接种在96孔板中，并培养过夜。将细胞培养基更换成低血清(0.5％FBS)，进行15小时，在37℃利用分离的HER3单克隆抗体处理细胞2小时。用3.3nMrhNRG1-β1在37℃刺激细胞20分钟，随后产生细胞裂解液。在产生细胞裂解液之前，用冷PBS,0.5％BSA洗涤细胞3次。在4℃在轻轻摇动下向每一个孔中添加细胞提取缓冲液(含有新鲜的1mMPMSF、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物)，进行30分钟。在通过上下移液3-5次将裂解液混合后，以3,000rpm将板离心10分钟，在下列测定中使用细胞上清液。

对于pHER3抑制测定，在4℃用4μg/ml的小鼠抗-人HER3抗体(R&DSystems)涂覆maxi-sorp板(Costar96孔板)过夜，在室温下用含2％BSA的PBS封闭板2小时。将100μl的细胞上清液转移至封闭的测定板，并在RT孵育2小时。用300μl含有Tween20(0.05％)的PBS洗涤板5次。随后添加二级抗体抗-p-酪氨酸-HRP(R&DSystems)并在RT下孵育1小时，随后进行检测。重复洗涤步骤，在RT下在轻轻摇动下添加HRP化学发光底物(Millipore,CA)，进行5分钟，随后使用板读数器(MolecularDevices,CA)读取发光信号。使用下式计算pHER3的抑制的百分比：(无抗体处理的细胞的信号-抗体处理的细胞的信号)/对照的信号X100。3-4个重复的平均值用于浓度依赖性抑制测定(图4)。使用利用GraphPadprism(v5.1)拟合的滴定曲线测定的IC₅₀示于表4中。

对于pAKT抑制测定，使用来自R&D系统的抗体，将相似的ELISA格式用于捕获总AKT蛋白。在用300μl/孔的PBS-T洗涤板5次后，添加二级抗体生物素化兔抗-人磷-Akt(S473)以在RT下孵育1小时。通过在RT下孵育20分钟，将链霉抗生物素蛋白-HRP用于检测。在洗涤板后，添加HRP化学发光底物，进行5-10分钟，并使用板读数器(MolecularDevices)读取板。使用下式计算pAKT的抑制的百分比：(无抗体处理的细胞的信号-抗体处理的细胞的信号)/对照的信号X100。3-4个重复的平均值用于浓度依赖性抑制测定(图5)。使用利用GraphPadprism(v5.1)拟合的滴定曲线测定的IC₅₀示于表4中。

对于pERK1/2抑制测定，在摇动的情况下用含有3％BSA的TRIS封闭MesoScaleDiscovery(MSD)预涂覆的板。将细胞裂解液(25μl/孔)转移至封闭的测定板，并在摇动的情况下在RT下孵育2小时。用300μl/孔的Tris缓冲液洗涤孔3次，并按照制造商的建议，利用来自MSD测定试剂盒的MSD抗-磷-ERK1/2(T/Y：202/204；185/187)抗体和SULFO-TAG^TM溶液进行检测。在MSDSECTOR^TMImager2400上读取板，并使用下式进行分析：(无抗体处理的细胞的信号-抗体处理的细胞的信号)/对照的信号X100。3-4个重复的平均值用于浓度依赖性抑制测定(图5)。使用利用GraphPadprism(v5.1)拟合的滴定曲线测定的IC₅₀示于表4中。

实施例6-HER3单克隆抗体阻断配体神经调节蛋白对HER3的结合

HER3配体神经调节蛋白(NRG1)可结合在HER3细胞外结构域上并且激活HER3磷酸化和下游信号转导。使用α筛选格式测定来测定选定的兔HER3单克隆抗体阻断配体对HER3的结合。使用生物素化试剂盒(FisherScientific)对NRG1(R&DSystems)进行生物素化，并用10个组氨酸(His)标记HER3ECD。在不透明/白色半孔面平板(Costar)中，将纯化的抗-HER3Mab以2倍系列稀释至由25mMHepes,100mMNaCl,0.5％BSA和0.05％Tween20制备的测定缓冲液中。兔IgG1用作阴性对照。以10nM的浓度向含有系列稀释的抗体的测定板中连续添加生物素化NRG-1β配体和Her3/His₁₀受体。在轻轻摇动的情况下在室温孵育受体、配体和抗体的混合物90分钟。将AlphaScreen抗链霉生物素蛋白供体珠粒和His-镍受体珠粒以各自20μg/ml的终浓度添加至测定中。用箔覆盖测定板，在轻轻摇动的情况下在室温孵育1小时。在EnVision板读数器上读取板。HER3单克隆抗体阻断NRG1配体对HER3的结合显示浓度依赖性(图6)，使用GraphPad，使用四参数曲线与浓度滴定曲线图拟合来估计IC₅₀值(表4)。

表4.从剂量依赖性滴定曲线评估的抗-HER3抗体对pHER3的抑制、pAKT的抑制、pERK的抑制和对NRG配体结合的抑制的IC50

实施例7-抗-HER3mAb对癌细胞增殖的抑制

为了测定分离的HER3抗体对癌细胞增殖的抑制，将3000个细胞/孔的MCF7(人乳腺癌)癌细胞接种在96孔板上的100μl的10％FBS培养基中，在37℃培养箱中过夜。用含有HER3抗体的0.5％FBS培养基替代培养基，并在用100ng/mlβ-NRG刺激(通过将配体直接添加至含有抗体的培养基中)的情况下培养72小时。通过将10μl的AlamarBlum^TM(Invitrogen)添加至培养基中来测量细胞增殖，将细胞在37℃培养箱中进行孵育，在添加AlamarBlum^TM(在535nm激发和在590nm发射)后2小时测量荧光信号。将在MCF7细胞中生长的NRG诱导的细胞生长的抑制计算为抗体处理相对于无抗体处理的减少的百分比(图7)，并且IC₅₀值列于表5中。

表5.抗-HER3单克隆抗体对癌细胞增殖的抑制的IC50。

HER3单克隆抗体	IC50(95％的置信水平),nM
		Rab46	15.28至42.28
Rab1210	11.92至28.53
		Rab189	31.66至86.07
Rab774	151.2至526.7

实施例8–对抗体可变区的DNA和氨基酸序列进行测序

利用Genewiz(Edison,NJ)对IgG轻链可变区(LV)和重链可变区(HV)进行测序。轻链可变和重链可变氨基酸序列都列于表6中。使用IMGT程序分析轻链和重链的CDR，所述CDR列于表6中。

表6.抗-HER3抗体序列

实施例9-兔HER3单克隆抗体的人源化

使用IMGT数据库(Lafranc等人，2012，通过引用并入本文)鉴定与兔VH和VL最匹配的人VH和VL种系序列。人源化基于CDR移植概念(Haidar等人，2012)，利用Kabat/Chothia的组合(Yu等人，2010和Haidar等人2012(也参见Retter等人，2005和Singer等人，1993))界定兔抗体的CDR。

对于每一种抗-HER3单克隆抗体设计总共2个重链可变序列和2个轻链可变序列：如下面在图表1中显示的Rab46和Rab1210(CDR序列加以下划线)。

图表1：人源化抗体的可变结构域。

＞hRab46H-1

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFSASYYIYWVRQAPGKGLEYIAYITGDDDKRTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCTRNLPDELWGPGTLVTVSS(SEQIDNO：33)

＞hRab46H-2

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFSASYYIYWVRQAPGKGLEYIAYITGDDDKRTYYANWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCTRNLPDELWGPGTLVTVSS(SEQIDNO：34)

＞hRab46L-1

DIQMTQTPSTLSASVGDRVTITCQSSESVYSYKNLAWYQQKPGKPPKLLIWQASRLSSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGTYYSSA WDFVFGGGTKVEIK(SEQIDNO：35)

＞hRab46L-2

QAQMTQTPSTLSASVGDRVTITCQSSESVYSYKNLAWYQQKPGKPPKLLIWQASRLSSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGTYYSS AWDFVFGGGTKVEIK(SEQIDNO：36)

＞hRab1210H-1

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEYIGYIWSGNGATYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARNYDASGYGIFHLWGPGTLVTVSS(SEQIDNO：37)

＞hRab1210H-2

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLELIGYIWSGNGATYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARNYDASGYGIFHLWGPGTLVTVSS(SEQIDNO：38)

＞hRab1210L-1

DIQMTQTPSSLSASVGDRVTINCQASQSIVSSYLSWYQQKPGKPPKLLIYSASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLYGVDSSNID NAFGGGTKVEIK(SEQIDNO：39)

＞hRab1210L-2

AVQMTQTPSSLSASVGDRVTINCQASQSIVSSYLSWYQQKPGKPPKLLIYSASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLYGVDSSNID NAFGGGTKVEIK(SEQIDNO：40)

人源化单克隆抗体的构建和产生

合成来自设计的人源化可变区的DNA序列，并将其克隆进如先前实施例中描述的IgG1表达载体，以用于在HEK293细胞中产生人源化抗体。通过在每一个抗体中重组1条重链和1条轻链产生了总共8个人源化单克隆抗体。每一个人源化抗体的重链和轻链的组合列于下面的表8中。

表8：人源化HER3mAb的重链和轻链可变区

人源化抗体的名称	亲代克隆名称	重链可变序列	轻链可变序列
				HER3-hMab-A9	Rab46	hRab46H-1	hRab46L-1
HER3-hMab-A10	Rab46	hRab46H-2	hRab46L-1
				HER3-hMab-A11	Rab46	hRab46H-1	hRab46L-2
HER3-hMab-A12	Rab46	hRab46H-2	hRab46L-2
				HER3-hMab-A13	Rab1210	hRab1210H-1	hRab1210L-1
HER3-hMab-A14	Rab1210	hRab1210H-2	hRab1210L-1
				HER3-hMab-A15	Rab1210	hRab1210H-1	hRab1210L-2
HER3-hMab-A16	Rab1210	hRab1210H-2	hRab1210L-2

人源化抗-HERS单克隆抗体的表征

通过ELISA测定人源化HER3单克隆抗体对HER3的细胞外结 构域(ECD)的结合：所有单克隆抗体显示与亲代兔单克隆抗体相似的对人HER3ECD的强结合，如图8A中显示的。对于来自亲代Rab46的4个人源化抗体的小组，所有4个抗体保留对小鼠HER3ECD结构域的结合亲和力(图8B)。那些人源化抗体的估计的EC₅₀(浓度产生50％的最大结合能力)列于表9中。

表9：通过ELISA测定的人源化HER3抗体的EC₅₀(μg/ml)。

通过表面等离子体共振(SPR)法测量的人源化HER3抗体的 HER3抗原结合动力学：使用T-100Biacore仪(表10)测定抗体的动力学常数。人源化HER3抗体及其亲代兔/人Fc嵌合体的SPR传感图示于图9中。

表10：人源化HER3抗体的动力学结合常数。

抗体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				A10	1.41E+05	1.69E-04	1.20E-09
A14	2.01E+05	1.74E-04	8.62E-10
				CHI46	1.38E+05	4.58E-04	3.32E-09
CHI1210	5.38E+05	6.44E-04	1.20E-09

人源化HER3单克隆抗体对HER3磷酸化的抑制：如在先前部分中对于兔HER3抗体所描述的，进行HER3信号转导的抑制的测定。如图10中显示的，人源化HER3抗体A10和A14显示与它们的亲代抗体等同的，比它们更好的对HER3磷酸化的抑制。来自浓度滴定曲线图(图10)的估计的pHER3抑制的IC₅₀示于表11中。

表11：人源化HER3抗体对pHER3的抑制的估计的IC_50。

人源化HER3单克隆抗体对癌细胞增殖的抑制：使用与对于利用 兔单克隆抗体的研究所描述方法相同的方法进行癌细胞增殖的抑制。使用两个癌细胞系，一个是乳腺癌细胞系MCF-7，另一个细胞系是前列腺癌细胞系CWR22，并且两个细胞系来自ATCC(美国组织培养中心)。癌细胞增殖的抑制显示与增加的抗体浓度的正相关性，如图11和12中显示的。估计的对癌细胞增殖的抑制的IC₅₀示于表12中。

表5：人源化HER3抗体对癌细胞增殖的抑制的估计的IC₅₀。

*ND，未测定的

***

根据本公开内容，可产生和执行本文中公开的和声明的所有方法而无需过度的实验。虽然本发明的组合物和方法通过优选实施方案进行了描述，但对于本领域普通技术人员很显然的是，可在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下改变本文中描述的方法和方法的步骤或步骤的顺序。更具体地，很显然的是，在化学和生理学上相关的某些试剂可用于替代本文中描述的试剂，同时可获得相同或相似的结果。对于本领域普通技术人员来说是显然的所有此类相似的取代和修改被认为在如通过所附权利要求定义的本发明的精神、范围和概念内。

参考资料

下列参考资料，在它们提供示例性方法或对本文中所示的方法的其它详细补充的程度上，明确地通过引用并入本文。

美国专利申请No.2002/0172677；2004/0126828和20050214860

美国专利No3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,196,265、4,275,149、4,277,437、4,366,241、4,469,797、4,472,509、4,606,855、4,703,003、4,742,159、4,767,720、4,816,567、4,867,973、4,938,948、4,946,778、5,021,236、5,091,513、5,164,296、5,196,066、5,223,409、5,403,484、5,420,253、5,565,332、5,571,698、5,627,052、5,656,434、5,770,376、5,789,208、5,821,337、5,844,091、5,858,657、5,861,155、5,871,907、5,969,108、6,054,297、6,165,464、6,365,157、6,406,867、6,709,659、6,709,873、6,753,407、6,814,965、6,849,259、6,861,572、6,875,434、6,881,557、6,891,024和6,946,546。

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Claims (52)

1.一种分离的单克隆抗体，其中所述抗体特异性结合HER3并且其中所述抗体与Rab46、Rab1210、Rab189或Rab774单克隆抗体竞争对HER3表位的结合。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与Rab46(SEQIDNO:9)、Rab1210(SEQIDNO:15)、Rab189(SEQIDNO:21)或Rab774(SEQIDNO:27)的V_HCDR1具有至少80％同一性的第一V_HCDR；

(b)与Rab46(SEQIDNO:10)、Rab1210(SEQIDNO:16)、Rab189(SEQIDNO:22)或Rab774(SEQIDNO:28)的V_HCDR2具有至少80％同一性的第二V_HCDR；

(c)与Rab46(SEQIDNO:11)、Rab1210(SEQIDNO:17)、Rab189(SEQIDNO:23)或Rab774(SEQIDNO:29)的V_HCDR3具有至少80％同一性的第三V_HCDR；

(d)与Rab46(SEQIDNO:12)、Rab1210(SEQIDNO:18)、Rab189(SEQIDNO:24)或Rab774(SEQIDNO:30)的V_LCDR1具有至少80％同一性的第一V_LCDR；

(e)与Rab46(SEQIDNO:13)、Rab1210(SEQIDNO:19)、Rab189(SEQIDNO:25)或Rab774(SEQIDNO:31)的V_LCDR2具有至少80％同一性的第二V_LCDR；和

(f)与Rab46(SEQIDNO:14)、Rab1210(SEQIDNO:20)、Rab189(SEQIDNO:26)或Rab774(SEQIDNO:32)的V_LCDR3具有至少80％同一性的第三V_LCDR。

3.根据权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQIDNO:9具有至少80％同一性的第一V_HCDR；

(b)与SEQIDNO:10具有至少80％同一性的第二V_HCDR；

(c)与SEQIDNO:11具有至少80％同一性的第三V_HCDR；

(d)与SEQIDNO:12具有至少80％同一性的第一V_LCDR；

(e)与SEQIDNO:13具有至少80％同一性的第二V_LCDR；和

(f)与SEQIDNO:14具有至少80％同一性的第三V_LCDR。

4.根据权利要求3所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)第一V_HCDR与SEQIDNO:9相同；

(b)第二V_HCDR与SEQIDNO:10相同；

(c)第三V_HCDR与SEQIDNO:11相同；

(d)第一V_LCDR与SEQIDNO:12相同；

(e)第二V_LCDR与SEQIDNO:13相同；和

(f)第三V_LCDR与SEQIDNO:14相同。

5.根据权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQIDNO:15具有至少80％同一性的第一V_HCDR；

(b)与SEQIDNO:16具有至少80％同一性的第二V_HCDR；

(c)与SEQIDNO:17具有至少80％同一性的第三V_HCDR；

(d)与SEQIDNO:18具有至少80％同一性的第一V_LCDR；

(e)与SEQIDNO:19具有至少80％同一性的第二V_LCDR；和

(f)与SEQIDNO:20具有至少80％同一性的第三V_LCDR。

6.根据权利要求5所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)第一V_HCDR与SEQIDNO:15相同；

(b)第二V_HCDR与SEQIDNO:16相同；

(c)第三V_HCDR与SEQIDNO:17相同；

(d)第一V_LCDR与SEQIDNO:18相同；

(e)第二V_LCDR与SEQIDNO:19相同；和

(f)第三V_LCDR与SEQIDNO:20相同。

7.根据权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQIDNO:21具有至少80％同一性的第一V_HCDR；

(b)与SEQIDNO:22具有至少80％同一性的第二V_HCDR；

(c)与SEQIDNO:23具有至少80％同一性的第三V_HCDR；

(d)与SEQIDNO:24具有至少80％同一性的第一V_LCDR；

(e)与SEQIDNO:25具有至少80％同一性的第二V_LCDR；和

(f)与SEQIDNO:26具有至少80％同一性的第三V_LCDR。

8.根据权利要求7所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)第一V_HCDR与SEQIDNO:21相同；

(b)第二V_HCDR与SEQIDNO:22相同；

(c)第三V_HCDR与SEQIDNO:23相同；

(d)第一V_LCDR与SEQIDNO:24相同；

(e)第二V_LCDR与SEQIDNO:25相同；和

(f)第三V_LCDR与SEQIDNO:26相同。

9.根据权利要求2所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与SEQIDNO:27具有至少80％同一性的第一V_HCDR；

(b)与SEQIDNO:28具有至少80％同一性的第二V_HCDR；

(c)与SEQIDNO:29具有至少80％同一性的第三V_HCDR；

(d)与SEQIDNO:30具有至少80％同一性的第一V_LCDR；

(e)与SEQIDNO:31具有至少80％同一性的第二V_LCDR；和

(f)与SEQIDNO:32具有至少80％同一性的第三V_LCDR。

10.根据权利要求9所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)第一V_HCDR与SEQIDNO:27相同；

(b)第二V_HCDR与SEQIDNO:28相同；

(c)第三V_HCDR与SEQIDNO:29相同；

(d)第一V_LCDR与SEQIDNO:30相同；

(e)第二V_LCDR与SEQIDNO:31相同；和

(f)第三V_LCDR与SEQIDNO:32相同。

11.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含：

(i)与Rab46(SEQIDNO:1)、hRab46H-1(SEQIDNO:33)或hRab46H-2(SEQIDNO:34)的V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与Rab46(SEQIDNO:2)、hRab46L-1(SEQIDNO:35)或hRab46L-2(SEQIDNO:36)的V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(ii)与Rab1210(SEQIDNO:3)、hRab1210H-1(SEQIDNO:37)或hRab1210H-2(SEQIDNO:38)的V_H结构域具有至少约80％同一性的V_H结构域；和与Rab1210(SEQIDNO:4)、hRab1210L-1(SEQIDNO:39)或hRab1210L-2(SEQIDNO:40)的V_L结构域具有至少约80％同一性的V_L结构域；

(iii)与Rab189的V_H结构域(SEQIDNO:5)具有至少约80％同一性的V_H结构域和与Rab189的V_L结构域(SEQIDNO:6)具有至少约80％同一性的V_L结构域；或

(iv)与Rab774的V_H结构域(SEQIDNO:7)具有至少约80％同一性的V_H结构域和与Rab774的V_L结构域(SEQIDNO:8)具有至少约80％同一性的V_L结构域。

12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含与Rab46的V_H结构域(SEQIDNO:1)相同的V_H结构域和与Rab46的V_L结构域(SEQIDNO:2)相同的V_L结构域。

13.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab46H-1的V_H结构域(SEQIDNO:33)具有至少95％同一性的V_H结构域和与hRab46L-1(SEQIDNO:35)或hRab46L-2(SEQIDNO:36)的V_L结构域具有至少95％同一性的V_L结构域。

14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab46H-1的V_H结构域(SEQIDNO:33)相同的V_H结构域和与hRab46L-1的V_L结构域(SEQIDNO:35)相同的V_L结构域。

15.根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab46H-1的V_H结构域(SEQIDNO:33)相同的V_H结构域和与hRab46L-2的V_L结构域(SEQIDNO:36)相同的V_L结构域。

16.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab46H-2的V_H结构域(SEQIDNO:34)具有至少95％同一性的V_H结构域和与hRab46L-2(SEQIDNO:36)或hRab46L-1(SEQIDNO:35)的V_L结构域具有至少95％同一性的V_L结构域。

17.根据权利要求16所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab46H-2(SEQIDNO:34)的V_H结构域相同的V_H结构域和与hRab46L-2(SEQIDNO:36)的V_L结构域相同的V_L结构域。

18.根据权利要求16所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab46H-2(SEQIDNO:34)的V_H结构域相同的V_H结构域和与hRab46L-1(SEQIDNO:35)的V_L结构域相同的V_L结构域。

19.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含与Rab1210的V_H结构域(SEQIDNO:3)相同的V_H结构域和与Rab1210的V_L结构域(SEQIDNO:4)相同的V_L结构域。

20.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab1210H-1的V_H结构域(SEQIDNO:37)具有至少95％同一性的V_H结构域和与hRab1210L-1(SEQIDNO:39)或hRab1210L-2(SEQIDNO:40)的V_L结构域具有至少95％同一性的V_L结构域。

21.根据权利要求20所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab1210H-1的V_H结构域(SEQIDNO:37)相同的V_H结构域和与hRab1210L-1的V_L结构域(SEQIDNO:39)相同的V_L结构域。

22.根据权利要求20所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab1210H-1的V_H结构域(SEQIDNO:37)相同的V_H结构域和与hRab1210L-2的V_L结构域(SEQIDNO:40)相同的V_L结构域。

23.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab1210H-2的V_H结构域(SEQIDNO:38)具有至少95％同一性的V_H结构域和与hRab1210L-2(SEQIDNO:40)或hRab1210L-1(SEQIDNO:39)的V_L结构域具有至少95％同一性的V_L结构域。

24.根据权利要求23所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab1210H-2的V_H结构域(SEQIDNO:38)相同的V_H结构域和与hRab1210L-2的V_L结构域(SEQIDNO:40)相同的V_L结构域。

25.根据权利要求23所述的抗体，其中所述抗体包含与hRab1210H-2的V_H结构域(SEQIDNO:38)相同的V_H结构域和与hRab1210L-1的V_L结构域(SEQIDNO:39)相同的V_L结构域。

26.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含与Rab189的V_H结构域(SEQIDNO:5)相同的V_H结构域和与Rab189的V_L结构域(SEQIDNO:6)相同的的V_L结构域。

27.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含与Rab774的V_H结构域(SEQIDNO:7)相同的V_H结构域和与Rab774的V_L结构域(SEQIDNO:8)相同的的V_L结构域。

28.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体为Rab46、Rab1210、Rab189、Rab774、HER3-hMab-A9、HER3-hMab-A10、HER3-hMab-A11、HER3-hMab-A12、HER3-hMab-A13、HER3-hMab-A14、HER3-hMab-A15或HER3-hMab-A16抗体。

29.根据权利要求28所述的抗体，其中所述抗体为HER3-hMab-A9、HER3-hMab-A10、HER3-hMab-A11、HER3-hMab-A12、HER3-hMab-A13、HER3-hMab-A14、HER3-hMab-A15或HER3-hMab-A16抗体。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的抗体，其中所述抗体是重组体。

31.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。

32.根据权利要求1-29中任一项所述的抗体，其中所述抗体为Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、双价scFv或单结构域抗体。

33.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或去免疫抗体。

34.根据权利要求1-29中任一项所述的抗体，其中所述抗体可被缀合于成像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素。

35.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的根据权利要求1-29中任一项所述的抗体。

36.一种分离的多核苷酸分子，其包含编码根据权利要求1-29中任一项所述的抗体的核酸序列。

37.一种重组多肽，其包含含有Rab46的V_H结构域的CDR1-3(SEQIDNO:9、10和11)；Rab1210的V_H结构域的CDR1-3(SEQIDNO:15、16和17)；Rab189的V_H结构域的CDR1-3(SEQIDNO:21、22和23)或Rab774的V_H结构域的CDR1-3(SEQIDNO:27、28和29)的抗体V_H结构域。

38.一种重组多肽，其包含含有Rab46(SEQIDNO:12、13和14)、Rab1210(SEQIDNO:18、19和20)、Rab189(SEQIDNO:24、25和26)或Rab774(SEQIDNO:30、31和32)的V_L结构域的CDR1-3的抗体V_L结构域。

39.一种分离的多核苷酸分子，其包含编码根据权利要求37或38所述的多肽的核酸序列。

40.一种宿主细胞，其包含编码根据权利要求1-29中任一项所述的抗体或根据权利要求37或38所述的重组多肽的一种或多种多核苷酸分子。

41.根据权利要求40所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

42.一种制造抗体的方法，其包括：

(a)在细胞中表达一种或多种编码根据权利要求1-29中任一项所述的抗体的V_H或V_L链的多核苷酸分子；和

(b)从所述细胞纯化所述抗体。

43.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-29中任一项所述的抗体。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症可以是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。

45.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗体存在于药学上可接受的组合物中。

46.根据权利要求43所述的方法，其中全身性施用所述抗体。

47.根据权利要求43所述的方法，其中可静脉内、皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用所述抗体。

48.根据权利要求43所述的方法，其还包括向所述受试者施用至少第二抗癌疗法。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。

50.一种用于检测受试者的癌症的方法，其包括测试相对于对照升高的HER3在来自于所述受试者的样品中的存在，其中所述测试包括将所述样品与根据权利要求11-28或34中任一项所述的抗体接触。

51.根据权利要求50所述的方法，其还被定义为体外方法。

52.一种分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a)与Rab46(SEQIDNO:9)、Rab1210(SEQIDNO:15)、Rab189(SEQIDNO:21)或Rab774(SEQIDNO:27)的V_HCDR1具有至少80％同一性的第一V_HCDR；

(b)与Rab46(SEQIDNO:10)、Rab1210(SEQIDNO:16)、Rab189(SEQIDNO:22)或Rab774(SEQIDNO:28)的V_HCDR2具有至少80％同一性的第二V_HCDR；

(c)与Rab46(SEQIDNO:11)、Rab1210(SEQIDNO:17)、Rab189(SEQIDNO:23)或Rab774(SEQIDNO:29)的V_HCDR3具有至少80％同一性的第三V_HCDR；

(d)与Rab46(SEQIDNO:12)、Rab1210(SEQIDNO:18)、Rab189(SEQIDNO:24)或Rab774(SEQIDNO:30)的V_LCDR1具有至少80％同一性的第一V_LCDR；

(e)与Rab46(SEQIDNO:13)、Rab1210(SEQIDNO:19)、Rab189(SEQIDNO:25)或Rab774(SEQIDNO:31)的V_LCDR2具有至少80％同一性的第二V_LCDR；和

(f)与Rab46(SEQIDNO:14)、Rab1210(SEQIDNO:20)、Rab189(SEQIDNO:26)或Rab774(SEQIDNO:32)的V_LCDR3具有至少80％同一性的第三V_LCDR。